專(zhuān)利名稱(chēng)：植物生長(zhǎng)的增強(qiáng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增強(qiáng)植物的生長(zhǎng)。
背景技術(shù)：
幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)，人們已經(jīng)知道并實(shí)行施用有機(jī)肥料來(lái)改善植物生長(zhǎng)(H.Marschner，“Mineral Nutrition of Higher Plants，”AcademicPressNew York第674頁(yè)(1986))。現(xiàn)代人類(lèi)已經(jīng)發(fā)展了復(fù)雜的無(wú)機(jī)肥料生產(chǎn)系統(tǒng)，生產(chǎn)出栽培者和農(nóng)民可以施用于土壤或生長(zhǎng)中的作物、通過(guò)增強(qiáng)生長(zhǎng)來(lái)改善生產(chǎn)性能的易用產(chǎn)品。通過(guò)施用肥料產(chǎn)品，植株大小、著色、成熟和產(chǎn)量都可以得到改善。無(wú)機(jī)肥料包括普遍使用的化學(xué)品如硝酸銨。有機(jī)肥料可以包括廄肥和堆肥草渣(composted lawn debris)以及許多其它資源。
在最近幾年，研究者已經(jīng)尋求通過(guò)使用生物制品來(lái)改善植物生長(zhǎng)。如白僵菌(Beauveria bassiana)和Trichoderma harizamum的病蟲(chóng)害防治劑已經(jīng)注冊(cè)用于防治病蟲(chóng)害問(wèn)題，并因此間接改善植物的生長(zhǎng)及生產(chǎn)性能(Fravel等人，“防治植物病害的微生物制劑，”Formulation of Microbial Biopesticides，Beneficial Microorganisms，andNematodes，H.D.Burges編輯，Chapman and HallLondon(1996))。
現(xiàn)在有一些通過(guò)應(yīng)用微生物或微生物副產(chǎn)品來(lái)直接增強(qiáng)植物生長(zhǎng)的跡象。人們已經(jīng)在將豆科作物的種子引入一個(gè)新生境(site)時(shí)，向其加入結(jié)瘤細(xì)菌(Weaver等人，“根瘤菌(Rhizobium)，”Methods ofSoil Analysis，第2部分，Chemical and Microbiological Properties，第二版，American Society of AgronomyMadison(1982))。這些細(xì)菌可以改善植物的結(jié)瘤效率，并因此改善植物將游離氮轉(zhuǎn)化為一種可利用形式的能力(這個(gè)過(guò)程叫固氮作用)。通常非豆科作物并不從這樣的處理中受益。加入的細(xì)菌如根瘤菌(Rhizobium)直接寄生于根毛，然后開(kāi)始一種互利共生關(guān)系提供給植物好處，同時(shí)獲得保護(hù)與支持。
菌根真菌被認(rèn)為是許多作物(特別是在營(yíng)養(yǎng)缺乏的土壤中的針葉樹(shù))隨意生長(zhǎng)(optional growth)所必需的微生物。人們已經(jīng)提出了包括植物激素的生物合成(Frankenberger等人，“松Ectomycorrhizal真菌彩色豆馬勃(Pisolithus tinctorius)生物合成吲哚-3-乙酸，”Appl.Environ.Microbiol.532908-13(1987))、礦物質(zhì)的攝入增加(Harley等人，“切下的山毛櫸的菌根根攝入磷酸鹽，”New Phytologist 49388-97(1950)和Harley等人，“切下的山毛櫸的菌根根攝入磷酸鹽，IV.氧濃度對(duì)宿主和真菌的影響，”New Phytologist 52124-32(1953))和水的攝入增加(A.B.Hatch，“松屬(Pinus)菌根營(yíng)養(yǎng)的物理基礎(chǔ)，”BlackRock Forest Bull.No.6，第168頁(yè)(1937))等機(jī)制。由于對(duì)于任何給定的菌根菌株都有可變和不一致的結(jié)果，以及對(duì)這類(lèi)生物研究的困難，菌根真菌并未獲得象結(jié)瘤細(xì)菌一樣的使用頻率。
近年來(lái)已經(jīng)認(rèn)定植物生長(zhǎng)促進(jìn)根瘤細(xì)菌(“PGPR”)能改善植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。假說(shuō)的機(jī)制從直接影響(如營(yíng)養(yǎng)攝入增加)到間接機(jī)制(如病原體排代(pathogen displacement)置換)都有。應(yīng)用PGPR得到的生長(zhǎng)增強(qiáng)通常是指將一種活細(xì)菌接種到根系統(tǒng)，通過(guò)細(xì)菌產(chǎn)生的激素作用、鐵載體獲得改善的生長(zhǎng)，或通過(guò)產(chǎn)生抗生素或競(jìng)爭(zhēng)而預(yù)防病害，從而獲得改善的生長(zhǎng)。在所有上面的情況中，結(jié)果都是通過(guò)根定居，有時(shí)是通過(guò)應(yīng)用種子包被產(chǎn)生的。有有限信息表明，一些PGPR菌株可能是直接的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，在悉生條件下增強(qiáng)根的延長(zhǎng)(Anderson等人，“在水培系統(tǒng)中菜豆對(duì)惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)根部定居的應(yīng)答，”P(pán)hytopathology 75992-95(1985)，Lifshitz等人，“在悉生條件下惡臭假單胞菌菌株對(duì)Canola(油菜籽)幼苗的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，”Can.J.Microbiol.33390-95(1987)，Young等人，“PGPR在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和植物生長(zhǎng)刺激或生物活性之間有關(guān)系嗎？，”P(pán)romoting RhizobacteriaProgress and Prospects，Second InternationalWorkshop on Plant Growth-promoting Rhizobacteria，第182-86頁(yè)(1991)，Loper等人，“吲哚-3-乙酸的細(xì)菌來(lái)源對(duì)糖甜菜根延伸的影響，”P(pán)hytopathology 76386-89(1986)，和Müller等人，“玉米(Zea mays L.)根際中的激素相互作用以及它們對(duì)植物發(fā)育的作用，”Z.Pflanzenernahrung Bodenkunde 152247-54(1989))；然而，也有人已經(jīng)提出植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生是介導(dǎo)這些作用的機(jī)制。許多細(xì)菌在體外產(chǎn)生各種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(Atzorn等人，“菜豆根瘤菌(Rhizobiumphaseol)產(chǎn)生赤霉素和吲哚-3-乙酸與Phaseolus vulgaris根部結(jié)瘤有關(guān)，”P(pán)lanta 175532-38(1988)和M.E.Brown，“固體和根際微生物(Microorganism of Solid and Rhizosphere)產(chǎn)生的植物生長(zhǎng)刺激素，”J.Appl.Bact.35443-51(1972))或抗生素(Gardner等人，“產(chǎn)生抗生素的熒光假單胞菌對(duì)柑桔類(lèi)根部的生長(zhǎng)促進(jìn)和抑制，”P(pán)lant Soil 77103-11(1984))。鐵載體的產(chǎn)生是針對(duì)一些PGPR菌株提出的另一種機(jī)制(Ahl等人，“參與熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株對(duì)根串珠霉(Thievaliopsis basicola)抑制的鐵結(jié)合鐵載體、氰酸和抗生素，”J.Phytopathol.116121-34(1986)，Kloepper等人，“促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根瘤細(xì)菌產(chǎn)生的鐵載體增強(qiáng)植物生長(zhǎng)，”Nature 286885-86(1980)，和Kloepper等人，“假單胞菌鐵載體(Pseudomonas siderophores)解釋病害抑制性土壤的機(jī)制，”Curr.Microbiol.4317-20(1980))。在根表面定居并因此在表面與病原細(xì)菌直接競(jìng)爭(zhēng)是另一種作用機(jī)制(Kloepper等人，“促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根瘤細(xì)菌在體外對(duì)植物生長(zhǎng)的抗生作用和根部微生物區(qū)系的排代作用的關(guān)系，”P(pán)hytopathology 711020-24(1981)，Weller等人，“通過(guò)用熒光假單胞菌處理種子提高小麥的生長(zhǎng)以及腐霉屬(Pythium)防治的含意，”Can.J.Microbiol.8328-34(1986)，和Suslow等人，“糖甜菜的根瘤細(xì)菌種子施肥和根部定居對(duì)產(chǎn)量的影響，”P(pán)hytopathology 72199-206(1982))。Canola(油菜籽)研究已經(jīng)表明PGPR增強(qiáng)植物的生長(zhǎng)參數(shù)，包括產(chǎn)量、出苗率和活力、早季植物生長(zhǎng)(葉的數(shù)目和主長(zhǎng)匐枝的長(zhǎng)度)以及葉面積(Kloepper等人，“Canola(油菜籽)上促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根瘤細(xì)菌，”P(pán)lant Dise7242-46(1988))。對(duì)土豆的研究表明，當(dāng)將假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株應(yīng)用于種用馬鈴薯時(shí)，產(chǎn)量提高(Burr等人，“用特殊的熒光假單胞菌(Pseudomonas Fluorescens)和惡臭假單胞菌(P.Putida)菌株處理塊莖提高馬鈴薯的產(chǎn)量，”P(pán)hytopathology 681377-83(1978)，Kloepper等人，“塊莖接種促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根瘤細(xì)菌對(duì)馬鈴薯根部上和子塊莖中胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)群體的作用，”P(pán)hytopathology 73217-19(1983)，Geels等人，“在用拮抗的種名待定的熒光假單胞菌(Fluorescent Pseudomonas spp.)處理種用塊莖后使高頻馬鈴薯種植土壤中的產(chǎn)量降低還原，”P(pán)hytopathol.Z.108207-38(1983)，Howie等人，“根瘤細(xì)菌栽培品種和土壤類(lèi)型對(duì)馬鈴薯的植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響，”Soil Biol.Biochem.15127-32(1983)，和Vrany等人，“接種根際細(xì)菌的馬鈴薯植株的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，”FoliaMicrobiol.29248-53(1984))。增產(chǎn)明顯地是由于PGPR的競(jìng)爭(zhēng)作用(有可能是抗生作用)除去了種用塊莖上的病原細(xì)菌(Kloepper等人，“塊莖接種促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根瘤細(xì)菌對(duì)馬鈴薯根部上和子塊莖中胡蘿卜軟腐歐文氏菌群體的作用，”P(pán)hytopathology 73217-19(1983)，Kloepper等人，“促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根瘤細(xì)菌在根際定居對(duì)馬鈴薯植物發(fā)育和產(chǎn)量的作用，”P(pán)hytopathology 701078-82(1980)，Kloepper等人，“促進(jìn)出土的根瘤細(xì)菌對(duì)于農(nóng)業(yè)的描述和含意，”第155-164頁(yè)，Iron，Siderophores，and Plant Disease，T.R.Swinburne編輯，Plenum，New York(1986)，和Kloepper等人，“促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根瘤細(xì)菌對(duì)植物生長(zhǎng)的抗生作用和根微生物區(qū)系的排代作用的關(guān)系，”P(pán)hytopathology 711020-24(1981))。在一些研究中，使用PGPR后植株的出土得到改善(Tipping等人，“促進(jìn)出土的根瘤細(xì)菌對(duì)于超甜玉米的發(fā)育，”P(pán)hytopathology 76938-41(1990)(摘要)和Kloepper等人，“促進(jìn)出土的根瘤細(xì)菌對(duì)于農(nóng)業(yè)的描述和含意，”第155-164頁(yè)，Iron，Siderophores，and Plant Disease，T.R.Swinburne編輯，Plenum，New York(1986))。許多其它研究表明，用根瘤細(xì)菌處理后，由于對(duì)植物病原體進(jìn)行生物防治，植物健康得到改善(B.Schippers，“用根瘤細(xì)菌生物防治病原體，”P(pán)hil.Trans.R.Soc.Lond.B.318283-93(1988)，Schroth等人，“病害抑制性土壤和根部定居的細(xì)菌，”Science2161376-81(1982)，Stutz等人，“參與抑制煙草青霉病的天然存在的熒光假單胞菌，”P(pán)hytopathology 76181-85(1986)，和D.M.Weller，“用細(xì)菌生物防治根際中的土傳植物病原體，”Annu.Rev.Phytopathol.26379-407(1988))。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)植物的病原體誘導(dǎo)的免疫促進(jìn)生長(zhǎng)。外部注射Peronospora tabacina到煙草木質(zhì)部不僅減輕矮化，而且促進(jìn)生長(zhǎng)和發(fā)育。免疫后的煙草植物在溫室試驗(yàn)和大田試驗(yàn)中，比對(duì)照植物約高40％，干重增加40％，鮮重增加30％，并多4-6片葉子(Tuzun，S.等人，“莖注射Peronospora tabacina并且進(jìn)行Metalaxyl處理對(duì)大田中煙草生長(zhǎng)和抵抗青霉病的保護(hù)作用的影響，”P(pán)hytopathology，74804(1984))。這些植株大約比對(duì)照植株早開(kāi)花2-3周(Tuzun，S.等人，“系統(tǒng)保護(hù)抵抗青霉病的因子在接種Peronospora tabacina Adam的煙草中的運(yùn)動(dòng)，”P(pán)hysiological Plant Pathology，26321-30(1985))。
本發(fā)明涉及在先前的植物生長(zhǎng)增強(qiáng)方法范圍內(nèi)的改進(jìn)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)植物生長(zhǎng)的方法。這種方法涉及在一定條件下施用非感染型的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑(elicitor)多肽或蛋白于植物或植物種子，以賦予所述植物或由所述植物種子長(zhǎng)成的植物以增強(qiáng)的生長(zhǎng)。
為賦予植物或由植物種子長(zhǎng)成的植物以增強(qiáng)的生長(zhǎng)，除施用過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白于所述植物或所述植物種子外，一種可以選擇的方法是可以利用轉(zhuǎn)基因植物或植物種子。當(dāng)利用轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，這涉及到提供用編碼一種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，并在有效允許所述DNA分子增強(qiáng)生長(zhǎng)的條件下培育所述植物。用另一種方法，可以提供用編碼一種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物種子并種植在土壤中。然后在有效允許所述DNA分子增強(qiáng)生長(zhǎng)的條件下，由種植的種子繁殖出植物。
本發(fā)明的目標(biāo)在于產(chǎn)生任何形式的植物生長(zhǎng)增強(qiáng)或促進(jìn)。這可以發(fā)生在早至從種子開(kāi)始的植物生長(zhǎng)，遲至植物的生活中。例如，依照本發(fā)明的植物生長(zhǎng)包括產(chǎn)量更高、所產(chǎn)生種子的質(zhì)量提高、種子發(fā)芽率提高、植物大小增加、生物量更高、果實(shí)更多和更大、果實(shí)著色更早、以及果實(shí)和植株成熟更早。結(jié)果是本發(fā)明為栽培者提供顯著的經(jīng)濟(jì)效益。例如，早發(fā)芽和早成熟使得作物能夠生長(zhǎng)在生長(zhǎng)季節(jié)短暫的地區(qū)，而在其它情況下短暫的生長(zhǎng)季節(jié)會(huì)阻礙它們?cè)诋?dāng)?shù)氐纳L(zhǎng)。種子發(fā)芽率的提高導(dǎo)致改善的作物林分(stand)以及更有效的種子使用。產(chǎn)量更高、大小增加和生物量生產(chǎn)增強(qiáng)使得給定的小塊土地上年產(chǎn)出(revenue generation)更高。因此顯然，本發(fā)明構(gòu)成農(nóng)業(yè)效率上的一個(gè)顯著進(jìn)步。
附圖簡(jiǎn)述


圖1是質(zhì)粒載體pCPP2139的圖，所述質(zhì)粒載體包含解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑基因。
圖2是質(zhì)粒pCPP50的圖，所述質(zhì)粒載體不包含解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑基因，但其它方面則與
圖1所示的質(zhì)粒載體pCPP2139相同。參見(jiàn)Masui等人，Bio/Technology 281-85(1984)，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)植物生長(zhǎng)的方法。這種方法涉及在一定條件下將非感染型的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白施用于整株植物或植物部分、或施用于植物種子，以賦予所述植物或由所述植物種子長(zhǎng)成的植物以增強(qiáng)的生長(zhǎng)?；蛘?，可以用這種方法處理植物來(lái)產(chǎn)生種子，然后種下種子，賦予子代植物增強(qiáng)的生長(zhǎng)。
為賦予植物或由植物種子長(zhǎng)成的植物以增強(qiáng)的生長(zhǎng)，除施用過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白于所述植物或所述植物種子外，一種可選擇的方法是利用轉(zhuǎn)基因植物或植物種子。當(dāng)利用轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，這就涉及到提供用編碼一種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，并在有效允許所述DNA分子增強(qiáng)生長(zhǎng)的條件下培育所述植物?；蛘?，可以提供用編碼一種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物種子并將其種植在土壤中。然后在有效允許所述DNA分子增強(qiáng)生長(zhǎng)的條件下，從所述種植的種子繁殖出植物。
本發(fā)明中利用的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白可以對(duì)應(yīng)于由廣泛種類(lèi)的真菌病原體或細(xì)菌病原體得到的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。這樣的多肽或蛋白能在所述誘發(fā)劑接觸的植物組織中誘發(fā)(elicit)局部壞死。
