一種劍葉龍血樹疏松愈傷組織誘導的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物疏松愈傷組織誘導方法，特別是一種劍葉龍血樹的疏松愈傷組織誘導方法。
【背景技術(shù)】
[0002]劍葉龍血樹（Dracaena cochinchinensis (Lour) S. C. Chen)又名千年木、血竭樹、交趾龍血樹，是漸危種，屬國家二級保護植物。劍葉龍血樹具有很高的藥用價值，從其樹脂提取的血竭被稱為麒麟竭，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，在我國已有1500年以上的使用歷史。據(jù)《本草綱目》記載，龍血竭性溫、平，味甘、咸，無毒，入血分，歸肺、脾、腎三經(jīng)，具有活血化瘀、消腫止痛、收斂止血，軟堅散結(jié)，生肌斂瘡等顯著功效，有“活血圣藥”的美譽，主要分布云南、廣西、海南等地。
[0003] 近年來，由于其需求量大再加上高昂的價格致使人們對劍葉龍血樹野生資源實施了不合理的掠奪性采伐，劍葉龍血樹野生資源日趨枯竭，瀕臨滅絕，已經(jīng)被國際上很多國家列為珍稀瀕危保護植物。因此利用生物技術(shù)對其進行組培快繁尤為重要。對劍葉龍血樹的研究主要在藥物化學成分、組織培養(yǎng)等方面的研究，目前尚未有細胞懸浮培養(yǎng)方面研究的報道。疏松愈傷組織容易散碎，增殖能力旺盛，經(jīng)過長期繼代保存而不喪失胚性，有利于愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系，并且在需要時能從中分離出全能性的原生質(zhì)體。通過探究不同激素對劍葉龍血樹愈傷組織的影響，篩選出快速生長、疏松型愈傷組織的最佳激素配比，為進行細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)劍葉龍血樹總生物堿提供材料，為保護和合理開發(fā)劍葉龍血樹提供技術(shù)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種劍葉龍血樹的疏松愈傷組織誘導的方法，它能夠短時間產(chǎn)生增殖能力旺盛的疏松愈傷組織、為進行細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)劍葉龍血樹總生物堿提供材料。
[0005] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達到上述目的：一種劍葉龍血樹的疏松愈傷組織誘導的方法，包括以下步驟：
[0006](1)外植體的消毒：先用洗潔精水溶液清洗外植體表面污垢，置于燒杯中進行流水沖洗5?8min，然后移至超凈工作臺上，用75v/v%酒精將種子和芽浸泡30s，無菌水沖洗1遍，再用0. lv/v% HgCl2浸泡，時間分別為8、12、15min，無菌水浸泡3次，用無菌濾紙吸干外植體表面水分后進行接種，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；所述外植體為飽滿種子或種子播種于河沙里萌發(fā)的芽；
[0007](2)無菌苗的獲得：將步驟⑴得到的外植體接種于MS誘導培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度20?30 ymol/m2 · s，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)8?15d便開始出芽，隨后長出無菌苗，所述MS誘導培養(yǎng)基中添加0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、〇. lmg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ;
[0008](3)培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導效果：將步驟（2)中得到的無菌苗接種于MS、B5、N6三種基本培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度20?30 μ mol/m2 *s，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)25?30d，逐漸產(chǎn)生疏松愈傷組織，所述MS、B5、N6三種基本培養(yǎng)基中分別添加0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. 2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0009](4)培養(yǎng)基對愈傷組織的繼代效果：將步驟（3)中得到的愈傷組織置于MS繼代培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25±2°C，光照強度20?30 ymol/m2 · s，光照時間為10h/d的條件下培養(yǎng)10d，切口端逐漸膨大，形成較多疏松的愈傷組織，所述MS繼代培養(yǎng)基中添加0. 1?2. Omg/L的6-芐基腺嘌呤6-ΒΑ、0· 5?3. Omg/L的2, 4-二氯苯氧乙酸2, 4-D，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8。
[〇〇1〇]本發(fā)明的突出優(yōu)點在于：
[0011](1)通過取劍葉龍血樹種子或芽進行愈傷組織誘導，能夠在短時間內(nèi)培育出大量長勢良好的劍葉龍血樹疏松愈傷組織，為劍葉龍血樹建立懸浮系提供優(yōu)良材料。
[0012](2)本發(fā)明涉及升汞、酒精，MS、B5、N6基本培養(yǎng)基和6-芐基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和2, 4-二氯苯氧乙酸2, 4-D。MS具有較高的無機鹽濃度，能夠提供組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)，從而加速愈傷組織的生長。B5培養(yǎng)基的主要特點是含有較低的銨，銨這一營養(yǎng)成分對培養(yǎng)基有抑制生長的作用。N6培養(yǎng)基特點是謂03和（順4)#04含量高。
[0013](3)所用消毒劑、激素等化學藥品價格低廉，試驗成本低。
[0014](4)采用本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法得到的劍葉龍血樹愈傷組織培養(yǎng)40d誘導率達85%以上，產(chǎn)生的愈傷組織生長快，大部分為嫩綠色、乳白色顆粒狀的疏松型愈傷組織。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進一步說明。
[0016]實施例1
[0017]本發(fā)明所述的劍葉龍血樹的疏松愈傷組織誘導的方法的一個實例，包括如下步驟：
[0018](1)外植體的消毒：先用洗潔精水溶液清洗外植體表面污垢，置于燒杯中進行流水沖洗5?8min，然后移至超凈工作臺上，用75v/v%酒精將種子和芽浸泡30s，無菌水沖洗1遍，再用0. lv/v% HgCl2浸泡，時間分別為8、12、15min，無菌水浸泡3次。用無菌濾紙吸干外植體表面水分后進行接種，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；所述外植體為飽滿種子或種子播種于河沙里萌發(fā)的芽；
