一種長葉點地梅組織培養(yǎng)快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種長葉點地梅組織培養(yǎng)快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002]長葉點地梅(Jfli/msace 1ngifolia)是報春花科點地梅屬的一種草本植物，其植株矮小、單朵花雖小，但花色清新，具有較好的耐踐踏性是，是一種難得的早春花卉，具有很高的觀賞價值。長葉點地梅還具較高的藥用價值，其富含黃酮類、三萜類化合物，具有抑制癌細胞增長的藥理作用。
[0003]目前，長葉點地梅具有觀賞和藥用雙重功能，但對其的相關(guān)研究鮮有報道，其一直處于野生狀態(tài)。隨著我國的自然生態(tài)環(huán)境逐漸遭到破壞甚至惡化，生長在野外的長葉點地梅資源也受到了不同程度的破壞，因此急需建立長葉點地梅離體快繁技術(shù)體系，以達到保存其種質(zhì)資源的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供出一種長葉點地梅組織培養(yǎng)快繁方法，本發(fā)明以長葉點地梅種子為外植體，經(jīng)過愈傷組織誘導、不定芽誘導、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等步驟建立長葉點地梅組織培養(yǎng)快繁體系，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種長葉點地梅組織培養(yǎng)快繁方法，包括以下的步驟:
(I)種子萌發(fā):將野外采集的野生長葉點地梅種子先用洗衣粉水沖洗I?3h，然后于超凈工作臺中，剝開外種皮，先用75%乙醇消毒5?30s后用無菌水洗3?5次,再用I?5%次氯酸鈉溶液消毒10?25min，用無菌水沖洗4?6次后放于無菌培養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿底層鋪一層薄的脫脂棉，再在脫脂棉上覆蓋濾紙后滅菌)的濾紙上，加入適量無菌水，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為1500?30001x，直至種子萌發(fā)，期間定期向培養(yǎng)皿中加入適量無菌水，以保證脫脂棉和濾紙濕潤。
[0006](2)愈傷組織誘導:將步驟(I)得到的剛萌發(fā)的高約Icm的實生苗下胚軸切下并接種到誘導培養(yǎng)基上，先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)30?45天，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為1500?30001x，直至誘導形成胚性愈傷組織。
[0007](3)分化培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)獲得的呈綠色的子葉愈傷組織切成0.5cm3大小的小塊轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)7?14天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為3000?50001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成不定芽。
[0008](4)生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為2.5?3.5cm的不定芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)7?14天，然后置于每天光照14?16小時，光照強度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)至生根。
[0009](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約6?8cm的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由營養(yǎng)土:沙土 = 2:1混合成的基質(zhì)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天以1/4MS大量元素營養(yǎng)液給幼苗澆水，保持濕度。待幼苗成活后再移栽大田。
[0010]上述步驟(2 )所述的誘導培養(yǎng)基為:MS+0.1?0.6mg/L6-BA+0.1?0.5mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0011]上述步驟(3 )所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.0I?0.lmg/LTDZ+0.1?0.5mg/LKT+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(4)所述的生根培養(yǎng)基為:MS+1?5mg/L IBA+15?30g/L蔗糖+3.5?
6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點是:本發(fā)明通過無性快繁技術(shù)快速獲得大量種苗的方法。以長葉點地梅種子為外植體，經(jīng)過愈傷組織誘導、不定芽誘導、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等步驟建立長葉點地梅組織培養(yǎng)快繁體系，為今后通過多倍體育種、轉(zhuǎn)基因等方法培育出花大、色艷、觀賞價值高的長葉點地梅新品種提供參考。
【具體實施方式】
[0014]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0015]實施例1:
(O種子萌發(fā):將野外采集的野生長葉點地梅種子先用洗衣粉水沖洗lh，然后于超凈工作臺中，剝開外種皮，先用75%乙醇消毒5s后用無菌水洗3次，再用2%次氯酸鈉溶液消毒lOmin，用無菌水沖洗4次后放于無菌培養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿底層鋪一層薄的脫脂棉，再在脫脂棉上覆蓋濾紙后滅菌)的濾紙上，加入適量無菌水，然后置于每天光照10小時，光照強度為15001x，直至種子萌發(fā)，期間定期向培養(yǎng)皿中加入適量無菌水，以保證脫脂棉和濾紙濕潤，種子萌發(fā)率可達95%以上。
[0016](2)愈傷組織誘導:將步驟(I)得到的剛萌發(fā)的高約Icm的實生苗下胚軸切下并接種到誘導培養(yǎng)基上，先在28°C條件下全暗培養(yǎng)35天，然后置于每天光照10小時，光照強度為15001x的條件下培養(yǎng)10天即可形成胚性愈傷組織，誘導率達88.9%。所述的誘導培養(yǎng)基為 MS+0.3mg/L6-BA+0.lmg/L NAA+15g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8。
[0017](3)分化培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)獲得的呈綠色的子葉愈傷組織切成0.5cm3大小的小塊轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)7天，然后置于每天光照12小時，光照強度為30001x，置于培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)培養(yǎng)14天即可形成不定芽。所述的分化培養(yǎng)基為MS+0.05mg/LTDZ+0.lmg/L KT+15g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂，pH 為 5.8。
[0018](4)生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為2.5?3.5cm的不定芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)7天，然后置于每天光照14小時，光照強度為20001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)18天即可生根，生根率達87.9%。所述的生根培養(yǎng)基為MS+lmg/L IBA+30g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂，pH為5.8。
[0019](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約6?8cm的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗5天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由營養(yǎng)土:沙土 = 2:1混合成的基質(zhì)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天以1/4MS大量元素營養(yǎng)液給幼苗澆水，保持濕度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率可達90%以上。