合適的多肽或蛋白誘發(fā)劑的細(xì)菌來(lái)源的例子包括歐文氏菌屬、假單胞菌屬以及單胞菌屬(如下列細(xì)菌解淀粉歐文氏菌、菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、斯氏歐文氏菌(Erwinia stewartii)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、茄假單胞菌(Pseudomonas solancearum)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)及它們的組合)。
過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的真菌來(lái)源的一個(gè)例子是疫霉屬(Phytophthora)，合適的疫霉屬種包括Phytophthora pythium、隱地疫霉(Phytophthora cryptogea)、樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、大雄疫霉(Phytophthora megasperma)以及柑桔褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)。
可以用多種方法實(shí)施本發(fā)明的將過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白施用于植物或植物種子的實(shí)施方案，包括1)施用一種分離的誘發(fā)劑多肽或蛋白；2)施用不致病并且用編碼過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；以及3)施用在一些植物種中致病(但并不在其所施用的物種中致病)、并且天然包含編碼所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的基因的細(xì)菌。另外，從用依照本發(fā)明的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑蛋白或多肽處理過(guò)的植株上，可以回收依照本發(fā)明的種子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白可以從它們相應(yīng)的生物中分離得到，并施用于植物或植物種子。這樣的分離程序是廣為人知的，如Arlat，M.，F(xiàn).Van Gijsegem，J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“PopAl，為在特殊牽?；ɑ蛐椭姓T導(dǎo)過(guò)敏樣反應(yīng)的一種蛋白，它通過(guò)茄假單胞菌的Hrp途徑分泌，”EMBO J.13543-553(1994)；He，S.Y.，H.C.Huang，和A.Collmer，“丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonas syringae pv.Syringae)的harpinpss通過(guò)Hrp途徑分泌、并在植物中誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的一種蛋白，”Cell 731255-1266(1993)；和Wei，Z.-M.，R.J.Laby，C.H.Zumoff，D.W.Bauer，S.-Ｙ.He，A.Collmer，和S.V.Beer，“由植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)的harpin誘發(fā)劑，”Science 25785-88(1992)所述，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。還可參見(jiàn)未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)08/200,024和08/062,064，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。然而，本發(fā)明分離得到的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白最好如下所述重組產(chǎn)生并純化。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可以通過(guò)施用包含編碼過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的基因的細(xì)菌，將本發(fā)明的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白施用于植物或植物種子。這樣的細(xì)菌必須能夠分泌或輸出所述多肽或蛋白，以便所述誘發(fā)劑能接觸植物細(xì)胞或植物種子細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白由所述細(xì)菌在植株中或種子上產(chǎn)生，或恰好在將所述細(xì)菌引入所述植物或植物種子之前產(chǎn)生。
在本發(fā)明的細(xì)菌應(yīng)用模式的一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌并不致病，并且已經(jīng)用編碼一種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化(如通過(guò)重組)。例如，大腸桿菌并不在植物中誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，可以用編碼一種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后將其施用于植物。大腸桿菌外的其它細(xì)菌物種也可用于本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中。
在本發(fā)明的細(xì)菌應(yīng)用模式的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌致病，并且天然包含編碼一種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的基因。這樣的細(xì)菌的例子已經(jīng)在上面提過(guò)。然而，在該實(shí)施方案中，這些細(xì)菌施用于對(duì)所述細(xì)菌導(dǎo)致的疾病并不易感的植物或其種子。例如，解淀粉歐文氏菌在蘋(píng)果或梨中致病，但并不在番茄中致病。然而，這樣的細(xì)菌會(huì)在番茄中誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。因此，依照本發(fā)明的該實(shí)施方案，解淀粉歐文氏菌可以施用于番茄植株或種子以增強(qiáng)生長(zhǎng)，而不會(huì)在該物種中致病。
得自菊歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白具有對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，如下所示Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1 5 10 15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser20 25 30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr35 40 45Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu50 55 60Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65 70 75 80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys85 90 95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp100 105 110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln115 120 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met130 135 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145 150 155 160Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly165 170 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu180 185 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala195 200 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val210 215 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225 230 235 240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp245 250 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys260 265 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln275 280 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr290 295 300Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala305 310 315 320Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala325 330 335Asn Ala
這種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的分子量為34kDa，對(duì)熱穩(wěn)定，其甘氨酸含量大于16％，并且基本不包含半胱氨酸。菊歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白是由其核苷酸序列對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.2的DNA分子編碼，如下所示CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG 60GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC 120GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG 180CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG 240TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG 300CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG 360ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC 420CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT 480CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG 540GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA 600AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC 660TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT 720GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT 780GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC 840TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA 900TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC 960CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC1020CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG1080CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT1140GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT1200GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA1260CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA1320TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA1380GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG1440CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA1500TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC1560GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA1620ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC1680TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA1740ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC1800GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC1860CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG1920CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG1980GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC2040AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG2100GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T2141得自解淀粉歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.3，如下所示Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1 5 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu85 90 95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr100 105 110
Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro115 120 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser130 135 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145 150 155 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly165 170 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu180 185 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly195 200 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly210 215 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225 230 235 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln245 250 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln260 265 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe275 280 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met290 295 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305 310 315 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser325 330 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn340 345 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn355 360 365Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp370 375 380Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu385 390 395 400Gly Ala Ala這種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的分子量約為39kDa，pI約為4.3，可在100℃熱穩(wěn)定至少10分鐘。這種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白基本不含半胱氨酸。得自解淀粉歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白在Wei，Z.-M.，R.J.Laby，C.H.Zumoff，D.W.Bauer，S.-Y.He，A.Collmer，和S.V.Beer，“harpin，由植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)的誘發(fā)劑，”Science 25785-88(1992)中有更完全的描述，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。