專利名稱：：增加植物生長的方法增加植物生長的方法本發(fā)明涉及增加植物生長的方法。長期能源安全既是挑戰(zhàn)也是機會。在目前可利用的多種選擇中，可再生生物質(zhì)(biomass)資源為礦物燃料提供了非?，F(xiàn)實的替代品。生物質(zhì)生產(chǎn)提供了供應(yīng)生物能和生物材料資源的碳中和、可再生的手段。目前，在瑞典，短輪伐期生物質(zhì)林場的生物質(zhì)產(chǎn)量平均為每年每公項8Mg干重，在美國為每年每公項10-22Mg干重(對于短輪伐期木本作物)(Ragauskasetal.2006.Science.Vol.113,484-489)。像動物，植物也需要供應(yīng)新細(xì)胞用于生長和發(fā)育。木本植物種類中生物質(zhì)積累開始于初生分生組織和次生分生組織中的細(xì)胞分裂。分生組織為植物干細(xì)胞龕(stemcellniches)。初生、頂端分生組織為根和芽尖生長提供細(xì)胞。稱為維管形成層(VC)的圓周次生分生組織的位置朝向樹和其它木本種類的外部。木材源于VC中的細(xì)胞增殖。令人驚訝的是，考慮到其對于商業(yè)和環(huán)境的重要性，盡管對VC的解剖和生理分析有悠久傳統(tǒng)，但是對其建成和功能的分子基礎(chǔ)幾乎一無所知。甚至包含VC干細(xì)胞龕的細(xì)胞組分仍沒有被鑒定出。擬南齊s^9/r-ioor04《//7)基因被證實在根端分生組織的建成和維持方面其關(guān)鍵作用。在擬南芥根中，SHORT-ROOT(AtSHR)蛋白，連同SCARECROW(AtSCR)和PLETHORA(AtPLTl和AtPLT2)蛋白，對于QC和鄰4妻干細(xì)胞群的特化和維持是必要的(Levesqueetal.PLoSBiol.20064(5):el43)。喪失功能的突變體顯示出逐漸的QC瓦解、干細(xì)胞活性的喪失和才艮尖生長的停止(Levesqueetal.,PLoSBiol.2006May;4(5):e143.)。AS/^在中柱的內(nèi)層轉(zhuǎn)錄，蛋白遷移至鄰近的表達ASCi的QC、內(nèi)皮層和內(nèi)皮層/皮層原始和子細(xì)胞的細(xì)胞核中(Nakajimaetal.，Nature.2001Sep20;413(6853):307-ll)。結(jié)合在QC和干細(xì)胞命運決定中的作用，AtSHR為擬南芥根尖(rootapex)中不對稱分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。與AtSCR—起，AtSHR對于皮層/內(nèi)7皮層干細(xì)胞子代的不對稱平周分裂是必要的(Helanuttaetal.,Cell.2000May26;101(5):555-67)。這種分裂的子細(xì)胞的皮層/內(nèi)皮層細(xì)胞命運分離依賴于AtSHR和AtSCR在外部細(xì)胞中的降解和AtSHR在內(nèi)部、內(nèi)皮層細(xì)胞中的維持(Helariuttaetal.,Cell,2000May26;101(5):555-67)。最后，隨著根變老，通過內(nèi)皮層的不對稱分裂產(chǎn)生次生皮層。AtSHR對于這種分裂是關(guān)鍵的，并且這種情況下其通過AtSCR依賴機制發(fā)揮作用(PaquetteandBenfeyPlantPhysiol.2005Jun;138(2):636-40)。AtSHR功能的完全喪失無疑損害了擬南芥生長，因為突變體的才艮和芽與WT相比都嚴(yán)重矮小(Benfeyetal.,Development.1993Sep;119(l):57-70)。還有才艮道，在轉(zhuǎn)基因擬南芥植斗朱中，在OzMF35<S、爿"Ci或『五i^『0丄F(A『五i)啟動子驅(qū)動下的J"i/7異位表達可導(dǎo)致擬南齊4艮尖輻射形態(tài)的改變(Benfeyetal.,Cell,Vol.101，2000;Nakajimaetal.,2001Nature;Senaetal.,2004，Development^經(jīng)源自根分生組織的細(xì)胞層的增殖而發(fā)生這種輻射形態(tài)缺陷(Benfeyetal.,Cell,Vol.101,555-567,2000)。