一種培育八倍體低地型柳枝稷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物育種領(lǐng)域，具體設(shè)及一種培育八倍體低地型柳枝稷的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 柳枝稷（PanicumvrigatumL)，禾本科泰屬，是多年生草本C4植物，原產(chǎn)于北美 洛基山脈W東、北締55°W南大草原，它植株高大、根系發(fā)達(dá)，通常被用于放牧、水±保持、 生態(tài)建設(shè)W及園林綠化等。由于柳枝稷適應(yīng)性強(qiáng)，具有較高的產(chǎn)量潛力和較強(qiáng)的耐旱耐脊 能力，且木質(zhì)纖維素含量高，是最具發(fā)展?jié)摿Φ哪茉醋魑镏唬诿绹蛔鳛榘l(fā)展纖維素乙 醇的模式能源植物進(jìn)行商業(yè)化開發(fā)和利用。
[0003]柳枝稷于20世紀(jì)80年代被引入我國，已在北京、寧夏、山西、陜西等地開展了多年 試驗(yàn)研究，對(duì)其生態(tài)適應(yīng)性、生態(tài)功能、生物產(chǎn)量、品質(zhì)等進(jìn)行的評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)該植物具有較強(qiáng) 的生態(tài)適應(yīng)性和較高的生物產(chǎn)量，能夠改良±壤，增加±壤有機(jī)碳含量，減少坡地水±及± 壤養(yǎng)分流失，吸收二氧化硫和滯降粉塵等功能，表現(xiàn)出良好的生態(tài)效益和生物質(zhì)生產(chǎn)潛力。 然而作為引種植物，柳枝稷在國內(nèi)種質(zhì)資源非常有限，而且種植品種較為單一，因此，在現(xiàn) 有資源的基礎(chǔ)上進(jìn)行柳枝稷的種質(zhì)創(chuàng)新與品種選育顯得尤為重要。而低地型柳枝稷品種多 為四倍體，八倍體的低地型柳枝稷植株的獲得，將為今后八倍體低地型柳枝稷品種的選育 奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種培育八倍體低地型柳枝稷的方法。 陽〇化]本發(fā)明的一種培育八倍體低地型柳枝稷的方法，包括如下步驟：
[0006] 1)誘導(dǎo)愈傷組織：將四倍體低地型柳枝稷含內(nèi)層巷葉的幼穗小段滅菌消毒后縱 切為兩半，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；
[0007] 2)愈傷組織擴(kuò)繁：切取步驟1)誘導(dǎo)出的愈傷組織，接種到增殖培養(yǎng)基上擴(kuò)繁； [000引3)染色體加倍誘導(dǎo)：將步驟2)得到的愈傷組織接種到秋水仙素液體培養(yǎng)基中誘 導(dǎo)加倍；
[0009] 4)誘導(dǎo)芽分化：將步驟3)中處理后的愈傷組織洗凈，吸干多余水分，接種至分化 培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)芽分化；
[0010] 5)誘導(dǎo)生根：待芽長至1-2厘米后，切下芽，接種到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根； W11] 6)移栽：待幼苗株高6-8厘米、根長2-4厘米厚，煉苗后移栽到基質(zhì)中種植，得到 柳枝稷幼苗；
[0012] 7)倍性鑒定：取步驟6)所得柳枝稷幼苗的葉片，進(jìn)行氣孔和/或流式細(xì)胞術(shù)鑒 定，篩選其中氣孔數(shù)目減少和/或葉片細(xì)胞核DNA含量加倍的幼苗，得到八倍體低地型柳枝 稷。
[0013] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是WMS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，麥芽糖質(zhì)量百分含量3%、2, 4-二 氯苯氧乙酸（2, 4-D)含量5mg/l、6-節(jié)氨基嚷嶺化-BA)含量1. 2mg/l、植物凝膠質(zhì)量百分含 量0.8%、抑值5. 8的培養(yǎng)基。
[0014] 所述增殖培養(yǎng)基是WMS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，麥芽糖質(zhì)量百分含量3%、2, 4-二 氯苯氧乙酸（2, 4-D)含量5mg/l、6-節(jié)氨基嚷嶺化-BA)含量1. 2mg/l、脯氨酸含量2g/L、植 物凝膠質(zhì)量百分含量0. 8%、pH值5. 8的培養(yǎng)基。
[0015] 所述秋水仙素液體培養(yǎng)基是WMS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，麥芽糖質(zhì)量百分含量 3 %、2, 4-二氯苯氧乙酸含量5mg/l、6-節(jié)氨基嚷嶺含量1. 2mg/l、甘露醇含量20g/l、秋水仙 素質(zhì)量百分含量0. 08% -0. 12%、pH值5. 8的液體培養(yǎng)基。
[0016] 其中，所述染色體加倍誘導(dǎo)，為在秋水仙素液體培養(yǎng)基中W轉(zhuǎn)速為12化pm/min的 震蕩處理48-96小時(shí)。
[0017] 所述分化培養(yǎng)基是WMS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，麥芽糖質(zhì)量百分含量3%、赤霉素 (GA3)含量0. 5111邑/1、植物凝膠質(zhì)量百分含量0. 8%、抑值5. 8的培養(yǎng)基。
[0018] 所述生根培養(yǎng)基是W1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，植物凝膠質(zhì)量百分含量0. 6%、 抑值5. 8的培養(yǎng)基。