編碼這種多肽或蛋白的DNA分子具有對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.4的核苷酸序列，如下所示AAGCTTCGGC ATGGCACGTT TGACCGTTGG GTCGGCAGGG TACGTTTGAA TTATTCATAA 60GAGGAATACG TTATGAGTCT GAATACAAGT GGGCTGGGAG CGTCAACGAT GCAAATTTCT 120ATCGGCGGTG CGGGCGGAAA TAACGGGTTG CTGGGTACCA GTCGCCAGAA TGCTGGGTTG 180GGTGGCAATT CTGCACTGGG GCTGGGCGGC GGTAATCAAA ATGATACCGT CAATCAGCTG 240GCTGGCTTAC TCACCGGCAT GATGATGATG ATGAGCATGA TGGGCGGTGG TGGGCTGATG 300GGCGGTGGCT TAGGCGGTGG CTTAGGTAAT GGCTTGGGTG GCTCAGGTGG CCTGGGCGAA 360GGACTGTCGA ACGCGCTGAA CGATATGTTA GGCGGTTCGC TGAACACGCT GGGCTCGAAA 420GGCGGCAACA ATACCACTTC AACAACAAAT TCCCCGCTGG ACCAGGCGCT GGGTATTAAC 480TCAACGTCCC AAAACGACGA TTCCACCTCC GGCACAGATT CCACCTCAGA CTCCAGCGAC 540CCGATGCAGC AGCTGCTGAA GATGTTCAGC GAGATAATGC AAAGCCTGTT TGGTGATGGG 600CAAGATGGCA CCCAGGGCAG TTCCTCTGGG GGCAAGCAGC CGACCGAAGG CGAGCAGAAC 660GCCTATAAAA AAGGAGTCAC TGATGCGCTG TCGGGCCTGA TGGGTAATGG TCTGAGCCAG 720CTCCTTGGCA ACGGGGGACT GGGAGGTGGT CAGGGCGGTA ATGCTGGCAC GGGTCTTGAC 780GGTTCGTCGC TGGGCGGCAA AGGGCTGCAA AACCTGAGCG GGCCGGTGGA CTACCAGCAG 840TTAGGTAACG CCGTGGGTAC CGGTATCGGT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC GCTGAATGAT 900ATCGGTACGC ACAGGCACAG TTCAACCCGT TCTTTCGTCA ATAAAGGCGA TCGGGCGATG 960GCGAAGGAAA TCGGTCAGTT CATGGACCAG TATCCTGAGG TGTTTGGCAA GCCGCAGTAC1020CAGAAAGGCC CGGGTCAGGA GGTGAAAACC GATGACAAAT CATGGGCAAA AGCACTGAGC1080AAGCCAGATG ACGACGGAAT GACACCAGCC AGTATGGAGC AGTTCAACAA AGCCAAGGGC1140ATGATCAAAA GGCCCATGGC GGGTGATACC GGCAACGGCA ACCTGCAGGC ACGCGGTGCC1200GGTGGTTCTT CGCTGGGTAT TGATGCCATG ATGGCCGGTG ATGCCATTAA CAATATGGCA1260CTTGGCAAGC TGGGCGCGGC TTAAGCTT 1288得自丁香假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白具有對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.5的氨基酸序列，如下所示Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1 5 10 15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser20 25 30Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met35 40 45Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala50 55 60Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val65 70 75 80Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe85 90 95Gly Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met100 105 110Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu115 120 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met130 135 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145 150 155 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe165 170 175Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile180 185 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly195 200 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser210 215 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225 230 235 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp245 250 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val260 265 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln275 280 285
Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala290 295 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg325 330 335Asn Gln Ala Ala Ala340這種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的分子量為34-35kDa。含豐富的甘氨酸(約13.5％)，缺乏半胱氨酸和酪氨酸。關(guān)于得自丁香假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑的其它信息可以在He，S.Y.，H.C.Huang，和A.Collmer，“丁香假單胞菌丁香致病變種的harpinpss通過(guò)Hrp途徑分泌、并在植物中誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的一種蛋白，”Cell 731255-1266(1993)中找到，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。編碼得自丁香假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑的DNA分子具有對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.6的核苷酸序列，如下所示ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG 60GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC120GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA180AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC240ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG300GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC360AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC420GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC480AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC540GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG600AGTGACGCTG GCAGTCTGGC ACGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC660AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC720GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGCAA780TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG840
GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCAGGATCTT GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG 900GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT 960GCGCAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA1020GCCTGA 1026得自茄假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白具有對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.7的氨基酸序列，如下所示Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1 5 10 15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Sar Gly Gln Ser20 25 30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile35 40 45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly50 55 60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65 70 75 80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser85 90 95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met100 105 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala115 120 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val130 135 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly165 170 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly180 185 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala195 200 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn210 215 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225 230 235 240
Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn245 250 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln260 265 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly275 280 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser290 295 300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val305 310 315 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln325 330 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met340它由其核苷酸序列對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.8的DNA分子編碼，如下所示ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC 120GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC 180GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC 240AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC 300GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA 360GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG 420GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC 480GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC 540GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT 600GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC 660GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC 720CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG 780ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC 840GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT 900GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC 960GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCG1020ACGCAGCCGA TGTAA 1035關(guān)于得自茄假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的其它信息在Arlat，M.，F(xiàn).Van Gijsegem，J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“PopAl，為在特殊牽?；ɑ蛐椭姓T導(dǎo)過(guò)敏樣反應(yīng)的一種蛋白，它通過(guò)茄假單胞菌的Hrp途徑分泌，”EMBO J.13543-533(1994)中陳述，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
得自野油菜黃單胞菌大豆致病變種(Xanthomonas campestris pv.glycines)的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白具有對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.9的氨基酸序列，如下所示Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 25該序列是得自野油菜黃單胞菌大豆致病變種的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的僅含有26個(gè)殘基的氨基末端序列。它對(duì)應(yīng)于在其它野油菜黃單胞菌致病變種中確定的菌毛亞基蛋白。
得自野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種(Xanthomonas campestris pv.Pelargonii)的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)熱穩(wěn)定、對(duì)蛋白酶敏感、分子量為20kDa。它包含一段對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.10的氨基酸序列，如下所示Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln1 5 10 15Leu Leu Ala Met20胡蘿卜軟腐歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑蛋白或多肽的分離在Cui等人，“The RsmA Mutants of胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株Ecc71的RsmA突變體在煙草葉中過(guò)量表達(dá)hrp NEcc并誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)樣應(yīng)答，”MPMI，9(7)565-73(1996)中陳述，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑蛋白或多肽在Ahmad等人，“harpin對(duì)于斯氏歐文氏菌對(duì)玉米的致病性不是必需的，”8th Int’l. Cong.Molec.Plant-MicrobeInteract.，July 14-19，1996和Ahmad等人，“harpin對(duì)于斯氏歐文氏菌對(duì)玉米的致病性不是必需的，”Ann.Mtg.Am.Phytopath.Soc.，7月27-31，1996中展示，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
得自寄生疫霉(Phytophthora parasitica)、隱地疫霉、樟疫霉、辣椒疫霉、大雄疫霉和柑桔褐腐疫霉的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑蛋白或多肽在Kaman等人，“來(lái)自疫霉屬的胞外蛋白誘發(fā)劑對(duì)細(xì)菌性和真菌性植物病原菌抗性的大多數(shù)特異性和誘導(dǎo)，”Molec.Plant-Microbe Interact.，6(1)15-25(1993)，Ricci等人，“來(lái)自致病真菌疫霉屬、在煙草中誘發(fā)壞死和獲得性抗性的蛋白的結(jié)構(gòu)和活性，”Eur.J.Biochem.，183555-63(1989)，Ricci等人，“寄生疫霉分離菌在煙草中差別性產(chǎn)生parasiticein以及壞死和抗性的誘發(fā)劑，”P(pán)lant Path.41298-307(1992)，Baillreul等人，“一種新的煙草過(guò)敏反應(yīng)的誘發(fā)劑一種真菌糖蛋白誘發(fā)細(xì)胞死亡、表達(dá)防御基因、產(chǎn)生水楊酸并誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性，”P(pán)lant J.，8(4)551-60(1995)，和Bonnet等人，“誘發(fā)劑在煙草和其它植物中觸發(fā)的獲得性抗性，”Eur.J.Plant Path.，102181-92(1996)中陳述，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
上面的誘發(fā)劑都是典型的。其它誘發(fā)劑可以如下鑒定在編碼誘發(fā)劑的基因得到表達(dá)的條件下，培養(yǎng)誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的真菌或細(xì)菌。將從培養(yǎng)物上清得到的無(wú)細(xì)胞制備物浸潤(rùn)合適的植物組織，測(cè)試誘發(fā)劑活性(即局部壞死)。
在本發(fā)明的方法中，還有可能使用上述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的片段以及來(lái)自其它病原體的全長(zhǎng)的誘發(fā)劑的片段。
可以用幾種方法產(chǎn)生合適的片段。第一種方法，采用常規(guī)分子遺傳操作，亞克隆編碼一種已知誘發(fā)劑蛋白的基因的片段，產(chǎn)生該基因的亞克隆。然后將所述亞克隆體外表達(dá)或在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生小一些的蛋白或肽，所述蛋白或肽可以依照后面所述程序測(cè)試誘發(fā)劑活性。
另一種可選擇的方法是用蛋白酶如胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌A蛋白酶、或胰蛋白酶消化全長(zhǎng)的誘發(fā)劑蛋白，產(chǎn)生所述誘發(fā)劑蛋白的片段。根據(jù)所述誘發(fā)劑蛋白的氨基酸序列，不同的蛋白酶有可能在不同位點(diǎn)切割所述誘發(fā)劑蛋白。一些得自蛋白水解的片段可能是抗性的活性誘發(fā)劑。
在另一種方法中，根據(jù)對(duì)所述蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)的知識(shí)，使用PCR技術(shù)以及選定的代表所述蛋白特定部分的特異性引物組，可以合成所述誘發(fā)劑蛋白基因的片段。然后將這些片段克隆進(jìn)一種合適的載體，以增殖和表達(dá)一種截短的肽或蛋白。
也可以使用化學(xué)合成來(lái)制備合適的片段。使用要產(chǎn)生的誘發(fā)劑的已知氨基酸序列來(lái)進(jìn)行這樣的合成?；蛘?，將全長(zhǎng)的誘發(fā)劑在高溫高壓下處理也會(huì)產(chǎn)生片段。然后可以用常規(guī)程序(如層析、SDS-PAGE)分離這些片段。
有用片段的一個(gè)例子是來(lái)自茄假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的popA1片段，參見(jiàn)Arlat，M.，F(xiàn).Van Gijsegem，J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“popA1，為在特殊牽?；ɑ蛐椭姓T導(dǎo)過(guò)敏樣反應(yīng)的一種蛋白，它通過(guò)茄假單胞菌的Hrp途徑分泌，”EMBOJ.13543-553(1994)，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。至于解淀粉歐文氏菌，一種合適的片段可以是，例如，或者SEQ.ID.No.3的從氨基酸1延伸到98并且包括氨基酸1和氨基酸98的多肽，或者SEQ.ID.No.3的從氨基酸137延伸到204并且包括氨基酸137和氨基酸204的多肽，或者二者都是。
