一種紅麻根結(jié)線蟲分離鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種紅麻根結(jié)線蟲分離鑒定方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]紅麻(kenaf)為錦葵科木槿屬一年生纖維作物，是世界上僅次于棉花的第二大天然纖維作物之一，廣泛栽培于印度、孟加拉、中國(guó)、泰國(guó)等國(guó)家。紅麻纖維具有產(chǎn)量高、吸濕性強(qiáng)、散熱性好、易降解等優(yōu)良特性，因此引起了世界各國(guó)的重視。近年來，其作為造紙、紡織及生物質(zhì)能、麻塑、麻碳的優(yōu)良原料而備受企業(yè)關(guān)注。
[0003]隨著研究的不斷深入，紅麻被廣泛應(yīng)用于紡織、建筑、家居、汽車工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域。為了滿足人們對(duì)于天然纖維需求的增長(zhǎng)，紅麻的種植面積也在逐年遞增，但是由于旱作物和人為重茬，以及育種單位很少涉及抗根結(jié)線蟲病的育種選擇，使得紅麻根結(jié)線蟲病害逐漸加重，降低了紅麻的產(chǎn)量與纖維品質(zhì)。紅麻根結(jié)線蟲病成為了影響我國(guó)紅麻生產(chǎn)的主要病害，它在全國(guó)麻區(qū)普遍發(fā)生，尤其在溫暖濕潤(rùn)的地區(qū)發(fā)病尤為嚴(yán)重。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲主要危害紅麻根部，形成根結(jié)、根瘤，進(jìn)而直接影響到紅麻的產(chǎn)量與品質(zhì)，成為國(guó)內(nèi)外紅麻生產(chǎn)推廣的一大瓶頸。本技術(shù)方法通過對(duì)紅麻根結(jié)線蟲不同種群進(jìn)行分離、純化和鑒定，可以明確紅麻根結(jié)線蟲的形態(tài)和種類，從而為紅麻根結(jié)線蟲病的研究與防治提供理論依據(jù)和科學(xué)的技術(shù)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于對(duì)生產(chǎn)上根結(jié)線蟲發(fā)生動(dòng)態(tài)變化提供一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的紅麻根結(jié)線蟲分離鑒定方法。對(duì)紅麻根結(jié)線蟲進(jìn)行分離、純化和鑒定并提供后續(xù)防控利用，提供鑒定和明確紅麻根結(jié)線蟲的形態(tài)、性質(zhì)和種類，為紅麻根結(jié)線蟲的研究和防治提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)紅麻抗病蟲新品種的選育和紅麻生產(chǎn)水平的提高具有重要意義。本發(fā)明集紅麻根結(jié)線蟲分離、純化和鑒定為一體，分離的病蟲純度高，可為紅麻根結(jié)線蟲的分離鑒定提供效率高、準(zhǔn)確性強(qiáng)的技術(shù)方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種紅麻根結(jié)線蟲分離鑒定方法，所述的黃紅麻根結(jié)線蟲分離鑒定方法具有分離的病蟲純度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、效率高等優(yōu)點(diǎn)，可用于紅麻田間根結(jié)線蟲病樣本的及時(shí)分離鑒定和后續(xù)防控應(yīng)用。技術(shù)流程由取樣、培養(yǎng)純化、會(huì)陰花紋形態(tài)觀察、同工酶電泳分析和線粒體DNA擴(kuò)增而成。
[0006]所述的一種紅麻根結(jié)線蟲分離鑒定方法按如下步驟進(jìn)行:
(I)形態(tài)學(xué)鑒定:選取典型紅麻根結(jié)線蟲病病株，采用五點(diǎn)取樣法采集寄主根系及周圍5-20cm深的耕作層土壤500g。溫室條件下將病根和病土接種到預(yù)先用滅菌土培植45d的盆栽番茄上進(jìn)行純化培養(yǎng)；在體視顯微鏡下，用解剖針從接種發(fā)病的番茄根中，挑取雌蟲和卵塊，將卵塊放于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中孵化4-5d即可得到根結(jié)線蟲，用貝曼漏斗法分離土壤中的雄蟲；獲得蟲體后，制作線蟲玻片進(jìn)行會(huì)陰花紋的形態(tài)鑒定； (2)同工酶分析鑒定:運(yùn)用常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)純化的根結(jié)線蟲樣本進(jìn)行酯酶和蘋果酸脫氫酶電泳分析。挑取20頭雌蟲于1.5 ml離心管中研磨提取酶樣品，取20 yL樣品加入聚丙烯酰胺膠孔中，以爪哇根結(jié)線蟲為對(duì)照進(jìn)行電泳(60V 1.5h; 80V
3.0h)。待電泳結(jié)束后，取出膠片，用蒸餾水清洗兩次，加入MDH染色液于暗室內(nèi)進(jìn)行蘋果酸脫氫酶染色20 min，用蒸餾水漂洗后加入酯酶染色液(EST染色液)，于37°C水浴30 min，完全顯色后用蒸餾水漂洗3次，于固定液中固定2 h后，用蒸餾水漂洗，拍照；
(3)分子生物學(xué)鑒定:分別以純化后的根結(jié)線蟲種群為樣本，采用SDS法提取其DNA，以引物 5-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3 和 5-TACCTTTGACCAATCACGCT-3 進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增其位于線粒體DNA中的COll基因和IrRNA基因。反應(yīng)體系為:0.25 yL Taq，2.5 yL 10 X Buffer,2 μ L dNTP Mixture,引物各I μ L，1.0 ng模板，加水至25 μ L0擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性 I min，51°C退火 I min，72°C延伸 2 min, 35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10 min。電泳、回收純化并測(cè)序，然后將序列進(jìn)行比對(duì)分析鑒定。