Senaetal.(2004)提出，^『￡7轉(zhuǎn)基因植抹中多余層源于發(fā)生在表皮/側(cè)根冠原始細(xì)胞(干細(xì)胞)中而不是這些細(xì)胞的后代中的AtSHR異4立表達。盡管AtSHR對于根的發(fā)育是必要的，但是涉及該蛋白的細(xì)胞間遷移和其精確的細(xì)胞自主和非細(xì)胞自主作用模式的機制還有待確認(rèn)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，盡管AtSHR完全喪失功能會引起根尖分生組織退化和擬南芥芽矮小，但是部分抑制JW/W或楊木(Poplar)5//<9/7^<9(977(尸^///^)的穩(wěn)態(tài)111{^^\水平導(dǎo)致芽初生(頂端生長)和次生(干周生長)分生組織活性的顯著和持續(xù)增強。因此，控制5//(9^7-woor表達可用于加速生長并增加轉(zhuǎn)基因植物中的生物質(zhì)生產(chǎn)。本發(fā)明的一方面提供了增加植物的生長和/或生物質(zhì)的方法，包括改變所述植物的細(xì)胞內(nèi)s//Oir-i(9or(si7i)多肽的表達。S7/c^r-ioorosi/i)多肽的表達可相對于對照植物、如野生型植物有改變。SHORT-ROOT(SHR)表達的改變可以增加才直物萌發(fā)后發(fā)育的速度。例如，植物細(xì)胞內(nèi)SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的改變可以增加植物中初生(高度)和次生(千周)生長的速度和/或生物質(zhì)積累的速度。相對于對照植物，增加的生長或生物質(zhì)可以發(fā)生在植物的地上部分，例如，植物的莖和其它氣生結(jié)構(gòu)中。因此，植物的地上部分可以相對于對照植物具有增加的初生(高度)和次生(干周)生長和/或增加的生物質(zhì)。在木本植物中，可以增加木材密度。植物細(xì)胞內(nèi)SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的改變也可以增加植物萌發(fā)的速度。生長可以通過細(xì)胞凄t量的全面增加來增強，例如，與對照才直物相比，按本文所述處理的植物中的髓、維管系統(tǒng)和皮層可以成比例地更大。SHORT-ROOT(SHR)多肽為GRAS轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員。GRAS超家族的轉(zhuǎn)錄因子共有可變的氨基末端和含有多種可識別基序的高度保守羧基末端(BolleC.，Planta.2004Mar;218(5):683-92)。SHR多肽，如AtSHR、PtSHRl、PtSHR2A和PtSHR2B,在它們之間共有多個保守序列，這些保守序列是其它GRAS功能類別中不共有的(保守序列參見圖3，GRAS結(jié)構(gòu)域參見BolleC.,Planta.2004Mar;218(5):683-92))。SHORT-ROOT(SHR)多肽在其它GRAS蛋白序列(特別地Scarecrow樣(SCL)蛋白如PtSCL35b、PtSCL53b、PtSCL62、PtSCL69b、PtSCL92b、PtSCL97b、AtSCL29和AtSCL32的序歹寸)的進化樹中，可以屬于SHR進化枝，如圖l的AtSHR、PtSHRl、PtSHR2A和PtSHR2B所示。可采用常頭見技術(shù)來生成進化樹。例如，可以采用ClustalW比對蛋白序列，Phylip格式用于樹輸出，采用1000bootstrap重復(fù)，以及TreeViewX(版本0,5.0)用于作圖，來計算進化樹。適合的SHORT-ROOT(SHR)多肽可以具有SEQIDNOS:2、4、6、8、10、12、14或16中任一種的氨基酸序列，或者可以是保留了SHR活性的所述序列的片段或變體。