也(或者)可以用例如那些對(duì)所述多肽的特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性有最小影響的氨基酸的缺失或添加來(lái)修飾變異體。例如，可以將一段多肽連接到所述蛋白N末端指導(dǎo)所述蛋白共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)或翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)(或前導(dǎo))序列上。所述多肽也可以連接于一個(gè)接頭或其它序列，以便于所述多肽的合成、純化或鑒定。
本發(fā)明的蛋白或多肽最好是用常規(guī)技術(shù)以純化過(guò)的形式產(chǎn)生(純度優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選約80％)。本發(fā)明的蛋白或多肽產(chǎn)生后一般并不分泌入重組宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。另一種情況下，本發(fā)明的蛋白或多肽分泌入生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在蛋白不分泌的情況下，為分離所述蛋白，繁殖帶有重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞(如大腸桿菌)，用超聲處理、熱處理或化學(xué)處理裂解細(xì)胞，離心勻漿物以去除細(xì)菌殘?jiān)?。然后?duì)上清液進(jìn)行熱處理，并通過(guò)離心分離過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑蛋白。在一根尺寸合適的葡聚糖柱或聚丙烯酰胺柱上，對(duì)含有本發(fā)明的多肽或蛋白的上清液部分進(jìn)行凝膠過(guò)濾，分離所述蛋白。如果需要，可以進(jìn)一步用離子交換或HPLC純化蛋白組分。
可以使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)，將編碼過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的DNA分子引入細(xì)胞。通常這涉及將所述DNA分子插入一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)該表達(dá)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)所述DNA分子是異源的(即非正常存在的)。將所述異源DNA分子以正確的有義取向并在正確的閱讀框中插入所述表達(dá)系統(tǒng)或載體。所述載體包含插入的蛋白編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件。
Cohen和Boyer的美國(guó)專(zhuān)利第4,237,224號(hào)描述了使用限制酶切割和用DNA連接酶連接，產(chǎn)生重組質(zhì)粒形式的表達(dá)系統(tǒng)，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。然后將這些重組質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化引入單細(xì)胞培養(yǎng)物并復(fù)制，其中所述單細(xì)胞培養(yǎng)物包括原核生物以及在組織培養(yǎng)中培育的真核細(xì)胞。
重組基因也可以引入病毒中，如痘苗病毒。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已感染病毒的細(xì)胞，可以產(chǎn)生重組病毒。
合適的載體包括但不限于下面的病毒載體，如λ載體系統(tǒng)gt11、gt WES.tB、Charon 4，以及質(zhì)粒載體，如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101，SV 40、pBluescript II SK+/-或KS+/-(參見(jiàn)Stratagene，La Jolla，Calif的“Stratagene克隆系統(tǒng)”目錄(1993)，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(參見(jiàn)F.W.Studier等人，“使用T7 RNA聚合酶指導(dǎo)克隆基因的表達(dá)，”Gene Expression Technology第185卷(1990)，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中)，以及它們的任何衍生物?？梢酝ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)化、特別是轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞接合作用、帶動(dòng)轉(zhuǎn)移(mobilization)或電穿孔，將重組分子引入細(xì)胞。使用本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)克隆程序?qū)⑺鯠NA序列克隆進(jìn)載體，本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)克隆程序如Sambrook等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Springs Laboratory，Cold Springs Harbor，New York(1989)所述，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
可以利用各種宿主-載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)單個(gè)或多個(gè)蛋白編碼序列。主要是所述載體系統(tǒng)必須與所使用的宿主細(xì)胞相親和。宿主-載體系統(tǒng)包括但不限于以下所列用噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；微生物如包含酵母載體的酵母；感染病毒(如痘苗病毒、腺病毒等)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；感染病毒(如桿狀病毒)的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；以及感染細(xì)菌的植物細(xì)胞。這些載體的表達(dá)元件在其強(qiáng)度和特異性上有所不同。根據(jù)所利用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用多種合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一個(gè)。
不同的遺傳信號(hào)和加工事件控制基因表達(dá)的多個(gè)水平(如DNA的轉(zhuǎn)錄和信使RNA(mRNA)的翻譯)。
DNA的轉(zhuǎn)錄依賴(lài)于啟動(dòng)子的存在，啟動(dòng)子就是一段指導(dǎo)RNA聚合酶的結(jié)合并因此促進(jìn)mRNA合成的DNA序列。真核啟動(dòng)子的DNA序列與原核啟動(dòng)子的DNA序列不同。而且真核啟動(dòng)子及其伴隨的遺傳信號(hào)可能在原核系統(tǒng)中不被識(shí)別或不發(fā)揮功能，此外，原核啟動(dòng)子在真核細(xì)胞中不被識(shí)別并且不發(fā)揮功能。
類(lèi)似地，mRNA在原核細(xì)胞中的翻譯依賴(lài)于恰當(dāng)?shù)脑诵盘?hào)的存在，這些信號(hào)與真核細(xì)胞中的信號(hào)不同。mRNA在真核細(xì)胞中的有效翻譯需要mRNA上一個(gè)名為Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)序列是mRNA的一段短核苷酸序列，位于起始密碼子之前，起始密碼子通常是AUG，編碼蛋白質(zhì)氨基端的甲硫氨酸。SD序列與16S rRNA(核糖體RNA)的3’端互補(bǔ)，可能是通過(guò)與該rRNA形成雙鏈體，使核糖體能正確定位，從而促進(jìn)mRNA結(jié)合核糖體。關(guān)于使基因表達(dá)最大化的綜述可參見(jiàn)Roberts和Lauer，Methods in Enzymology，68473(1979)，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
各種啟動(dòng)子的“強(qiáng)度”(即它們促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力)有所不同。為表達(dá)克隆基因的目的，為了獲得高水平的轉(zhuǎn)錄以及進(jìn)而高水平的基因表達(dá)，最好是使用強(qiáng)啟動(dòng)子。根據(jù)所利用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可以使用多種合適啟動(dòng)子中的任何一個(gè)。例如，當(dāng)在大腸桿菌、它的噬菌體或質(zhì)粒中進(jìn)行克隆時(shí)，可以使用以下啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)鄰近DNA區(qū)段的高水平轉(zhuǎn)錄如T7噬菌體啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、recA啟動(dòng)子、核糖體RNA啟動(dòng)子、大腸桿菌λ的PR和PL啟動(dòng)子以及其它啟動(dòng)子，包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等等。此外，可以使用雜種trp-lacUV5(tac)啟動(dòng)子或通過(guò)重組DNA技術(shù)或其它合成DNA技術(shù)產(chǎn)生的其它大腸桿菌啟動(dòng)子，提供給插入基因的轉(zhuǎn)錄。
可以選擇除非受到特異性誘導(dǎo)、否則抑制啟動(dòng)子作用的細(xì)菌宿主細(xì)胞株和表達(dá)載體。在某些操作中，加入特異性誘導(dǎo)物對(duì)于插入DNA的有效轉(zhuǎn)錄是必要的。例如，加入乳糖或IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，誘導(dǎo)lac操縱子。各種其它操縱子，如trp、pro等，處于不同的控制之下。
原核細(xì)胞中的有效基因轉(zhuǎn)錄和翻譯還需要特異性的起始信號(hào)。這些轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始信號(hào)可能在“強(qiáng)度”上有差異，它們的“強(qiáng)度”是分別根據(jù)合成的基因特異性的信使RNA的量以及蛋白的量來(lái)衡量的。包含一個(gè)啟動(dòng)子的DNA表達(dá)載體還可以包含任何組合的不同“強(qiáng)度”轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始信號(hào)。例如，大腸桿菌中的有效翻譯要求距起始密碼子(ATG)5’約7-9個(gè)堿基的一個(gè)SD序列，來(lái)提供一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)。因此，可以使用任何能被宿主細(xì)胞核糖體利用的SD-ATG組合。這樣的組合包括但不限于得自大腸桿菌噬菌體λ的cro基因或N基因、或得自大腸桿菌色氨酸E、D、C、B或A基因的SD-ATG組合。此外，可以使用任何用重組DNA技術(shù)或其它涉及插入合成核苷酸的技術(shù)產(chǎn)生的任何SD-ATG組合。
一旦已經(jīng)將分離的編碼過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的DNA分子克隆進(jìn)表達(dá)系統(tǒng)，就可以將其引入宿主細(xì)胞。根據(jù)所使用的載體/宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可以采用上面提到的各種形式的轉(zhuǎn)化進(jìn)行這樣的引入。合適的宿主細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌、病毒、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)、植物等等。
可以利用本發(fā)明的方法處理廣泛種類(lèi)的植物或它們的種子以促進(jìn)生長(zhǎng)。合適的植物包括雙子葉植物和單子葉植物。更具體地說(shuō)，有用的作物可以包括稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苦苣、甘藍(lán)、花椰菜、硬花球花椰菜、蕪菁、小蘿卜(radish)、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜(squash)、西葫蘆、綠皮南瓜、黃瓜、蘋(píng)果、梨、瓜、草莓、葡萄、樹(shù)莓、菠蘿、大豆、煙草、番茄、蜀黍以及甘蔗。合適的觀賞植物的例子有玫瑰、非洲紫苣苔屬(Saintpaulia)、牽牛花、天竺葵屬植物、一品紅、菊花、香石竹和百日草屬。
本發(fā)明的涉及應(yīng)用過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的方法在整株植株或植株部分，包括葉、莖、根等受到處理時(shí)，可以通過(guò)多種程序進(jìn)行。這可以(但不是必須)涉及將過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白滲入植株。合適的應(yīng)用方法包括在即將應(yīng)用誘發(fā)劑時(shí)表面施用(如高壓或低壓噴灑)、注入(injection)、撤粉、以及磨擦葉面。在處理植物種子時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施方案，可以通過(guò)表面施用(高壓或低壓噴灑)、包被、浸漬、撒粉或注入，來(lái)應(yīng)用過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。其它合適的應(yīng)用方法可以由本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員設(shè)想出，只要它們能產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白與植株或植物種子的細(xì)胞接觸。一旦用本發(fā)明的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理后，種子就可以種植在天然或人工土壤中，用常規(guī)程序培育以產(chǎn)生植株。按照本發(fā)明處理的種子繁殖出植株后，可以一次或多次施用過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白來(lái)處理這些植株，從而增強(qiáng)植株的生長(zhǎng)。這樣繁殖出來(lái)的植株本身又可用于產(chǎn)生種子或無(wú)性繁殖體(如插條)，這些種子和無(wú)性繁殖體可產(chǎn)生生長(zhǎng)增強(qiáng)的植株。
過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白可以按照本發(fā)明地單獨(dú)或與其它材料混合起來(lái)應(yīng)用到植物或植物種子上?；蛘撸梢栽趯⑦^(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白單獨(dú)應(yīng)用于植物，而在不同時(shí)間施用其它材料。
適于按照本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施方案處理植物或植物種子的組合物包含處于一種載體中的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。合適的載體包括水、水溶液、漿液或干粉。在這個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包含多于O.5nM的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
雖然并非必要，但這種組合物可以包含輔助的添加劑，包括肥料、殺蟲(chóng)劑、殺真菌劑、殺線蟲(chóng)劑、除草劑以及它們的混合物。合適的肥料包括(NH4)2NO3。合適的殺蟲(chóng)劑的一個(gè)例子是馬拉硫磷?？捎玫臍⒄婢鷦┌司ぁ?br> 其它合適的添加劑包括緩沖劑、潤(rùn)濕劑、包被劑和磨擦劑。這些材料可用于便利本發(fā)明的程序。另外，過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白可以與其它常規(guī)種用制劑和處理材料(包括粘土和多糖)一起應(yīng)用于植物種子。
在本發(fā)明另一種可選擇的涉及使用轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因種子的實(shí)施方案中，不必將一種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白局部應(yīng)用到植物或種子上。取而代之的是，依照本領(lǐng)域內(nèi)廣為人知的程序，如生物彈道學(xué)(biolistics)或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生用編碼一種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。合適的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的例子及它們的編碼DNA的核酸序列如前所公開(kāi)。一旦產(chǎn)生了這種類(lèi)型的轉(zhuǎn)基因植物，就可以按照常規(guī)程序培育這些植物，而編碼過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑的基因的存在會(huì)導(dǎo)致植物的生長(zhǎng)增強(qiáng)?；蛘撸瑥霓D(zhuǎn)基因植物中回收轉(zhuǎn)基因種子。然后可以將這些種子種植于土壤中，用常規(guī)程序培育產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。在可以有效賦予增強(qiáng)的生長(zhǎng)的條件下，由所種植的轉(zhuǎn)基因種子繁殖出轉(zhuǎn)基因植物。盡管不希望被理論所束縛，但這樣的生長(zhǎng)增強(qiáng)可以由RNA介導(dǎo)或由于表達(dá)誘發(fā)劑多肽或蛋白而得到。
當(dāng)依照本發(fā)明使用轉(zhuǎn)基因植物和植物種子時(shí)，它們還可以另外用其它材料處理，所述材料與在應(yīng)用過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白物時(shí)用于處理植物和種子的材料相同。這些其它材料，包括過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑，可以按上面提到的程序應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物和植物種子，包括高壓或低壓噴灑、注射、包被、撒粉和浸漬。類(lèi)似地，在從轉(zhuǎn)基因植物種子繁殖出植物后，可以一次或多次施用過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理這些植物來(lái)增強(qiáng)植物生長(zhǎng)。這樣的植物也可以用常規(guī)的植物處理劑(如殺蟲(chóng)劑、肥料等)進(jìn)行處理。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物能用于產(chǎn)生種子和無(wú)性繁殖體(如插條)，從所述種子或無(wú)性繁殖體可以產(chǎn)生生長(zhǎng)增強(qiáng)的植株。
實(shí)施例實(shí)施例1-用解淀粉歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理番茄種子對(duì)發(fā)芽率的影響將Marglobe番茄變種的種子浸泡在40ml解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑溶液(“harpin”)中。harpin如下制備培養(yǎng)包含質(zhì)粒pCPP2139(參見(jiàn)
圖1)的大腸桿菌株DH5，超聲處理裂解細(xì)胞，在沸水中保持5分鐘進(jìn)行熱處理，離心除去細(xì)胞碎片，然后沉淀蛋白和其它熱不穩(wěn)定的成分。連續(xù)稀釋得到的制備物(“CFEP”)。根據(jù)蛋白印跡分析，這些稀釋物(1∶40，1∶80，1∶160，1∶320和1∶640)分別含有20、10、5、2.5和1.25μgm/ml的harpin。在第0天，在一個(gè)生長(zhǎng)室中，于28℃下將種子在燒杯中的harpin或緩沖液中浸泡24小時(shí)。浸泡之后，在第1天將種子播種于裝有人工土壤的萌發(fā)盆中。這個(gè)程序按每種處理100粒種子進(jìn)行。