_9](2)無菌苗的獲得：將步驟⑴得到的外植體分別接種于MS誘導培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度20?30 μ mol/m2 · s，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)8?15d，便開始出芽，隨后長出無菌苗。所述MS誘導培養(yǎng)基中還加入0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. lmg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ;
[0020](3)培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導效果：將步驟（2)中得到的無菌苗分別接種于MS、
B5、N6三種基本培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)25?30d，逐漸產(chǎn)生疏松愈傷組織。所述MS、B5、N6基本培養(yǎng)基中還加入0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. 2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ;MS、B5、N6三種基本培養(yǎng)基愈傷組織誘導率分別為為62. 9%、57. 1%、51. 4%，MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織生長旺盛、結(jié)構(gòu)疏松，其次為B5培養(yǎng)基，以N6為培養(yǎng)基愈傷組織誘導率最低，顏色淺黃、愈傷組織質(zhì)地緊密，褐化率最高；
[0021](4)培養(yǎng)基對愈傷組織的繼代效果：將步驟（3)中得到的愈傷組織置于MS繼代培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度20?30 ymol/m2 · s，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)10d后，切口端逐漸膨大，形成較多疏松的愈傷組織，所述MS繼代培養(yǎng)基中還加入0· 1?2. Omg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. 5mg/L的2, 4-二氯苯氧乙酸2, 4-D，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8,愈傷組織誘導率最高為77. 1 %，顏色淡黃或淺綠色，結(jié)構(gòu)疏松。
[0022]實施例2
[0023](1)外植體的消毒：先用洗潔精水溶液清洗外植體表面污垢，置于燒杯中進行流水沖洗5?8min，然后移至超凈工作臺上，用75v/v%酒精將種子和芽浸泡30s，無菌水沖洗1遍，再用0. lv/v% HgCl2浸泡，時間分別為8、12、15min，無菌水浸泡3次。用無菌濾紙吸干外植體表面水分后進行接種，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；所述外植體為飽滿種子或種子播種于河沙里萌發(fā)的芽；
[0024](2)無菌苗的獲得：將步驟（1)得到的外植體分別接種于MS誘導培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度20?30 μ mol/m2 · s，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)8?15d便開始出芽，隨后長出無菌苗。所述外植體誘導培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. lmg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊月旨，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0025](3)培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導效果：將步驟（2)中得到的無菌芽為外植體接種于MS基本培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強度20?30 μ mol/m2 · s，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)，25?30d逐漸產(chǎn)生疏松愈傷組織。所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基分別為MS基本培養(yǎng)基，還加入0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. 2mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ;
[0026](4)培養(yǎng)基對愈傷組織的繼代效果：將步驟（3)中得到的愈傷組織置于MS繼代培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25±2°C，光照強度20?30 μ mol/m2 *s，光照時間為10h/d的條件下培養(yǎng)，接種10d后，切口端逐漸膨大，形成較多疏松的愈傷組織，所述愈傷組織繼代培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. lmg/L的2, 4-二氯苯氧乙酸2, 4-D，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5. 8,愈傷組織誘導率為65. 7%，顏色淺綠色，結(jié)構(gòu)緊密。
[0027]實施例3
[0028](1)外植體的消毒：先用洗潔精水溶液清洗外植體表面污垢，置于燒杯中進行流水沖洗5?8min，然后移至超凈工作臺上，用75v/v%酒精將種子和芽浸泡30s，無菌水沖洗1遍，再用0. lv/v% HgCl2浸泡，時間分別為8、12、15min，無菌水浸泡3次。用無菌濾紙吸干外植體表面水分后進行接種，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；所述外植體為飽滿種子或種子播種于河沙里萌發(fā)的芽；
[0029](2)無菌苗的獲得：將步驟（1)得到的外植體分別接種于MS誘導培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25 ±2°C，光照強度20?30 μ mol/m2 · s，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)8?15d便開始出芽，隨后長出無菌苗。所述外植體誘導培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入0. 5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0. lmg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊月旨，培養(yǎng)基的pH值為5