[0019] 其中，步驟1)所述含內(nèi)層巷葉的幼穗小段，其獲得過程如下：在孕穗期，取柳枝稷 含巷未成熟幼穗，剝?nèi)ネ鈱酉锶~和葉銷，將含內(nèi)層巷葉的幼穗切成1. 8-2. 2厘米小段，得到 含內(nèi)層巷葉的幼穗小段。
[0020] 其中，步驟1)所述滅菌消毒，具體方法為：W體積百分含量75%的乙醇表面消毒 30秒，無菌水沖洗2次，體積百分含量20 %的化ClO浸泡10分鐘，無菌水沖洗3~4次，吸 干表面水分。
[0021] 其中，所述誘導(dǎo)愈傷組織，初代培養(yǎng)時(shí)間為10天，之后每2周繼代一次。所述誘導(dǎo) 愈傷組織，共培養(yǎng)4周-6周。
[0022] 其中，所述愈傷組織擴(kuò)繁，2周繼代一次。所述愈傷組織擴(kuò)繁，共培養(yǎng)培養(yǎng)8周-10 周。
[0023] 其中，所述誘導(dǎo)愈傷組織、愈傷組織擴(kuò)繁、染色體加倍誘導(dǎo)，其環(huán)境條件為黑暗條 件下進(jìn)行，溫度為25±2°C。
[0024]其中，所述誘導(dǎo)芽分化、誘導(dǎo)生根，其環(huán)境條件為溫度25±2°C，光照時(shí)間16小時(shí)/ 天，光照強(qiáng)度1500-2000lx。
[00巧]其中，所述煉苗，為開瓶煉苗1-2天，環(huán)境條件為溫度25±2°C，光照時(shí)間16小時(shí)/ 天，光照強(qiáng)度1500-2000lx。
[00%] 其中，所述移栽，為洗去根部培養(yǎng)基，移栽入花± :珍珠巖體積比為1 :1的基質(zhì)中， 在大棚或溫室內(nèi)培養(yǎng)。
[0027] 本發(fā)明還提供所述的培育八倍體低地型柳枝稷的方法，在柳枝稷育種中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0029] 本發(fā)明八倍體低地型柳枝稷的方法成熟、穩(wěn)定，本發(fā)明的柳枝稷的再生培養(yǎng)技術(shù) 體系較為成熟，W柳枝稷的幼穗為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，其再生率高；W秋水仙素處理柳枝 稷愈傷組織進(jìn)行染色體加倍誘導(dǎo)，其加倍效果穩(wěn)定，嵌合體植株少。
【附圖說明】
[0030] 圖1是實(shí)施例1中柳枝稷品種Alamo經(jīng)本發(fā)明的方法培育后的植株葉片氣孔光學(xué) 顯微鏡照片；其中左側(cè)為四倍體（對(duì)照），右側(cè)為八倍體。
[0031]圖2是實(shí)施例1中柳枝稷品種Alamo經(jīng)本發(fā)明的方法培育后的流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié) 果；其中左側(cè)為四倍體（對(duì)照），右側(cè)為八倍體。
[0032]圖3是實(shí)施例2中柳枝稷品種Kanlow經(jīng)本發(fā)明的方法培育后的植株葉片氣孔光 學(xué)顯微鏡照片；其中左側(cè)為四倍體（對(duì)照），右側(cè)為八倍體。
[0033] 圖4是實(shí)施例2中柳枝稷品種Kanlow經(jīng)本發(fā)明的方法培育后的流式細(xì)胞術(shù)鑒定 結(jié)果；其中左側(cè)為四倍體（對(duì)照），右側(cè)為八倍體。
【具體實(shí)施方式】
[0034]W下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。 陽0對(duì) 實(shí)施例1
[0036]W四倍體低地型柳枝稷品種Alamo為研究對(duì)象，在孕穗期，剪取生長健壯的柳枝 稷含巷未成熟幼穗，剝?nèi)ネ鈱酉锶~和葉銷，將含內(nèi)層巷葉的幼穗切成1. 8-2. 2厘米小段，得 到含內(nèi)層巷葉的幼穗小段。于超凈工作臺(tái)上，先用體積百分含量75%的乙醇進(jìn)行表面消毒 30秒，無菌蒸饋水沖洗2次后，再用體積百分含量20 %化ClO滅菌10分鐘，最后用無菌蒸 饋水洗涂3-4次，放置在滅菌濾紙上，吸干表面水分。
[0037] 1):將滅菌的含內(nèi)層巷葉的幼穗小段縱切成兩半，然后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS 基本培養(yǎng)基+3%麥芽糖巧111邑/12,4-0+1.2111邑/16-84+0.8%植物凝膠，抑值5.8)中，于 25±2°C黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織，10天后繼代，W后2周繼代一次，培養(yǎng)4周；
[0038] 2):將步驟1)中生長良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基+3%麥 芽糖巧mg/L2, 4-D+1. 2mg/L6-BA+2g/L脯氨酸 +0. 8%植物凝膠，抑值 5. 8)中，于 25±2°C 黑暗條件下進(jìn)行愈傷組織擴(kuò)繁，2周繼代一次，培養(yǎng)10周；
[0039] 3):將步驟2)中擴(kuò)繁的愈傷組織分別轉(zhuǎn)接至秋水仙素質(zhì)量百分含量0-0. 12%的 秋水仙素液體培養(yǎng)基中（所述秋水仙素液體培養(yǎng)基是WMS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，麥芽糖質(zhì) 量百分含量3%、2, 4-二氯苯氧乙酸含量5mg/l、6-節(jié)氨基嚷嶺含量1. 2mg/l、甘露醇含量 20g/^、秋水仙素質(zhì)量百分含量0-0.12%、pH值5.8的液體培養(yǎng)基。），于溫度25±2°C黑暗 條件震蕩處理72小時(shí)，轉(zhuǎn)速為12化pm/min。 W40] 4):將步驟如中處理完畢的愈傷組織分別用無菌水反復(fù)沖洗2-3次，然后用無菌 濾紙將水吸干，再轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基曲5基本培養(yǎng)基+3%麥芽糖+0.5111肖/1643+0.8%植物