處理1.harpin(1∶40)(20μgm/ml)浸泡種子。
2.harpin(1∶80)(10μgm/ml)浸泡種子。
3.harpin(1∶160)(5μgm/ml)浸泡種子。
4.harpin(1∶320)(2.5μgm/ml)浸泡種子。
5.harpin(1∶640)(1.25μgm/ml)浸泡種子。
6.緩沖液(5mM KPO4，pH 6.8)浸泡種子。
表1-處理種子后幼苗的數(shù)目處理 發(fā)芽種子的數(shù)目第0天 第1天 第5天 第7天 第9天harpin(20μgm/ml)浸泡種子播種 43 57 59harpin(10μgm/ml)浸泡種子播種 43 52 52harpin(5μgm/ml)浸泡種子 播種 40 47 51harpin(2.5μgm/ml)浸泡種子 播種 43 56 58harpin(1.25μgm/ml)浸泡種子 播種 38 53 57緩沖液浸泡種子 播種 27 37 40如表1所示，用解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理番茄種子，減少了發(fā)芽所需時(shí)間并大大增加了發(fā)芽率。實(shí)施例2-用解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理番茄種子對(duì)番茄株高的影響第0天，在一個(gè)生長(zhǎng)室中，于28℃下將Marglobe番茄變種的種子浸泡于燒杯中的解淀粉歐文氏菌harpin(1∶15，1∶30，1∶60以及1∶120)或緩沖液中24小時(shí)。浸泡之后，在第1天將種子播種于裝有人工土壤的萌發(fā)盤(pán)中。
每種處理隨機(jī)選擇十株表現(xiàn)一致的植株并測(cè)量。用直尺測(cè)量幼苗從土壤表面到植株頂端的高度。
處理1.harpin(1∶15)(52μgm/ml)。2.harpin(1∶30)(26μgm/ml)。3.harpin(1∶60)(13μgm/ml)。4.harpin(1∶120)(6.5μgm/ml)。5.緩沖液(5mM KPO4，pH6.8)。
表2-處理種子之后15天的幼苗高度(cm)<
表3-處理種子之后21天的幼苗高度(cm
<p>表4-處理種子之后27天的幼苗高度(cm)
<p>表5-概要——處理后番茄植株的平均高度處理番茄植株的平均高度(cm)第0天 第1天 第15天 第21天 第27天harpin(1∶15)浸泡種子 播種5.7 7.7 10.5harpin(1∶30)浸泡種子 播種7.0 8.6 11.6harpin(1∶60)浸泡種子 播種5.9 6.9 9.7harpin(1∶120)浸泡種子播種5.4 6.7 9.5緩沖液浸泡種子播種5.3 6.5 10.0如表2-5所示，用解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理番茄種子增強(qiáng)了植物生長(zhǎng)。1∶30的稀釋物作用最大——幼苗高度增加16％。實(shí)施例3-用解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理番茄植株對(duì)番茄株高的影響當(dāng)Marglobe番茄植株4周大時(shí)，在一個(gè)生長(zhǎng)室中，于28℃下，每株植株噴灑6ml含13μgm/ml(1∶60)或8.7μgm/ml(1∶90)harpin的解淀粉歐文氏菌harpin溶液或噴灑6ml緩沖液(5mM KPO4)。噴灑harpin2周后(6周大的番茄植株)以及2周又5天后，測(cè)量番茄植株的高度。每種處理隨機(jī)選擇十株表現(xiàn)一致的植株并測(cè)量。用直尺測(cè)量幼苗從土壤表面到植株頂端的高度。
處理1.harpin(1∶60)(13μgm/ml)。
2.harpin(1∶90)(8.7μgm/ml)。
3.緩沖液(5mM KPO4，pH6.8)。
表6-harpin處理后番茄植株的平均高度操作與處理 番茄植株的平均高度(cm)第0天第14天第28天 第42天第47天播種 移栽 harpin 1∶6035.5 36.0(13μgm/ml)播種 移栽 harpin 1∶9035.7 36.5(8.7μgm/ml)播種 移栽 緩沖液 32.5 33.0如表6所示，用解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑噴灑番茄幼苗可以增強(qiáng)番茄植株的生長(zhǎng)。與緩沖液處理對(duì)照相比，記錄到這兩個(gè)劑量的待測(cè)過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑有相似的生長(zhǎng)增強(qiáng)。實(shí)施例4-用解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理番茄種子對(duì)番茄株高的影響第0天，在一個(gè)生長(zhǎng)室中，于28℃下將Marglobe番茄種子浸泡于燒杯中的解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑溶液(“harpin”)(1∶40，1∶80，1∶160，1∶320以及1∶640)或緩沖液中24小時(shí)。在harpin或緩沖液中浸泡種子之后，在第1天將它們播種于裝有人工土壤的萌發(fā)盤(pán)中。每種處理隨機(jī)選擇十株表現(xiàn)一致的植株并測(cè)量。用直尺測(cè)量幼苗從土壤表面到植株頂端的高度。
處理1.harpin(1∶40)(20μgm/ml)。
2.harpin(1∶80)(10μgm/ml)。
3.harpin(1∶160)(5μgm/ml)。
4.harpin(1∶320)(2.5μgm/ml)。
5.harpin(1∶640)(1.25μgm/ml)。
6.緩沖液(5mM KPO4，pH6.8)。
表7-處理種子之后12天的幼苗高度(cm)
表9-處理種子之后17天的幼苗高度(cm)
表10-概要——處理后番茄植株的平均高度操作和處理番茄植株的平均高度(cm)第0天第1天 第12天 第14天 第17天harpin(20μgm/ml)浸泡種子播種6.6 8.011.5harpin(10μgm/ml)浸泡種子播種6.6 8.413.2harpin(5μgm/ml)浸泡種子 播種6.3 9.213.5harpin(2.5μgm/ml)浸泡種子 播種6.2 8.412.0harpin(1.25μgm/ml)浸泡種子 播種6.2 8.211.9緩沖液浸泡種子 播種6.0 7.610.4
如表7-10所示，用解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理番茄種子可以增強(qiáng)番茄植株的生長(zhǎng)。1∶160的稀釋物(5μg/ml harpin)作用最大——幼苗高度比用緩沖液處理的植株增加超過(guò)20％。實(shí)施例5 用解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理番茄種子對(duì)種子發(fā)芽率的影響第0天，在一個(gè)生長(zhǎng)室中，于28℃下將Marglobe番茄種子浸泡于燒杯中的40ml解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑(“harpin”)溶液(來(lái)自大腸桿菌DH5(pCPP2139)的CFEP的1∶50或1∶100稀釋物，分別含有8μgm/ml和4μgm/ml的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑)或緩沖液中24小時(shí)。浸泡之后，在第1天將種子播種于裝有人工土壤的萌發(fā)盤(pán)中。每種處理進(jìn)行4盆，每盆內(nèi)有20粒種子。處理1.harpin(8μgm/ml)。2.harpin(8μgm/ml)。3.harpin(8μgm/ml)。4.harpin(8μgm/ml)。5.harpin(4μgm/ml)。6.harpin(4μgm/ml)。7.harpin(4μgm/ml)。8.harpin(4μgm/ml)。9.緩沖液(5mM KPO4，pH6.8)。10.緩沖液(5mM KPO4，pH6.8)。11.緩沖液(5mM KPO4，pH6.8)。12.緩沖液(5mM KPO4，pH6.8)。
表11-harpin處理后幼苗的數(shù)目操作和處理 發(fā)芽的種子的數(shù)目(樣本總數(shù)為20)第0天 第1第5天 第42第47天 天 天平均值 平均值 平均值harpin(8μgm/ml) 播種11 15 19harpin(8μgm/ml) 播種13 17 20harpin(8μgm/ml) 播種10 13 16harpin(8μgm/ml) 播種 9 10.8 15 15.0 1617.8harpin(4μgm/ml) 播種11 17 17harpin(4μgm/ml) 播種15 17 18harpin(4μgm/ml) 播種 9 12 14harpin(4μgm/ml) 播種 9 11.0 14 15.0 1616.3緩沖液播種11 11 14緩沖液播種 9 14 15緩沖液播種10 14 14緩沖液播種10 10.0 12 12.8 1414.3如表11所示，用解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理番茄種子可以提高番茄種子的發(fā)芽率和發(fā)芽水平。在試驗(yàn)最后看來(lái)，所使用的更高劑量看來(lái)比緩沖液更有效。實(shí)施例6-用從包含過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑編碼構(gòu)成物pCPP2139或質(zhì)粒載體pCPP50的大腸桿菌制備的蛋白處理番茄種子對(duì)植株生長(zhǎng)的影響將Marglobe番茄種子浸泡在解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑(“harpin”)(得自大腸桿菌DH5α(pCPP2139)(
圖1))制備物中，或浸泡于作為對(duì)照、添加了BSA蛋白的載體制備物(得自DH5α(pCPP50)(圖2))。所述對(duì)照載體制備物每ml包含33.6μlBSA(10mg/ml)，以提供與pCPP2139制備物所包含的harpin等量的蛋白。第1天，在燒杯中制備1∶50(8.0μg/ml)、1∶100(4.0μg/ml)和1∶200(2.0μg/ml)的稀釋物，并在一個(gè)受控制的環(huán)境室中于28℃下將種子浸泡24小時(shí)。浸泡之后，在第2天將種子種植在裝有人工土壤的萌發(fā)盤(pán)中。移栽后每種處理隨機(jī)選擇表現(xiàn)一致的10株植株，并在三個(gè)時(shí)間進(jìn)行測(cè)量。用直尺測(cè)量幼苗從土壤表面到植株頂端的高度。
處理1.harpin1∶50 (8.0μg/ml)2.harpin1∶100(4.0μg/ml)3.harpin1∶200(2.0μg/ml)4.載體+BSA 1∶50 (0 harpin)5.載體+BSA 1∶100(0 harpin)6.載體+BSA 1∶200(0 harpin)
表12-種子處理后18天的幼苗高度(cm)
表13-種子處理后22天的幼苗高度(cm)
表14-種子處理后26天的幼苗高度(cm)<
表15-處理后番茄植株的平均高度操作和處理 番茄植株的平均高度(cm)第1天 第2天 第18天 第22天 第26天harpin(1∶50) (8.0μgm/ml)播種4.75.2 8.5harpin(1∶100)(4.0μgm/ml)播種5.87.211.2harpin(1∶200)(4.0μgm/ml)播種5.17.010.8載體+BSA(1∶50) (0) 播種4.95.8 9.2載體+BSA(1∶100) (0) 播種4.85.7 9.3載體+BSA(1∶200) (0) 播種4.95.9 9.0
如表12-15所示，用包含編碼解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑的基因的大腸桿菌處理，可以增強(qiáng)番茄植株的生長(zhǎng)。1∶100的稀釋物(4.0μg/ml)作用最大，而更高濃度和更低濃度作用要小。用4.0μg/mlharpin處理與用含有類(lèi)似量非harpin蛋白的載體對(duì)照制備物處理相比，平均幼苗高度增加了約20％。由大腸桿菌株DH5α(pCPP50)(其帶有大腸桿菌株DH5α(pCPP2139)的hrpN基因的載體)得到的細(xì)胞裂解制備物的成分并不具有與包含harpin的制備物相同的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，即使假設(shè)其中補(bǔ)充了與含大量harpin蛋白的DH5α(pCPP2139)制備物相同水平的BSA蛋白。實(shí)施例7-用從包含過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑編碼構(gòu)成物pCPP2139或其質(zhì)粒載體pCPP50的大腸桿菌制備的蛋白處理番茄種子對(duì)番茄植株生長(zhǎng)的影響第1天，在一個(gè)生長(zhǎng)室中，于28℃下將Marglobe番茄種子浸泡于燒杯中的解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑溶液(“harpin”)(得自harpin編碼質(zhì)粒pCPP2139載體)以及包含pCPP50載體的溶液的1∶25、1∶50、以及1∶100的稀釋物中24小時(shí)。浸泡種子之后，在第2天，將它們種植于裝有人工土壤的萌發(fā)盤(pán)中。每種處理隨機(jī)選擇十株表現(xiàn)一致的植株并測(cè)量。用直尺測(cè)量幼苗從土壤表面到植株頂端的高度。
處理1.harpin 16μgm/ml2.harpin 8μgm/ml3.harpin 4μgm/ml4.載體16μgm/ml5.載體8μgm/ml6.載體4μgm/ml
表16-種子處理后11天的幼苗高度(cm)
<p>表17-種子處理后14天的幼苗高度(cm)
<p>表18-處理后番茄植株的平均高度操作和處理 番茄植株的平均高度(cm)第1天 第2天 第11天 第14天harpin浸泡種子(16μgm/ml) 播種 4.5 7.4harpin浸泡種子(8μgm/ml) 播種 5.5 8.2harpin浸泡種子(4μgm/ml) 播種 5.1 7.9載體浸泡種子(16μgm/ml)播種 4.5 6.7載體浸泡種子(8μgm/ml) 播種 4.4 6.7載體浸泡種子(4μgm/ml) 播種 4.3 6.4如表16-18所示，用解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理可以增強(qiáng)番茄植株的生長(zhǎng)。1∶50稀釋物(8.0μg/ml過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑)作用最大，其中幼苗高度比對(duì)照增加了約20％。實(shí)施例8-無(wú)細(xì)胞解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)的作用在各自單獨(dú)的容器中將馬鈴薯變種Norchip由塊莖培養(yǎng)成3周大的植株。每株植株的葉面噴灑以1∶50、1∶100和1∶200稀釋的包含解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑(“harpin”)的溶液，或噴灑以1∶50、1∶100和1∶200稀釋的包含大腸桿菌蛋白和載體pCPP50的蛋白的對(duì)照溶液(“載體”)。在第20天，為以下每項(xiàng)處理隨機(jī)選擇12株表現(xiàn)一致的植株。將每種處理的一株植株在16℃下維持在一個(gè)生長(zhǎng)室中，兩株植株在18-25℃下維持在一個(gè)溫室臺(tái)上。處理后25天，分別測(cè)量所有植株的苗(莖)。
處理1.harpin 1∶50 16μgm/ml2.harpin 1∶100 8μgm/ml3.harpin 1∶200 4μgm/ml4.載體1∶50 0 harpin5.載體1∶100 0 harpin6.載體1∶200 0 harpin
表19-16℃下馬鈴薯植株莖的長(zhǎng)度第20天的處理 第45天馬鈴薯莖的長(zhǎng)度(cm)莖1 莖2 莖3 莖4 莖5 莖6 植株平均值harpin 1∶50 43.039.542.534.038.039.539.4harpin 1∶10042.038.5 (2分枝) 40.3harpin 1∶20035.530.531.5 (3分枝) 32.5載體1∶5034.032.031.528.027.5 (5分枝) 30.6載體1∶100 30.033.533.030.028.033.031.3載體1∶200 33.531.532.5 (3分枝) 32.5表20-溫室臺(tái)上馬鈴薯植株莖的長(zhǎng)度第20天的處理 第45天馬鈴薯莖的長(zhǎng)度(cm)莖1 莖2 莖3 莖4 莖5 莖6植株 處理平均值harpin 1∶50 65.558.557.562.568.5 (5分枝) 62.5harpin 1∶50 62.567.065.069.0 (4分枝) 65.964.2harpin 1∶10070.573.574.080.5 (4分枝) 74.6harpin 1∶10083.080.576.576.081.5 (5分枝) 79.577.1harpin 1∶20056.559.550.553.055.548.053.9harpin 1∶20057.059.569.5 (3分枝) 62.058.0載體1∶5053.062.059.562.5 (4分枝) 59.3載體1∶5052.046.061.556.561.557.055.857.6載體1∶100 62.051.566.067.562.063.062.0載體1∶0061.562.559.065.563.063.562.562.3載體1∶200 62.066.0 (2分枝) 64.0載體1∶200 61.060.063.5 (3分枝) 61.562.8
如表19和20所示，用解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理馬鈴薯植株增強(qiáng)了苗(莖)的生長(zhǎng)。因此，根據(jù)莖的數(shù)目以及平均長(zhǎng)度判斷，在溫室和生長(zhǎng)室培育的植株中，harpin處理的植株的總生長(zhǎng)都要強(qiáng)。用中等劑量harpin(8.0μg/ml)處理的馬鈴薯植株看起來(lái)比用更高或更低劑量處理的植株在莖生長(zhǎng)上增強(qiáng)更多。在兩種生長(zhǎng)條件下，用中等劑量的harpin處理導(dǎo)致更強(qiáng)的生長(zhǎng)。實(shí)施例9-用包含解淀粉歐文氏菌harpin的無(wú)細(xì)胞誘發(fā)劑制備物噴灑番茄的作用將Marglobe植株移栽后8天，噴灑harpin制備物(得自大腸桿菌DH5α(pCPP2139))，或噴灑添加了BSA蛋白的載體制備物(得自大腸桿菌DH5α(pCPP50))作為對(duì)照。所述對(duì)照載體制備物每ml包含33.6μl BSA(10mg/ml)，以提供與pCPP2139制備物所包含的harpin等量的蛋白。制備1∶50(8.0μg/ml)、1∶100(4.0μg/ml)和1∶200(2.0μg/ml)的制備物，并用一臺(tái)電動(dòng)噴霧器噴灑到植株上直至形成溢流。每種處理隨機(jī)選擇15株表現(xiàn)一致的植株并分配進(jìn)行處理。將這些植株在處理前和處理后于28℃下維持在一個(gè)受控制的環(huán)境室中。
處理后幾次測(cè)量從土壤表面到植株頂端的總高度。在接近土壤表面切斷莖后，立即稱(chēng)量番茄植株地上部分的重量。
處理(稀釋度和harpin含量)1.harpin1∶50 (8.0μg/ml)2.harpin1∶100(4.0μg/ml)3.harpin1∶200(2.0μg/ml)4.載體+BSA 1∶50 (0 harpin)5.載體+BSA 1∶100(0 harpin)6.載體+BSA 1∶200(0 harpin)
表21-噴灑處理后1天的番茄株高(cm)
表22-噴灑處理后15天的番茄株高(cm)
表23-噴灑處理后21天的番茄株高(cm)
表24-噴灑后番茄植株的平均高度處理(烯釋度和harpin含量) 番茄植株的平均高度(cm)處理后的天數(shù)第1天 第11天 第14天harpin 1∶50 (8.0μg/ml)5.1622.2 28.1harpin 1∶100 (4.0μg/ml)5.1527.5 37.5harpin 1∶200 (2.0μg/ml)5.1326.0 33.2載體+BSA 1∶50(0)5.1521.7 28.5載體+BSA 1∶100 (0)5.1321.4 28.6載體+BSA 1∶200 (0)5.1621.8 28.7
表25-噴灑處理后21天番茄植株的鮮重(g/植株)