在一些優(yōu)選的實施方案中，SHORT-ROOT(SHR)多肽可以具有SEQIDNO:2(PU04350_eugene3.01860017)、SEQIDNO:4(eugene3.00070144)或SEQIDNO:6(eugene3.00640143)的氨基酸序列，或者是保留了SHR活性的所述序列的片段或變體。作為本文指出的參照SHR序列如SEQIDNO:2的變體的SHORT-ROOT(SHR)多肽可以包含與參照SHR氨基S交序列有高于30%序列一致性的氨基酸序歹'J，優(yōu)選高于40%、高于50%、高于60%、高于65%、高于70%、高于80%、高于90%、或高于95%。特定的氨基酸序列變體可以通過1個氨基酸、2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-50、或多于50個氨基酸的插入、添加、置換或缺失而與本文所描述的已知SHR多肽序列有差異。一4殳參照算法GAP(WisconsinPackage,Accelerys,SanDiegoUSA)定義序列相似性和一致性。GAP采用Needleman和Wunsch算法比對兩完整序列，使匹配數(shù)最大化和空位數(shù)最小化。通常，使用默認(rèn)參數(shù)，空位產(chǎn)生罰分=12，空位延伸罰分=4。可以優(yōu)選使用GAP，但是也可以使用其它的算法，例如BLAST(其采用Altschulda/.(1990)Mo/.所o/.215:405-410的方法)、FASTA(其采用PearsonandLipman(1988)/W^S85:2444-2448的方法)、或Smith-Waterman算法(SmithandWaterman(1981)/.Mo/歷o/."7:195-197),或者上文Altschuletal.(1990)的TBLASTN程序，一般采用默認(rèn)參數(shù)。特別地，可以使用psi-Blast算法(Nucl.AcidsRes.(1997)253389-3402)。序列比較可以在本文描述的相關(guān)序列的全長上進行，或者可以在至少50、75、100、150或更多個氨基酸或核普酸三聯(lián)子的連續(xù)序列(即"窗口")上進行，與相關(guān)氨基酸序列或核苷S臾序列相比較。相對于作為整體的SHORT-ROOT(SHR)多肽序列而言，SHORT-ROOT(SHR)多肽的某些結(jié)構(gòu)域可以顯示出與SHR參照序列如SEQIDNO:2、4或6的結(jié)構(gòu)域有提高水平的一致性。例如，SHORT-ROOT(SHR)多肽可以包含一個或多個具有與選自SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20和SEQIDNO:21的氨基餅列有至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性或相似性的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域或基序。在一些優(yōu)選的實施方案中，SHORT-ROOT(SHR)多肽可以包含一個或多個具有選自SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20和SEQIDNO:21的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域或基序。在一些實施方案中，所述植物的細(xì)胞內(nèi)SHORT-ROOT(SHR)多肽的表達可以降低。這種情況下降低不包括完全消除表達。例如，所述植物的細(xì)胞內(nèi)SHORT-ROOT(SHR)多肽的表達可以降低至多90%、至多80%、至多70%、至多60%、至多50%、至多40%、或至多30%。換言之，植物中SHORT-ROOT(SHR)多肽的表達可以為對照植物的細(xì)胞內(nèi)表達的0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、或0.7倍。