[0007]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn):與其它病蟲分離方法相比，本發(fā)明提供的方法具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):集紅麻根結(jié)線蟲分離、純化與鑒定為一體，分離病蟲的效率高、準(zhǔn)確性強(qiáng)；弱化了紅麻根結(jié)線蟲中其他病蟲的干擾，分離病蟲的純度高，操作程序十分簡(jiǎn)便；適用于紅麻田間根結(jié)線蟲病樣本的及時(shí)分離，保持了病蟲野生型特性。總之，本發(fā)明提供的方法具有操作簡(jiǎn)單、效率高、準(zhǔn)確性強(qiáng)等科學(xué)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，是紅麻根結(jié)線蟲準(zhǔn)確分離、純化和鑒定的有效方法，在紅麻根結(jié)線蟲的分離鑒定研究上具有重要的應(yīng)用價(jià)值和科學(xué)意義。
【附圖說明】
[0008]圖1:根結(jié)線蟲雌蟲會(huì)陰花紋圖。A南方根結(jié)線蟲，B象耳豆根結(jié)線蟲，C爪哇根結(jié)線蟲，D花生根結(jié)線蟲。
[0009]圖2酯酶和蘋果酸脫氫酶電泳分析。A圖:15為對(duì)照爪哇根結(jié)線蟲；1為象耳豆根結(jié)線蟲；7和9為爪哇根結(jié)線蟲，其余為南方根結(jié)線蟲；B圖:I為對(duì)照爪哇根結(jié)線蟲；3和10為象耳豆根結(jié)線蟲；8為爪哇根結(jié)線蟲；其余為南方根結(jié)線蟲。
[0010]圖3mtDNA序列擴(kuò)增。M為maker ;I和2為爪唾根結(jié)線蟲(1.7kb) ;3為象耳豆根結(jié)線蟲(0.7kb) ;4和6為南方根結(jié)線蟲(1.7kb) ;5為花生根結(jié)線蟲(1.1kb)ο
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，其目的僅在于更好理解本發(fā)明的內(nèi)容，而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍:
實(shí)施例1:
(1)形態(tài)學(xué)鑒定:選取典型紅麻根結(jié)線蟲病病株，采用五點(diǎn)取樣法采集寄主根系及周圍5-20cm深的耕作層土壤約500g。溫室條件下將病根和病土接種到預(yù)先用滅菌土培植45d的盆栽番茄上進(jìn)行純化培養(yǎng)；在體視顯微鏡下，用解剖針從接種發(fā)病的番茄根中，挑取雌蟲和卵塊，將卵塊放于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中孵化4-5d即可得到J2，用貝曼漏斗法分離土壤中的雄蟲；獲得蟲體后，制作線蟲玻片進(jìn)行會(huì)陰花紋的形態(tài)觀察。如圖1所示:A，B，C，D分別為南方根結(jié)線蟲，象耳豆根結(jié)線蟲，爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲的會(huì)陰花紋圖；
(2)同工酶分析鑒定:運(yùn)用常規(guī)聚丙烯酞胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)純化的根結(jié)線蟲樣本進(jìn)行酯酶和蘋果酸脫氫酶電泳分析。挑取20頭雌蟲于1.5 ml離心管中研磨提取酶樣品，取20yL樣品加入聚丙烯酰胺膠孔中，以爪哇根結(jié)線蟲為對(duì)照進(jìn)行電泳(60 V 1.5 h; 80 V 3.0h)o待電泳結(jié)束后，取出膠片，用蒸餾水清洗兩次，加入MDH染色液于暗室內(nèi)進(jìn)行蘋果酸脫氫酶染色20 min，用蒸饋水漂洗后加入EST染色液，于37°C水浴30 min，完全顯色后用蒸餾水漂洗3次，于固定液中固定2 h后，用蒸餾水漂洗，拍照。如圖2所示:A圖是以15號(hào)爪哇根結(jié)線蟲為對(duì)照^MDH帶型可以判定I號(hào)為象耳豆根結(jié)線蟲；7號(hào)、9號(hào)的MDH和EST帶型與對(duì)照組相似，判定為爪哇根結(jié)線蟲；其余一致的判定為南方根結(jié)線蟲。B圖以I號(hào)爪哇根結(jié)線蟲為對(duì)照；判定3號(hào)、10號(hào)為象耳豆根結(jié)線蟲；8號(hào)為爪哇根結(jié)線蟲；其余為南方根結(jié)線蟲。
[0012](3)分子生物學(xué)鑒定:分別以純化后的根結(jié)線蟲種群為樣本，提取其DNA，以引物5-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3 和 5-TACCTTTGACCAATCACGCT-3 進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增其位于線粒體DNA中的COll基因和IrRNA基因。反應(yīng)體系為:0.25 μ L Taq, 2.5 yL 10 X Buffer,2 μ L dNTP Mixture,引物各I μ L，1.0 ng模板，加水至25 μ L0擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性 I min，51°C退火 I min，72°C延伸 2 min, 35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10 min。電泳、回收純化并測(cè)序，然后將序列進(jìn)行比對(duì)分析鑒定。如圖3所示:以I號(hào)爪哇根結(jié)線蟲為對(duì)照，從條帶大小可以看出2，4，6號(hào)與I號(hào)大小相似(1.7kb)，初步判定為爪哇根結(jié)線蟲；3號(hào)(0.7kb)，5號(hào)(1.1kb)各為一組。經(jīng)測(cè)序后，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列比較后，判定1、2號(hào)為爪哇根結(jié)線蟲；3號(hào)為象耳豆根結(jié)線蟲；4、6號(hào)為南方根結(jié)線蟲；5號(hào)為花生根結(jié)線蟲。