[0020]實施例2:
(O種子萌發(fā):將野外采集的野生長葉點地梅種子先用洗衣粉水沖洗2h，然后于超凈工作臺中，剝開外種皮，先用75%乙醇消毒8s后用無菌水洗3次，再用4%次氯酸鈉溶液消毒lOmin，用無菌水沖洗4次后放于無菌培養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿底層鋪一層薄的脫脂棉，再在脫脂棉上覆蓋濾紙后滅菌)的濾紙上，加入適量無菌水，然后置于每天光照11小時，光照強度為15001x，直至種子萌發(fā)，期間定期向培養(yǎng)皿中加入適量無菌水，以保證脫脂棉和濾紙濕潤，種子萌發(fā)率可達91%以上。
[0021](2)愈傷組織誘導:將步驟(I)得到的剛萌發(fā)的高約Icm的實生苗下胚軸切下并接種到誘導培養(yǎng)基上，先在28°C條件下全暗培養(yǎng)35天，然后置于每天光照10小時，光照強度為15001x的條件下培養(yǎng)10天即可形成胚性愈傷組織，誘導率達81%。所述的誘導培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+15g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8。
[0022](3)分化培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)獲得的呈綠色的子葉愈傷組織切成0.5cm3大小的小塊轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)7天，然后置于每天光照12小時，光照強度為30001x，置于培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)培養(yǎng)14天即可形成不定芽。所述的分化培養(yǎng)基為MS+0.lmg/LTDZ+0.3mg/L KT+15g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂，pH為 5.8。
[0023](4)生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為2.5?3.5cm的不定芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)7天，然后置于每天光照14小時，光照強度為20001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)18天即可生根，生根率達90%。所述的生根培養(yǎng)基為MS+3mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂，pH為5.8。
[0024](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約6?8cm的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由營養(yǎng)土:沙土 = 2:1混合成的基質(zhì)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天以1/4MS大量元素營養(yǎng)液給幼苗澆水，保持濕度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率可達85%以上。
【主權(quán)項】
1.一種長葉點地梅組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于包括以下步驟: (1)種子萌發(fā):將野外采集的野生長葉點地梅種子先用洗衣粉水沖洗I?3h，然后于超凈工作臺中，剝開外種皮，先用75%乙醇消毒5?30s后用無菌水洗3?5次,再用I?5%次氯酸鈉溶液消毒10?25min，用無菌水沖洗4?6次后放于無菌培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿底層鋪一層薄的脫脂棉，再在脫脂棉上覆蓋濾紙后滅菌的濾紙上，加入適量無菌水，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為1500?30001x，直至種子萌發(fā)，期間定期向培養(yǎng)皿中加入適量無菌水，以保證脫脂棉和濾紙濕潤； (2)愈傷組織誘導:將步驟(I)得到的剛萌發(fā)的高約Icm的實生苗下胚軸切下并接種到誘導培養(yǎng)基上，先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)30?45天，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為1500?30001χ，直至誘導形成胚性愈傷組織； (3)分化培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)獲得的呈綠色的子葉愈傷組織切成0.5cm3大小的小塊轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)7?14天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為3000?50001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成不定芽； (4)生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為2.5?3.5cm的不定芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)7?14天，然后置于每天光照14?16小時，光照強度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)至生根； (5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約6?8cm的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由營養(yǎng)土:沙土= 2:1混合成的基質(zhì)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天以1/4MS大量兀素營養(yǎng)液給幼苗燒水,保持濕度，待幼苗成活后再移栽大田。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長葉點地梅組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于步驟(2)所述的誘導培養(yǎng)基為:MS+0.1 ?0.6mg/L6-BA+0.1 ?0.5mg/L NAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長葉點地梅組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于步驟(3)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.01 ?0.lmg/LTDZ+0.1 ?0.5mg/L KT+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長葉點地梅組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于步驟(4)所述的生根培養(yǎng)基為:MS+1?5mg/L IBA+15?30g/L鹿糖+3.5?6.0g/L瓊脂,pH為5.4?5.8。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長葉點地梅組織培養(yǎng)快繁方法，涉及長葉點地梅（Androsace longifolia）通過無性快繁技術(shù)快速獲得大量種苗的方法。本發(fā)明以長葉點地梅種子為外植體，經(jīng)過愈傷組織誘導、不定芽誘導、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等步驟建立長葉點地梅組織培養(yǎng)快繁體系，為今后通過多倍體育種、轉(zhuǎn)基因等方法培育出花大、色艷、觀賞價值高的長葉點地梅新品種提供參考。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104686334
【申請?zhí)枴緾N201510085924
【發(fā)明人】劉木嬌
【申請人】劉木嬌
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月22日