本文描述的SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的降低可以引起植物生長或生物質(zhì)的增加。在一些實施方案中，可以增加植物的地上部分的生長或生物質(zhì)?？梢酝ㄟ^任何便利的方法降低所述植物的細(xì)胞內(nèi)SHORT-ROOT(SHR)多肽的表達。在一些實施方案中，可以通過在所述植物的細(xì)胞內(nèi)表達異源核酸來降低SHORT-ROOT(SHR)多肽的表達，該異源核酸編碼或轉(zhuǎn)錄抑制物核酸，例如抑制物RNA分子。本文描述的核酸可以是全部或部分合成的。特別地，它們可以是重組的，由于自然界中不一起存在的(不連續(xù)的)核酸序列已被人工連接或以其它方式組合。可選擇地，可以例如采用自動合成儀將它們直接合成。核酸當(dāng)然可以是雙鏈或單鏈的、cDNA或基因組DNA或RNA。取決于設(shè)計，該核酸可以是全部或部分合成的。自然，技術(shù)人員知道，當(dāng)核酸包括RNA時，參照所顯示的序列應(yīng)被認(rèn)為是參照RNA等同物，以U替換T。"異源的，，表明，采用遺傳工程或重組手段，即通過人工介入，將所討論的基因/核苷酸序列或調(diào)節(jié)所討論的基因/序列的序列引入所述植物細(xì)胞或其先祖。對植物細(xì)胞異源的核苷酸序列可以是非天然存在于該類型、品種或物種的細(xì)胞中的(即外源的(exogenous)或外來的(foreign)),或者可以為非天然存在于該細(xì)胞的亞細(xì)胞或基因組環(huán)境中的序列，或者可以為該細(xì)胞中被非天然調(diào)節(jié)的序列，即可操作地連接至非天然調(diào)節(jié)元件。對植物細(xì)胞中靶多肽的表達的抑制在本領(lǐng)域是公知的。適合的抑制物核酸可以為全部或部分靶SHR基因的拷貝，其相對于SHR基因被以ii反義或正義方向或雙方向插入來實現(xiàn)SHR基因表達的降低。例如參見vanderKrol&a/"(1990)7%￡P(guān)/朋/Ce〃2，291-299;Napoli"a/"(1990)T7e尸/朋ZCe〃2，279-289;Zhang&a/.,(1992)T7e尸/a"/Ce〃4,1575-1588，和US-A-5，231,020。這種方法的進一步改進可以在W095/34668(Biosource);Angell&Baulcombe(1997)TheEMBOJournal16,12:3675-3684;和Voi皿et&Baulcombe(1997)Nature389:pg553中找到。在一些實施方案中，該抑制物核酸可以為SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的正義承卩制物(sensesuppressor)。適合的正義抑制物核酸可以為雙鏈RNA(FireA.etalNature,Vol391，(1998))。dsRNA介導(dǎo)的沉默為基因特異的，并且通常稱為RNA干擾(RNAi)。RNAi為兩步過程。首先，dsRNA在細(xì)胞內(nèi)^皮切割產(chǎn)生約21-23nt長度的短干擾RNA(siRNA)，其帶有5'末端磷酸和3'短突出(overhang)(2nt)。該siRNA耙向?qū)?yīng)的mRNA序列，特異用于石皮壞(ZamoreP.D.NatureStructuralBiology,8,9，746-750，(2001)。siRNAs(有時稱為微RNA(microRNAs))通過結(jié)合互補RNA并觸發(fā)mRNA消除(RNAi)或阻止mRNA翻譯為蛋白而下調(diào)基因表達。siRNA可以衍生自長雙鏈RNA的加工，當(dāng)天然存在時通常是外生源的。微干擾RNA(miRNA)為內(nèi)在編碼的非編碼小RNA,通過短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的加工而書f生。siRNA和miRNA都可抑制帶有部分互補把序列的mRNA的翻i奪而沒有RNA切割，并可降解帶有全部互補序列的mRNA。