通常，用harpin單次噴灑番茄幼苗比用補(bǔ)充了BSA蛋白的對(duì)照(載體)制備物噴灑處理導(dǎo)致更強(qiáng)的后續(xù)生長(zhǎng)。harpin處理的植株的增強(qiáng)的生長(zhǎng)在株高測(cè)量和鮮重測(cè)量中都看得出來(lái)。在三個(gè)測(cè)試過(guò)的濃度中，兩個(gè)較低濃度導(dǎo)致比高劑量(8.0μg/ml)更強(qiáng)的植株生長(zhǎng)(基于兩種測(cè)量中的任一種)。用兩個(gè)較低濃度(2和4μg/ml)處理的植株之間的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有區(qū)別。由大腸桿菌株DH5α(pCPP50)(其帶有大腸桿菌株DH5α(pCPP2139)的hrpN基因的載體)得到的細(xì)胞裂解制備物的組分并不具有與包含harpin的制備物相同的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，即使其中補(bǔ)充了與含大量harpin蛋白的DH5α(pCPP2139)制備物相同水平的BSA蛋白。因此，這個(gè)試驗(yàn)表明，harpin是植物生長(zhǎng)增強(qiáng)的原因。實(shí)施例10-小果的早著色和早熟進(jìn)行一個(gè)大田試驗(yàn)以評(píng)價(jià)過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑(“harpin”)處理對(duì)樹(shù)莓栽培品種Candy產(chǎn)量和成熟參數(shù)的作用。在每個(gè)40英尺長(zhǎng)×3英尺寬(1植株寬)的小區(qū)中，移植生長(zhǎng)(established)的植株用harpin以2.5mg/10平方英尺處理、不處理(“對(duì)照”)、或用工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品Ronilan以推薦比率處理(“Ronilan”)。處理重復(fù)四次并安排在同一個(gè)試驗(yàn)田位點(diǎn)重復(fù)進(jìn)行。處理在5-10％開(kāi)花時(shí)開(kāi)始，然后以7-10天的間隔再施用兩次。頭兩次收成用于評(píng)估病害的防治，由后兩次收成收集果實(shí)產(chǎn)量數(shù)據(jù)。觀察表明，harpin處理的果實(shí)比不處理的果實(shí)更大并顯示紅色更深，這表明成熟被加速了1-2周。此時(shí)確定最少有10枚果實(shí)的每個(gè)樹(shù)叢上成熟果實(shí)的數(shù)目并概括在表26中。harpin處理的小區(qū)中每10-莓樹(shù)叢的成熟果實(shí)比對(duì)照或Ronilan處理的小區(qū)都多。而后兩次收獲的合并產(chǎn)量表明，用harpin處理以及用Ronilan處理的小區(qū)比未處理的對(duì)照產(chǎn)量增加(表27)。
表26-1996年6月20日在有十枚或十枚以上漿果的植株上每叢成熟樹(shù)莓果實(shí)的數(shù)目處理 成熟果實(shí)/10漿果叢與對(duì)照相比的百分?jǐn)?shù)％對(duì)照2.75 100.0Ronilan 2.75 100.0harpin 7.25 263.6表27-綜合最后兩次收獲的平均樹(shù)莓果實(shí)產(chǎn)量(重量)(磅)處理 總產(chǎn)量 與對(duì)照相比的百分?jǐn)?shù)％對(duì)照32.5 100.0Ronilan 37.5 115.4harpin 39.5 121.5實(shí)施例11-對(duì)食莢菜豆的生長(zhǎng)增強(qiáng)采用各種方法處理食莢菜豆變種Bush Blue Lake，并種植在裝滿(mǎn)商品化盆載混合土的25cm直徑的塑料盆中，放置于一個(gè)開(kāi)放溫室中，評(píng)價(jià)各生長(zhǎng)參數(shù)。處理包括不處理的菜豆種子(“對(duì)照”)；用以水作稀釋劑制備的1.5％甲基纖維素漿液處理種子(“M/C”)；先用1.5％甲基纖維素處理種子、再葉上施用0.125mg/ml的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑(“harpin”)(“M/C+H”)；以及用1.5％甲基纖維素處理加上每50粒種子5.0μg harpin噴灑harpin干粉、然后葉上施用0.125mg/ml的harpin (“M/C-SD+H”)。在第0天播種種子，每盆3粒種子，在發(fā)芽時(shí)間苗至每盆1株植株。處理重復(fù)10次，并在一間開(kāi)放溫室內(nèi)通過(guò)重復(fù)(by rep)來(lái)隨機(jī)化。64天后收獲豆莢，收集具有可售大小(大?。?0cm×5cm)的豆莢的鮮重作為產(chǎn)量。采用用于區(qū)分處理平均值的Fisher氏LSD進(jìn)行方差分析，分析數(shù)據(jù)。
表28-采用各種方法用解淀粉歐文氏菌harpin處理對(duì)市售大小的食莢菜豆豆莢產(chǎn)量的作用處理 可售產(chǎn)量，g1與不處理的植株(對(duì)照)相比的百分?jǐn)?shù)％M/C-SD+H 70.6 a 452M/C-H58.5 ab 375M/C 46.3 bc 297M/C+H42.3 bc 271M/C-SD 40.0 cd 256對(duì)照 15.6 e 1001可售產(chǎn)量包括所有10cm×0.5cm或更大的菜豆豆莢。根據(jù)Fisher氏LSD，后面帶有相同字母的平均值在P＝0.05的水平上沒(méi)有顯著差異。
如表28所示，用各種應(yīng)用方法施用解淀粉歐文氏菌harpin，導(dǎo)致可售大小的食莢菜豆豆莢增產(chǎn)。單獨(dú)用甲基纖維素處理也導(dǎo)致菜豆增產(chǎn)，但當(dāng)其與harpin組合用于種子處理(噴灑干粉)和葉處理時(shí)，產(chǎn)量明顯增加。實(shí)施例12-對(duì)黃瓜葉施用HP-1000TM得到的黃瓜增產(chǎn)以15、30或60μg/ml活性成分(a.i.)的比率葉噴灑HP-1000TM(EDEN Bioscience，Bothell，Washington)(解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑制劑)，處理黃瓜幼苗及移植體。在第一片真葉完全伸展時(shí)進(jìn)行第一次噴灑。第一次噴灑后10天進(jìn)行第二次應(yīng)用。所有噴灑都應(yīng)用一臺(tái)背攜式噴霧器進(jìn)行，試驗(yàn)還包括一個(gè)不處理的對(duì)照(UTC)。第二次施用HP-1000TM后3天，將來(lái)自每種處理的十株植株移栽到隨機(jī)化的田間小區(qū)中，重復(fù)三次。這產(chǎn)生了每種處理總共30株植株。移栽后七天，第三次葉噴灑HP-1000TM。雖然隨后的嚴(yán)重干旱導(dǎo)致顯著的用水脅迫，但遵循標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)化(commercial)收割模式進(jìn)行了總共六次收割。從每種處理收獲得的果實(shí)總重都顯示在表29中。結(jié)果表明，用比率為15和30μg/ml的HP-1000TM處理的植株產(chǎn)出了比UTC明顯更多的果實(shí)。用HP-1000TM處理的植株產(chǎn)生了中度的增產(chǎn)。這些結(jié)果表明，HP-1000TM處理的植株顯著地比不處理的植株更耐受干旱的惡劣條件。
表29-HP-1000TM處理后得到的黃瓜增產(chǎn)處理 比率1產(chǎn)量2，磅/10株 高于UTC的％UTC---9.7a---HP-1000TM15μg/ml 25.4b 161.4HP-1000TM30μg/ml 32.6c 236.4HP-1000TM60μg/ml 11.2a 15.91活性成分(a.i.)。2根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。實(shí)施例13-由HP-1000TM處理得到的棉花增產(chǎn)在一個(gè)隨機(jī)完全區(qū)組(RCB)大田試驗(yàn)中，將棉花種植在四塊一樣的12×20英尺田間小區(qū)中。用HP-1000TM(EDEN Bioscience)(解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑制劑)、HP-1000TM+Pix(Pix(BASFCorp.，Mount Olive，N.J.)是一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，施用以保持棉花植株高度上的堅(jiān)實(shí)(compact in height))或Early Harvest(Griffen Corp.，Valdosta，Ga.)(一種競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)增強(qiáng)劑)處理植株。試驗(yàn)還包括一個(gè)不處理的對(duì)照(UTC)。使用一臺(tái)背攜式噴霧器在作物的三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期(第一片真葉、開(kāi)花前、花期早期)進(jìn)行所有的葉施用處理。在所有處理中，所有肥料和除草產(chǎn)品都根據(jù)常規(guī)的農(nóng)業(yè)實(shí)踐施用。收獲前十周，HP-1000TM處理的植株與其它處理的植株相比，每株植株上棉桃的數(shù)目要顯著更高。收獲時(shí)，HP-1000TM處理與UTC相比，顯示出皮棉產(chǎn)量顯著增加(43％)(表30)。當(dāng)HP-1000TM與Pix組合使用時(shí)，皮棉產(chǎn)量比UTC增加20％。由于Pix普遍應(yīng)用于大面積的棉花，這個(gè)結(jié)果表明，HP-1000TM可以與Pix成功地進(jìn)行化學(xué)液體混合(tankmixed)。與UTC相比，應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)增強(qiáng)劑Early Harvest，皮棉產(chǎn)量?jī)H增加9％。
表30-用HP-1000TM、HP-1000TM+Pix或Early Harvest處理后得到的皮棉產(chǎn)量增加處理比率1皮棉產(chǎn)量 高于UTC的％(磅/英畝)UTC --- 942.1---Early Harvest 2盎司/英畝 1,077.4*14.3HP-1000TM+Pix 40μg/ml+8盎司/英畝 1,133.1*20.4HP-1000TM40μg/ml1,350.0*43.3(*在P＝0.05的水平上有顯著差異) lsd＝122.41HP-1000TM的比率是指活性成分(a.i.)的比率；Early Harvest和Pix的比率是指制成品的比率。實(shí)施例14-由HP-1000TM處理得到中國(guó)茄子(Chinese eggplant)的增產(chǎn)向苗圃中培育的Chinese egg植株幼苗以15、30或60μg/ml(a.i.)噴灑一次HP-1000TM(EDEN Bioscience)(解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑制劑)，然后移植到田間小區(qū)中，每種處理重復(fù)三次。移栽后兩周，第二次施用HP-1000TM。第二次噴灑后約兩周，第三次即最后一次施用HP-1000TM。所有噴灑都使用一臺(tái)背攜式噴霧器進(jìn)行；試驗(yàn)還包括一個(gè)不處理的對(duì)照(UTC)。隨著季節(jié)的變換，每種處理共收獲八次。從這些收成得到的數(shù)據(jù)表明，用HP-1000TM處理導(dǎo)致單株果實(shí)產(chǎn)量更高。
表31-HP-1000TM處理后中國(guó)茄子植株的增產(chǎn)處理 比率(活性成分) 產(chǎn)量(磅/株) 高于UTC的％UTC--- 1.45 ---HP-1000TM15μg/ml2.03 40.0HP-1000TM30μg/ml1.90 31.0HP-1000TM60μg/ml1.95 34.5實(shí)施例15-由用HP-1000TM處理得到的稻增產(chǎn)將稻幼苗移栽進(jìn)田間小區(qū)中，重復(fù)三次，然后用一臺(tái)背攜式噴霧器以三種不同比率葉噴灑HP-1000TM(EDEN Bioscience)(解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑制劑)進(jìn)行處理。試驗(yàn)中還包括一個(gè)不處理的對(duì)照(UTC)。移栽后1周第一次施用HP-1000TM，第一次施用三周后進(jìn)行第二次施用。在稻粒剛好開(kāi)始灌漿之前，進(jìn)行第三次即最后一次噴灑。收獲的結(jié)果顯示，以30和60μg/ml葉施用HP-1000TM分別顯著增產(chǎn)47％和56％(表32)。
表32-用HP-1000TM葉處理后得到的稻增產(chǎn)處理 比率(活性成分) 產(chǎn)量1(磅/英畝) 高于UTC的％UTC---3,853a ---HP-1000TM15μg/ml 5,265ab35.9HP-1000TM30μg/ml 5,710b 47.3HP-1000TM60μg/ml 6,043b 56.11根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。實(shí)施例16-由HP-1000TM處理得到的大豆增產(chǎn)將大豆種植進(jìn)隨機(jī)化的田間小區(qū)中，每種處理重復(fù)三次。使用一臺(tái)背攜式噴霧器葉噴灑HP-1000TM(EDEN Bioscience)(解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑制劑)，試驗(yàn)中還包括一個(gè)不處理的對(duì)照(UTC)。在四片真葉期，植株約八英寸高時(shí)，開(kāi)始以三個(gè)比率施用HP-1000TM。第一次噴灑后10天第二次噴灑HP-1000TM，第二次噴灑10天后進(jìn)行第三次噴灑。第一次噴灑處理10天后測(cè)量到的株高表明，HP-1000TM應(yīng)用導(dǎo)致生長(zhǎng)顯著增強(qiáng)(表33)。此外，用60μg/ml比率的HP-1000TM處理的植株比其它處理的植株早5天開(kāi)始開(kāi)花。第三次噴灑后約十天，計(jì)數(shù)每次重復(fù)的十株隨機(jī)選出的植株上單株大豆豆莢的數(shù)目。這些結(jié)果表明，由HP-1000TM處理得到的生長(zhǎng)增強(qiáng)導(dǎo)致顯著更高的產(chǎn)量(表34)。
表33-用HP-1000TM葉處理后大豆株高的增加處理 比率(活性成分) 株高1(英寸) 高于UTC的％UTC--- 12.2a---HP-1000TM15μg/ml 13.2b 8.3HP-1000TM30μg/ml 14.1c16.2HP-1000TM60μg/ml 14.3c17.31根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。
表34-用HP-1000TM葉處理后大豆結(jié)英(pod set)增加處理 比率(活性成分) 豆莢數(shù)/株1(英寸) 高于UTC的％UTC --- 41.1a---HP-1000TM15μg/ml 45.4ab10.4HP-1000TM30μg/ml 47.4b 15.4HP-1000TM60μg/ml 48.4b 17.71根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。實(shí)施例17-由HP-1000TM處理得到的草莓增產(chǎn)用HP-1000TM(EDEN Bioscience)(解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑制劑)對(duì)兩個(gè)草莓變種Camarosa和Selva進(jìn)行兩個(gè)大田試驗(yàn)。在一塊工業(yè)化生產(chǎn)草莓的田中，為每個(gè)變種的每種處理建立一個(gè)具有四個(gè)重復(fù)小區(qū)(5.33×10英尺)的隨機(jī)完全區(qū)組(RCB)設(shè)計(jì)。每個(gè)小區(qū)中雙行布置種植草莓植株。試驗(yàn)還包括一個(gè)不處理的對(duì)照。在施用開(kāi)始前，所有植株都摘凈花和漿果。使用一臺(tái)背攜式噴霧器每六周?chē)姙?0μg/ml比率的HP-1000TM。在每次噴灑應(yīng)用之前，收獲每種處理得到的所有成熟果實(shí)、稱(chēng)重并根據(jù)商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)級(jí)。對(duì)Selva草莓植株第一次施用HP-1000TM后三周內(nèi)，生長(zhǎng)增強(qiáng)可目視辨別為更大的地上生物量以及更茁壯、更綠和更健康的外觀。六次收獲之后(即這些植株的計(jì)劃壽命)，合計(jì)所有產(chǎn)量的數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。對(duì)于Camarosa變種，平均最后四次采摘量時(shí)，HP-1000TM處理的植株得到可售果實(shí)的產(chǎn)量比UTC顯著增加(27％)(表35)。該變種各處理的頭兩次采摘量之間并不表現(xiàn)顯著差異。Selva變種更易受到HP-1000TM處理的生長(zhǎng)增強(qiáng)作用的影響；平均六次采摘量后，Selva草莓變種與UTC相比，產(chǎn)生了具統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的多64％的可售果實(shí)。
表35-用HP-1000TM葉處理后得到的草莓增產(chǎn)處理 比率(活性成分) 產(chǎn)量1(磅/重復(fù)) 高于UTC的％變種CamarosaUTC---1.71a ---HP-1000TM40μg/ml 2.17b 27變種SelvaUTC---0.88a ---HP-1000TM40μg/ml 1.44b 641根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。實(shí)施例18-由HP-1000TM處理得到的番茄更早成熟和增產(chǎn)在一塊工業(yè)化番茄生產(chǎn)田中，在一個(gè)隨機(jī)完全區(qū)組(RCB)大田試驗(yàn)中將新鮮市售番茄(Solar Set變種)種植在小區(qū)(2×30英尺)中，重復(fù)5次。處理包括HP-1000TM(EDEN Bioscience)(解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑制劑)、一種試驗(yàn)性的競(jìng)爭(zhēng)性產(chǎn)品(ActigardTM(Novartis，Greensboro，N.C.))以及用于病害防治的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品(Kocide(GriffenCorp.，Valdosta，GA))+Maneb(DuPont Agricultural Products，Wilmington，D.E.))。HP-1000TM的首次施用是在移栽后立即將50ml浸液(drench)(30μg/ml活性成分)直接澆在幼苗上。此后，使用一臺(tái)背攜式噴霧器每11周應(yīng)用葉噴灑。移栽后約六周對(duì)所有處理進(jìn)行第一次收獲，并且每種處理只收獲完全紅的、成熟的番茄。結(jié)果表明，HP-1000TM處理的植株有顯著更大量的番茄可供第一次收獲(表36)。由HP-1000TM處理的植株收獲到的番茄估計(jì)比其它處理的早10-14天。表36-用HP-1000TM葉處理后第一次收獲時(shí)番茄產(chǎn)量的增加處理 比率(活性成分)1產(chǎn)量2(磅/重復(fù)) 高于UTC的％UTC---0.61a ---HP-1000TM30μg/ml 2.87b 375ActigardTM14g/英畝 0.45a -25.1Kocide+2磅/英畝 0.31a -49.1Maneb 1磅/英畝1Kocide和Maneb的比率是針對(duì)制成品而言的。2根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。實(shí)施例19-用HP-1000TM處理的草莓種植在未熏蒸土壤中時(shí)早開(kāi)花和生長(zhǎng)增強(qiáng)在一個(gè)隨機(jī)完全區(qū)組大田試驗(yàn)中，將草莓植株(“plugs”和“裸根”)栽培品種Commander移栽到小區(qū)(2×30英尺)中，重復(fù)5次。在每塊重復(fù)小區(qū)中移栽約六十株植株。這次大田試驗(yàn)進(jìn)行如下處理處理 應(yīng)用方法HP-1000TM將植株移栽進(jìn)未煙熏蒸的土壤1后，立即將(plug植株) 40μg/ml(活性成分)的50-ml HP-1000TM(EDEN Bioscience)(解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑制劑)浸液直接澆到各植株上，然后每14天葉應(yīng)用40μg/ml的HP-1000TM。HP-1000TM在就要將植株移栽進(jìn)未熏蒸的土壤1之前用40(裸根植株) μg/ml的HP-1000TM溶液浸泡根1小時(shí)，然后每14天葉應(yīng)用40μg/ml的HP-1000TM。溴代甲烷/氯化苦在移栽前通過(guò)注入法以300磅/英畝的比率進(jìn)75/25 行土壤熏蒸，不應(yīng)用HP-1000TM處理Telone/氯化苦 在移栽前通過(guò)注入法以45加侖/英畝的比率70/30 進(jìn)行土壤熏蒸，不應(yīng)用HP-1000TM處理不處理的對(duì)照(UTC) 不熏蒸，不應(yīng)用HP-1000TM處理1此前未熏蒸的土壤已經(jīng)種植野豌豆兩年。