[0013]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種紅麻根結(jié)線蟲分離鑒定方法，其特征在于:所述方法包括形態(tài)學(xué)鑒定、同工酶分析鑒定、分子生物學(xué)鑒定。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅麻根結(jié)線蟲分離鑒定方法，其特征在于:該方法按如下步驟進(jìn)行: (1)形態(tài)學(xué)鑒定:選取典型紅麻根結(jié)線蟲病病株，采用五點(diǎn)取樣法采集寄主根系及周圍5-20cm深的耕作層土壤500g，溫室條件下將病根和病土接種到預(yù)先用滅菌土培植45d的盆栽番茄上進(jìn)行純化培養(yǎng)；在體視顯微鏡下，用解剖針從接種發(fā)病的番茄根中，挑取雌蟲和卵塊，將卵塊放于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中孵化4-5d即可得到根結(jié)線蟲，用貝曼漏斗法分離土壤中的雄蟲；獲得蟲體后，制作線蟲玻片進(jìn)行會(huì)陰花紋的形態(tài)鑒定； (2)同工酶分析鑒定:運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)純化的根結(jié)線蟲樣本進(jìn)行酯酶和蘋果酸脫氫酶電泳分析； (3)分子生物學(xué)鑒定:以純化后的不同根結(jié)線蟲種群為樣本，提取其DNA，以引物5-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3 和 5-TACCTTTGACCAATCACGCT-3 進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增其位于線粒體DNA中的COll基因和IrRNA基因，將序列進(jìn)行比對(duì)分析鑒定。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種紅麻根結(jié)線蟲分離鑒定方法，其特征在于:步驟(2)具體方法為:挑取20頭雌蟲于1.5 ml離心管中研磨提取酶樣品，取20 μ L樣品加入聚丙烯酰胺膠孔中，以爪哇根結(jié)線蟲樣品為對(duì)照進(jìn)行電泳，待電泳結(jié)束后，取出膠片，用蒸餾水清洗兩次，加入MDH染色液于暗室內(nèi)進(jìn)行蘋果酸脫氫酶染色20 min，用蒸饋水漂洗后加入酯酶染色液，于37°C水浴30 min，完全顯色后用蒸餾水漂洗3次，于固定液中固定2 h后，用蒸餾水漂洗，拍照。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種紅麻根結(jié)線蟲分離鑒定方法，其特征在于:步驟(3)中PCR 反應(yīng)體系為:0.25 μ L Taq, 2.5 yL 10 X Buffer, 2 yL dNTP Mixture,引物各 I μ L，1.0 ng模板，加水至25yL，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5 min，94°C變性I min，51°C退火Imin，72°C延伸 2 min, 35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10 min。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種紅麻根結(jié)線蟲分離鑒定方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：（1）經(jīng)典形態(tài)學(xué)鑒定；（2）同工酶分析鑒定：（3）分子生物學(xué)鑒定：以引物5-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3和5-TACCTTTGACCAATCACGCT-3進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增其位于線粒體DNA中的COll基因和lrRNA基因，將序列進(jìn)行比對(duì)分析鑒定。進(jìn)而明確根結(jié)線蟲的生理小種。本發(fā)明集分離、純化、鑒定為一體，采用“形態(tài)學(xué)+同工酶+分子生物學(xué)”相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定與驗(yàn)證，結(jié)果表明分子生物學(xué)鑒定具有效率高、準(zhǔn)確性強(qiáng)，適用于田間采樣的快速分離，鑒定出蟲體野生型種群或生理小種的生物學(xué)特性。
【IPC分類】C12Q1/68, A01K67/033, C12Q1/32, C12Q1/44
【公開號(hào)】CN105145491
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510537124
【發(fā)明人】牛小平, 祁建明, 陳綿才, 王會(huì)芳, 徐建堂, 陶愛芬, 林荔輝
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年8月28日