因此，本發(fā)明提供了基于SHORT-ROOT(SHR)核酸序列的RNAi序列抑制SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的用途。例如，RNAi序列可以對應(yīng)于SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15的片^:或其變體。siRNA分子通常是雙鏈的，并且，為了優(yōu)化RNA介導(dǎo)的耙基因功能下調(diào)的效果，優(yōu)選對siRNA分子的長度和序列進行選擇以確保RISC復(fù)合體對siRNA的正確識別，以及使得siRNA足夠短而減少宿主反應(yīng)，其中RISC復(fù)合體介導(dǎo)siRNA對mRNA耙的識別。miRNA配體通常是單鏈的，并具有部分互補的區(qū)域，使得該配體能形成發(fā)夾。miRNA為從DNA轉(zhuǎn)錄但不翻譯成蛋白的RNA序列。編碼miRNA的DNA序列比miRNA長。該DNA序列包含miRNA序列和大致的反向互補體。當(dāng)該DNA序列轉(zhuǎn)錄為單鏈RNA分子時，該miRNA序列和其反向互補堿基配對形成部分雙鏈的RNA片段。微RNA序列的設(shè)計在Johnetal,PLoSBiology,11(2),1862-1879，2004中有討論。一般地，意在模擬siRNA或miRNA作用的RNA分子具有10至40個核糖核苷酸(或其合成類似物)，優(yōu)選17至30個核糖核苷酸，更優(yōu)選19至25個核糖核苷酸，最優(yōu)選21至23個核糖核苷酸。在采用雙鏈siRNA的一些本發(fā)明實施方案中，該分子可以具有例如1或2個(核糖)核苷酸的對稱3'突出，通常是UU或dTdT3'突出。根據(jù)本文提供的公開內(nèi)容，技術(shù)人員可容易地設(shè)計適合的siRNA和miRNA序列，例如采用諸如Ambion的siRNA發(fā)現(xiàn)者(Ambion，ssiRNAfinder)的資源，參見http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_fmder.html。siRNA詳口miRNA序歹ll可以合成產(chǎn)生并外源添加來S1起基因下調(diào)或采用表達系統(tǒng)(例如載體)來產(chǎn)生。在優(yōu)選的實施方案中，siRNA是人工合成的。較長的雙鏈RNA可以在細(xì)胞內(nèi)加工以產(chǎn)生siRNAs(例如參見Myers(2003)A^wm所o/ec/mo/ogy2/.JW-32S)。較長的dsRNA分子可以具有例如1或2個(核糖)核苷酸的對稱3'或5'突出，或者可以具有平末端。較長的dsRNA分子可以為25個核苷酸或更長。優(yōu)選地，較長的dsRNA分子為25至30個核香酸長。更優(yōu)選地，該較長dsRNA分子為25至27個核苦酸長。最優(yōu)選地,該較長dsRNA分子為27個核苷酸長。30個核苷酸或更長的dsRNA可以采用載體pDECAP(Shinagawaetal"GenesandDev.,17,1340-5,2003)表達。另一選擇是在細(xì)胞內(nèi)表達短發(fā)夾RNA分子(shRNA)。shRNA比合成的siRNA更穩(wěn)定。shRNA由小環(huán)序列隔開的短反向重復(fù)序列組成。一反向重復(fù)互補于基因把。在細(xì)月包內(nèi)，DICER將shRNA加工為siRNA,其降解靶基因mRNA并抑制表達。在優(yōu)選的實施方案中，通過從載體轉(zhuǎn)錄而內(nèi)源(細(xì)胞內(nèi))產(chǎn)生shRNA。通過以在RNA聚合酶III啟動子如人HI或7SK啟動子或RNA聚合酶II啟動子控制下編碼shRNA序列的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生shRNA?？蛇x擇地，該shRNA可以通過從載體轉(zhuǎn)錄而外源(在體外)合成。然后可以將該shRNA直接引入細(xì)胞。