在晚秋，當(dāng)寒冷天氣可能減緩植物生長(zhǎng)時(shí)，進(jìn)行移栽。移栽后兩周，用一臺(tái)背攜式噴霧器以40μg/ml(活性成分)第一次葉施用HP-1000TM。移栽后三周，計(jì)數(shù)每次重復(fù)中所有草莓“塞子”植株上花的數(shù)目，將HP-1000TM處理與溴代甲烷處理和UTC作比較，收集初步結(jié)果。由于“裸根”植株上還未出現(xiàn)開(kāi)花，因此通過(guò)測(cè)量3-葉叢中間一片葉子從葉尖到莖的距離，評(píng)價(jià)每次重復(fù)該處理中每株植株的早期葉生長(zhǎng)。結(jié)果(表37和38)表明，用HP-1000TM處理分別為“塞子”和“裸根”草莓植株提供了早期增強(qiáng)的花生長(zhǎng)和葉大小。表37-HP-1000TM葉處理后得到的“plug”草莓移植體的早開(kāi)花處理比率(活性成分) 花數(shù)/重復(fù)1高于UTC的％UTC ---2.0a ---HP-1000TM40μg/ml 7.5b 275溴代甲烷/氯化苦 300磅/英畝5.3b 1631根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。表38-HP-1000TM葉處理后得到的“裸根”草莓移植體的葉生長(zhǎng)增強(qiáng)處理比率(活性成分) 葉長(zhǎng)度1(英寸) 高于UTC的％UTC --- 1.26a ---HP-1000TM40μg/ml1.81b 441根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。實(shí)施例20-施用HP-1000TM得到的Jalapeno胡椒的早期生長(zhǎng)增強(qiáng)將Jalapeno胡椒(栽培品種Mittlya)的移植體用HP-1000TM(EDENBioscience)(解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑制劑)(30μg/ml a.i.)的根浸液處理1小時(shí)，然后移栽進(jìn)隨機(jī)化的田間小區(qū)中，重復(fù)四次。試驗(yàn)還包括一個(gè)不處理的對(duì)照(UTC)。從移栽后14天開(kāi)始，用一臺(tái)背攜式噴霧器以14天的間隔對(duì)受處理的植株三次葉噴灑HP-1000TM。第三次施用HP-1000TM后一周(移栽后54天)，測(cè)量每個(gè)重復(fù)的四株隨機(jī)選出的植株的株高。這些測(cè)量的結(jié)果表明，HP-1000TM處理過(guò)的植株約比UTC植株高約26％(表39)。此外還計(jì)數(shù)了每株植株的芽數(shù)、花數(shù)或果實(shí)數(shù)。這些結(jié)果表明，HP-1000TM處理過(guò)的植株比UTC植株多61％以上的花、果實(shí)或芽(表40)。
表39-HP-1000TM處理后得到的Jalapeno胡椒株高的增加處理 比率(活性成分) 株高1(英寸) 高于UTC的％UTC--- 7.0a ---HP-1000TM30μg/ml8.6b23.61根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。表40-HP-1000TM處理后Jalapeno胡椒的花數(shù)、果實(shí)數(shù)或芽數(shù)的增加處理 比率(活性成分) 花數(shù)、果實(shí)數(shù)或 高于UTC的％芽數(shù)/株1UTC--- 20.6a ---HP-1000TM30μg/ml12.8b 61.31根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。實(shí)施例21-應(yīng)用HP-1000TM得到的煙草生長(zhǎng)增強(qiáng)將煙草幼苗移栽進(jìn)隨機(jī)化的田間小區(qū)，重復(fù)三次。移栽后，以三個(gè)比率之一(15、30或60μg/ml活性成分)葉噴灑HP-1000TM(EDENBioscience)(解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑制劑)。六十天之后，第二次葉施用HP-1000。第二次施用后兩天，對(duì)每種處理的10株隨機(jī)選出的植株測(cè)量株高、計(jì)數(shù)單株葉數(shù)并測(cè)量葉大小(面積)。這些測(cè)量的結(jié)果表明，用HP-1000TM進(jìn)行處理顯著增強(qiáng)了煙草植物的生長(zhǎng)(表41、42和43)。株高增加了6-13％，同時(shí)用HP-1000TM以30和60μg/ml處理的植株平均單株葉數(shù)比UTC多1片以上。然而，最顯著的是，用HP-1000TM以15、30和60μg/ml處理導(dǎo)致葉面積的相應(yīng)增加。單株葉數(shù)多1片和平均葉大小(面積)增加的煙草植株表現(xiàn)出商業(yè)性的顯著反應(yīng)。
表41-HP-1000TM處理后煙草株高的增加處理 比率(活性成分) 株高(cm) 高于UTC的％UTC --- 72.0---HP-1000TM15μg/ml76.45.3HP-1000TM30μg/ml79.29.0HP-1000TM60μg/ml81.36.9表42-HP-1000TM處理后煙草單株葉數(shù)的增加處理 比率(活性成分) 葉數(shù)/株1高于UTC的％UTC --- 16.8---HP-1000TM15μg/ml17.43.6HP-1000TM30μg/ml18.17.7HP-1000TM60μg/ml17.96.5表43-HP-1000TM處理后煙草葉面積的增加處理 比率(活性成分) 葉面積(cm2) 高于UTC的％UTC --- 1,246---HP-1000TM15μg/ml 1,441 16HP-1000TM30μg/ml 1,543 24HP-1000TM60μg/ml 1,649 32實(shí)施例22-應(yīng)用HP-1000TM得到的冬小麥生長(zhǎng)增強(qiáng)以每100磅種子3盎司制成品(3％活性成分)的比率，將HP-1000TM(EDEN Bioscience)(解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑制劑)干粉“撒粉”在冬小麥種子上。然后用常規(guī)播種設(shè)備將這些種子播種進(jìn)100英尺長(zhǎng)、11.7英尺寬的隨機(jī)化試驗(yàn)小區(qū)中。其它處理包括以每100磅種子1盎司制成品向種子“撒粉”HP-1000TM干粉(3％活性成分)；用濃度為20μg/ml活性成分的HP-1000TM溶液浸泡種子四小時(shí)、風(fēng)干并種植；用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品(Dividend)殺真菌劑“撒粉”；以及一個(gè)不處理的對(duì)照(UTC)。種植后8天，HP-1000TM處理的種子開(kāi)始出苗，而UTC和化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品處理的種子直到預(yù)期的正常時(shí)間，即種植后約14天才出苗。種植后41天，從田中取出幼苗并進(jìn)行評(píng)估。目測(cè)并判斷以3盎司/100磅“撒粉”HP-1000TM處理的小麥的根重量是其它任何一種處理的約兩倍。
大田試驗(yàn)之后，設(shè)計(jì)一個(gè)溫室試驗(yàn)對(duì)這些結(jié)果獲得確證。處理包括種植前以每100磅種子3盎司的比率向小麥種子撒HP-1000TM(10％活性成分)干粉；以溶液濃度為20mg/ml的HP-1000TM浸泡種子、然后種植；以及一個(gè)不處理的對(duì)照(UTC)。將從每種處理得到的小麥種子以每盆25粒種子的比率種植，每種處理用5盆作為重復(fù)。種植后十五天，從每個(gè)處理盆中取出十株隨機(jī)選擇的幼苗，仔細(xì)地弄干凈，并測(cè)量根長(zhǎng)度。由于單株幼苗的地上部分并不表現(xiàn)任何處理效果，因此用HP-1000TM處理導(dǎo)致的根生長(zhǎng)增強(qiáng)并不影響樣本選擇。由兩種HP-1000TM處理得到的根生長(zhǎng)增強(qiáng)都顯著強(qiáng)于UTC(表49)；然而撒粉處理的種子看起來(lái)表現(xiàn)出略好的結(jié)果。
表44-HP-1000TM處理后小麥幼苗的根生長(zhǎng)的增強(qiáng)處理比率 根長(zhǎng)度(cm)1高于UTC的％UTC ---35.6a---HP-1000TM3盎司/100磅41.0b17.4(撒粉)HP-1000TM20μg/ml 40.8b14.6(浸泡)1根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。實(shí)施例23-施用HP-1000TM得到的黃瓜生長(zhǎng)增強(qiáng)對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)的黃瓜的大田試驗(yàn)包括四種處理兩種比率(20或40μg/ml)的HP-1000TM(EDEN Bioscience)(解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑制劑)，一種用于病害防治的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品(Bravo(Zeneca AgProducts，Wilmington，Del.)+Maneb)和一個(gè)不處理的對(duì)照(UTC)。每種處理在3×75英尺的小區(qū)中重復(fù)四次，每種處理的植株間隔約2英尺。從長(zhǎng)出第一片真葉開(kāi)始葉噴灑HP-1000TM，并以14天的間隔重復(fù)直到最后收獲，總共進(jìn)行六次施用。如果條件允許，每七天或更短時(shí)間間隔施用標(biāo)準(zhǔn)殺真菌劑混合物。第一次施用HP-1000TM約兩個(gè)月后(五次噴灑HP-1000TM之后)開(kāi)始工業(yè)化收獲，第一次收獲約14天之后進(jìn)行最后的收獲。
由第一次收獲得到的結(jié)果表明，用HP-1000TM處理通過(guò)增加收獲黃瓜的總數(shù)而不是單個(gè)黃瓜的平均重量而增加了黃瓜平均產(chǎn)量(表45-47)。在最后一次收獲中也注意到有相同的趨勢(shì)(表48-49)。在商業(yè)上很重要的是，由HP-1000TM處理得到的增產(chǎn)并非通過(guò)顯著增加黃瓜的平均大小獲得。
表45-HP-1000TM處理后第一次收獲時(shí)黃瓜產(chǎn)量的增加處理 比率(活性成分) 產(chǎn)量/trt1(kg.) 高于UTC的％UTC --- 10.0a---Bravo+Maneb 按標(biāo)簽(label) 10.8a8.4HP-1000TM20μg/ml 12.3ab 22.8HP-1000TM40μg/ml 13.8b 38.01根Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。
表46-HP-1000TM處理后第一次收獲時(shí)黃瓜果實(shí)數(shù)目的增加處理 比率(活性成分) 果實(shí)數(shù)/trt1高于UTC的％UTC ---24.5a ---Bravo+Maneb 按標(biāo)簽 27.6ab 12.8HP-1000TM20μg/ml 31.2b 27.0HP-1000TM40μg/ml 34.3b 39.81根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。
表47-HP-1000TM處理后第一次收獲時(shí)黃瓜的平均重量處理 比率(活性成分) 重量/果實(shí)(g) 與UTC相比的變化％UTC--- 406---Bravo+Maneb 按標(biāo)簽 390-4HP-1000TM20μg/ml395-3HP-1000TM40μg/ml403-1表48-HP-1000TM處理后第三次收獲時(shí)黃瓜產(chǎn)量的增加處理 比率(活性成分) 產(chǎn)量/trt1(kg.) 高于UTC的％UTC --- 17.5a ---Bravo+Maneb按標(biāo)簽14.0b -20.1HP-1000TM20μg/ml20.1a 15.3HP-1000TM40μg/ml20.2a 15.61根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。表49-HP-1000TM處理后第三次收獲時(shí)黃瓜果實(shí)數(shù)目的增加處理 比率(活性成分) 果實(shí)數(shù)/trt1與UTC相比的變化％UTC --- 68.8ab ---Bravo+Maneb按標(biāo)簽60.0a -12.7HP-1000TM20μg/ml82.3b. 19.6HP-1000TM40μg/ml85.3b 24.01根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。
表50-HP-1000TM處理后第三次收獲時(shí)黃瓜的平均重量處理比率(活性成分) 重量/果實(shí)(g)與UTC相比的變化％UTC --- 255 ---Bravo+Maneb按標(biāo)簽232 -9HP-1000TM20μg/ml 247 -3HP-1000TM40μg/ml 237 -71根據(jù)Duncan氏MRT，后面帶有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有顯著差異。實(shí)施例24-得自丁香假單胞菌丁香致病變種的harpinpss誘導(dǎo)番茄的生長(zhǎng)增強(qiáng)為測(cè)試harpinpss(即得自丁香假單胞菌丁香致病變種的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑)(He，S.Y.，等人，“丁香假單胞菌丁香致病變種的harpinpss.通過(guò)Hrp途徑分泌、并在植物中誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的一種蛋白，”Cell 731255-66(1993)，特此通過(guò)引用結(jié)合到本文中)是否也刺激植物生長(zhǎng)，將番茄種子(Marglobe變種)播種在裝有人工土壤的8英寸盆中。播種后10天，將幼苗移栽到單獨(dú)的盆中。試驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程中，植株間的肥料、水灌溉、溫度和土壤濕度維持一致。移栽后16天，測(cè)量起始株高并第一次施用harpinpss，這一天被稱(chēng)為第0天。第二次施用在第15天進(jìn)行。在第10天和第30天收集另外的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)。在第30天收集的最后一次數(shù)據(jù)包括株高和鮮重。
通過(guò)發(fā)酵包含帶有編碼harpinpss的基因(即hrpZ)的質(zhì)粒的大腸桿菌DH5，產(chǎn)生試驗(yàn)中所用的harpinpss。收獲細(xì)胞，重懸浮于5mM磷酸鉀緩沖液，超聲處理進(jìn)行破碎。將超聲處理的材料煮沸5分鐘，然后10,000rpm離心10分鐘。上清液可被認(rèn)為是無(wú)細(xì)胞誘發(fā)劑制備物(CFEP)。使用與用來(lái)制備細(xì)胞懸浮緩沖液的相同緩沖液制備20和50μg/ml harpinpss溶液。由包含相同質(zhì)粒但不包含hrpZ基因的相同菌株制備的CFEP用作對(duì)照處理的材料。
將潤(rùn)濕劑Pinene II(Drexel Chemical Co.，Memphis，Tenn.)加入harpinpss溶液中，達(dá)到0.1％的濃度，然后將harpinpss噴灑到番茄植株上直到形成溢流。
表51顯示在harpinpss處理組和對(duì)照組間有顯著差異。harpinpss處理的番茄高度增加超過(guò)10％。這個(gè)數(shù)據(jù)支持harpinpss與得自解淀粉歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑相似地起作用的說(shuō)法，因?yàn)楫?dāng)其應(yīng)用于番茄和許多其它植物物種時(shí)，具有生長(zhǎng)增強(qiáng)的作用。除番茄高度顯著增加外，harpinpss處理的番茄的生物量更多、葉子大、花成果(flowerseteing)早以及總體上外觀更健康。
表51-Harpinpss增強(qiáng)番茄植株的生長(zhǎng)處理 株高(cm1)第0天第10天第30天CFEP對(duì)照 8.52(0.87)a323.9(1.90)a68.2(8.60)aHarpinpss 20μg/ml 8.8(0.98)a 27.3(1.75)b74.2(6.38)bHarpinpss 50μg/ml 8.8(1.13)a 26.8(2.31)b75.4(6.30)b1株高測(cè)量精確至0.5cm。第0天是指記錄初始株高并進(jìn)行第一次施用的那一天。2給出平均值的同時(shí)在圓括號(hào)中給出了SD(所有處理組的n＝20)。3不同字母(a和b)表明平均值間有顯著差別(P＝0.05)。首先用ANOVA，然后用Fisher LSD評(píng)估差異。
雖然本發(fā)明已經(jīng)為例證目的詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解，這些細(xì)節(jié)僅僅是為此目的，在那些方面，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以做出變更，而不會(huì)偏離由下面的權(quán)利要求書(shū)所確定的本發(fā)明的精神和范圍。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Cornell Research Foundation，Inc.
(ii)發(fā)明名稱(chēng)植物生長(zhǎng)的增強(qiáng)(iii)序列數(shù)10(iv)通信地址(A)收信人Nixon，Hargrave，Devans &amp; Doyle LLP(B)街道Clinton Square，P.O.Box 1051(C)城市Rochester(D)州紐約州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼14603(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本1.30(vi)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)提交日期a(C)分類(lèi)(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 60/036,048(B)提交日期1997年1月27日(viii)代理律師/代理人資料(A)姓名Goldman，Michael L.
(B)注冊(cè)號(hào)30,727(C)參考/檔案號(hào)19603/1502(ix)電訊資料(A)電話(716)263-1304(B)傳真(716)263-1600(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度338個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1 5 10 15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser20 25 30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr35 40 45Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu50 55 60Gly Ala Ser Ser Ays Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65 70 75 80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys85 90 95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp100 105 110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln115 120 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met130 135 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145 150 155 160Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly165 170 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu180 185 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala195 200 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val210 215 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225 230 235 240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp245 250 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys260 265 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln275 280 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr290 295 300
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Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu115 120 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met130 135 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145 150 155 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe165 170 175Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile180 185 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly195 200 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser210 215 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225 230 235 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp245 250 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val260 265 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln275 280 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala290 295 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg325 330 335Asn Gln Ala Ala Ala340(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1026個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO6ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG 60GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC120GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA180AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC240ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG300GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC360AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC420GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC480AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC540GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG600AGTGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC660AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC 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Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala115 120 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val130 135 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly165 170 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly180 185 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala195 200 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn210 215 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225 230 235 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn245 250 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln260 265 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly275 280 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser290 295 300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val305 310 315 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln325 330 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met340(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1035個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO8ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC120GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC180GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC240AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC300GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA360GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG420GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC480GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC540GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT600GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC660GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG 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權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)植物生長(zhǎng)的方法，包括在一定條件下施用非感染型的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白于植物或植物種子，其中所述條件能有效增強(qiáng)所述植物或由所述植物種子長(zhǎng)成的植物的生長(zhǎng)。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于從選自以下的病原體得到的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白歐文氏菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬、疫霉屬以及它們的混合物。
3.依照權(quán)利要求2的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于得自菊歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
4.依照權(quán)利要求2的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于得自解淀粉歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
5.依照權(quán)利要求2的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于得自丁香假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
6.依照權(quán)利要求2的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于得自茄假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
7.依照權(quán)利要求2的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于得自野油菜黃單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
8.依照權(quán)利要求2的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于一種疫霉屬菌種。
9.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述植物選自雙子葉植物和單子葉植物。
10.依照權(quán)利要求9的方法，其中所述植物選自稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣蘿菜、甘藍(lán)、花椰菜、硬花球花椰菜、蕪菁、蘿卜(radish)、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜(squash)、西葫蘆、綠皮南瓜、黃瓜、蘋(píng)果、梨、瓜、草莓、萄萄、樹(shù)莓、菠蘿、大豆、煙草、番茄、蜀黍以及甘蔗。
11.依照權(quán)利要求9的方法，其中所述植物選自玫瑰、非洲紫苣苔屬(Saintpaulia)、牽?；?、天竺葵屬植物、一品紅、菊花、香石竹和百日草屬。
12.依照權(quán)利要求1的方法，其中在通過(guò)噴灑、注入或磨擦葉面進(jìn)行所述施用期間，在接近所述應(yīng)用開(kāi)始的時(shí)刻處理植物。
13.依照權(quán)利要求1的方法，其中在通過(guò)噴灑、注入、包被、撒粉或浸漬進(jìn)行所述施用期間處理植物種子。
14.依照權(quán)利要求1的方法，其中以還包含一種載體的組合物將所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白施用于植物或植物種子。
15.依照權(quán)利要求14的方法，其中所述載體由以下選出水、水溶液、漿液和粉末。
16.依照權(quán)利要求14的方法，其中所述組合物包含濃度大于0.5nM的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
17.依照權(quán)利要求14的方法，其中所述組合物還包含選自以下的添加劑肥料、殺蟲(chóng)劑、殺真菌劑、殺線蟲(chóng)劑以及它們的混合物。
18.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白是一種已分離的形式。
19.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白以細(xì)菌的形式應(yīng)用，所述細(xì)菌并不致病并且用編碼所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化。
20.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白以細(xì)菌的形式應(yīng)用，所述細(xì)菌在一些植物種中致病，但并不在其所應(yīng)用的植物種中致病，并且?guī)в芯幋a所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的基因。
21.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述施用導(dǎo)致所述多肽或蛋白滲透進(jìn)植物。
22.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述施用導(dǎo)致株高增加。
23.依照權(quán)利要求22的方法，其中在所述施用期間植株受到處理。
24.依照權(quán)利要求22的方法，其中在所述施用期間植物種子受到處理，所述方法另外還包括將用所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑處理過(guò)的種子種植在天然或人工土壤中，并從種植在土壤中的種子繁殖出植株。
25.依照權(quán)利要求1的方法，其中在所述施用期間植物種子受到處理，來(lái)增加發(fā)芽的種子的數(shù)量，所述方法還包括將用所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白處理過(guò)的種子種植在天然或人工土壤中，并從種植在土壤中的種子繁殖出植株。
26.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述施用導(dǎo)致產(chǎn)量提高。
27.依照權(quán)利要求26的方法，其中在所述施用期間植株受到處理。
28.依照權(quán)利要求26的方法，其中在所述施用期間植物種子受到處理，所述方法另外還包括將用所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白處理過(guò)的種子種植在天然或人工土壤中，并從種植在土壤中的種子繁殖出植株。
29.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述應(yīng)用導(dǎo)致發(fā)芽更早。
30.依照權(quán)利要求29的方法，其中在所述施用期間植物種子受到處理，所述方法另外還包括將用所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白處理過(guò)的種子種植在天然或人工土壤中，并從種植在土壤中的種子繁殖出植株。
31.依照權(quán)利要求29的方法，其中所述應(yīng)用導(dǎo)致成熟更早。
32.依照權(quán)利要求31的方法，其中在所述施用期間植株受到處理。
33.依照權(quán)利要求31的方法，其中在所述施用期間植物種子受到處理，所述方法另外還包括將用所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白處理過(guò)的種子種植在天然或人工土壤中，并從種植在土壤中的種子繁殖出植株。
34.依照權(quán)利要求1的方法，其中在所述施用期間植物種子受到處理，所述方法另外還包括將用所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白處理過(guò)的種子種植在天然或人工土壤中，并從種植在土壤中的種子繁殖出植株。
35.依照權(quán)利要求34的方法，所述方法另外還包括將所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白以非感染的形式應(yīng)用于所繁殖出的植株以進(jìn)一步增強(qiáng)生長(zhǎng)。
36.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述施用導(dǎo)致果實(shí)和植株著色更早。
37.依照權(quán)利要求36的方法，其中在所述施用期間植物種子受到處理，所述方法另外還包括將用所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白處理過(guò)的種子種植在天然或人工土壤中，并從種植在土壤中的種子繁殖出植株。
38.一種增強(qiáng)植物生長(zhǎng)的方法，包括提供用編碼一種過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物并在有效增強(qiáng)植物生長(zhǎng)的條件下培育所述轉(zhuǎn)基因植物或由所述轉(zhuǎn)基因植物種子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
39.依照權(quán)利要求38的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于從選自以下的病原體得到的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白歐文氏菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬、疫霉屬以及它們的混合物。
40.依照權(quán)利要求39的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于得自菊歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
41.依照權(quán)利要求39的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于得自解淀粉歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
42.依照權(quán)利要求39的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于得自丁香假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
43.依照權(quán)利要求39的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于得自茄假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
44.依照權(quán)利要求39的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于得自野油菜黃單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
45.依照權(quán)利要求39的方法，其中所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白對(duì)應(yīng)于得自一種疫霉物種的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白。
46.依照權(quán)利要求38的方法，其中所述植物選自雙子葉植物和單子葉植物。
47.依照權(quán)利要求46的方法，其中所述植物選自稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣蘿菜、甘藍(lán)、花椰菜、硬花球花椰菜、蕪菁、蘿卜(radish)、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜(squash)、西葫蘆、綠皮南瓜、黃瓜、蘋(píng)果、梨、瓜、草莓、葡萄、樹(shù)莓、菠蘿、大豆、煙草、番茄、蜀黍以及甘蔗。
48.依照權(quán)利要求46的方法，其中所述植物選自玫瑰、非洲紫苣苔屬、牽?；?、天竺葵屬植物、一品紅、菊花、香石竹和百日草屬。
49.依照權(quán)利要求38的方法，其中提供了轉(zhuǎn)基因植物。
50.依照權(quán)利要求38的方法，其中提供了轉(zhuǎn)基因植物種子。
51.依照權(quán)利要求38的方法，所述方法還包括應(yīng)用所述過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白于所繁殖出的植株，以增強(qiáng)所述植株的生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及增強(qiáng)植物生長(zhǎng)的方法。這涉及在一定條件下施用非感染型的過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白于植物或植物種子,其中所述條件能有效增強(qiáng)所述植物或由所述植物種子長(zhǎng)成的植物的生長(zhǎng)?；蛘?可以提供用編碼過(guò)敏反應(yīng)誘發(fā)劑多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物種子,并在有效增強(qiáng)植物生長(zhǎng)的條件下,培育所述轉(zhuǎn)基因植物或由所述轉(zhuǎn)基因植物種子產(chǎn)生的植物。
文檔編號(hào)A01N37/46GK1251131SQ98803654
公開(kāi)日2000年4月19日 申請(qǐng)日期1998年1月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月27日
發(fā)明者D·W·丘, Z·M·韋, S·V·貝爾 申請(qǐng)人:康乃爾研究基金會(huì)有限公司