優(yōu)選地，該shRNA分子包含SHR的部分序列。例如，該shRNA序列為40至100堿基長，優(yōu)選40至70堿基長。發(fā)夾的莖部優(yōu)選為19至30堿基對長。該莖部可以含有G-U配對以穩(wěn)定該發(fā)夾結(jié)構(gòu)。siRNA分子、較長dsRNA分子或miRNA分子可以通過轉(zhuǎn)錄優(yōu)選包含在載體內(nèi)的核酸序列而重組產(chǎn)生。優(yōu)選地，該siRNA分子、較長dsRNA分子或miRNA分子包含SEQIDNO:1,3，5，7，9,11，13,15的部分序列或其變體。在其它實施方案中，抑制物核酸可以為SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的反義抑制物。在采用反義序列下調(diào)基因表達時，核酸序列以"反方向"置于啟動子的控制下，以使得轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生互補于從靶基因"正義"鏈轉(zhuǎn)錄的正常mRNA的RNA。參見，例如Rothsteinetal,1987;Smith""/,(1988)A^wm334，724-726;Zhang"a/,(1992)77^Ce〃4，1575-1588,Englishda/.,(1996)尸/a"fCe〃8，179-188。反義技術(shù)還在Bourque,(1995)，P/滅5We騰105,125-149和Flavell(1994)/WAS腦91,3490-3496中有綜述。反義抑制物核酸可以包含來自作為SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15的片段或其變體的核苷酸序列的至少10個核苷酸的反義序列?？梢詢?yōu)選的是，用于下調(diào)靶序列表達的序列與該靶序列有全序列一致性，盡管序列的完全互補或相似不是必要的。所用序列中一個或多個核苦酸可以不同于靶基因。因此，根據(jù)本發(fā)明用在下調(diào)基因表達中的序的變體。該序列不需要包括開放閱讀框，或者指定可翻i奪RNA?？梢詢?yōu)選的是，各反義和正義RNA分子有足夠的同源性用于雜交。甚至在所使用的序列和把基因之間有約5%、10%、15%或20%或更多錯配的情況下，還可以有基因表達的下調(diào)。有效地的是，所述同源性應(yīng)足以使基因表達的下調(diào)發(fā)生。在其它實施方案中，可以通過選擇性植物育種方法降低SHORT-ROOT(SHR)多肽在植物中的表達，以便產(chǎn)生具有增加的地上生長和/或生物質(zhì)的植物，其中該植物育種方法將SHORT-ROOT(SHR)氨基酸或核酸序列用作分子標(biāo)志物。產(chǎn)生具有增加的生長和/或生物質(zhì)的植物的方法可以包括提供植物群體，確定該群體中一種或多種植物的SHR多肽表達量，以及的一種或多種植物。所鑒定的植物可以進一步繁殖或例如與具有降低的SHR表達的其它植物雜交或自交以產(chǎn)生近交系。可以確定后代植物群體中SHR多肽的表達，并鑒定一種或多種具有降低的SHR多肽表達的后代植物。SHR多肽在植物中的表達可以通過任何便利的方法來確定。在一些實施方案中，SHR多肽的表達量可以在蛋白水平確定。產(chǎn)生具有增加的生長和/或生物質(zhì)的植物的方法可以包括提供植物群體，確定所述群體中一種或多種植物的SHR多肽量，以及鑒定所述群體中相對于該群體的其它成員具有降低的SHR多肽量的一種或多種植物。SHR多肽的量可以在該植物的一種或多種細(xì)胞中確定，所述細(xì)胞優(yōu)選來自該植物的地上部分或組織的細(xì)胞，例如芽的維管系統(tǒng)以及初生和次生分生組織、特別地形成層帶中的細(xì)胞。SHR多肽的量可以采用任何適合的技術(shù)確定?？梢苑奖愕夭捎妹庖邔W(xué)技術(shù)，例如Western印跡，采用結(jié)合SHR多肽且顯示出與該植物中其它抗原極少結(jié)合或不結(jié)合的抗體。例如，通過讓包含植物細(xì)胞的樣品與針對SHR多肽的抗體或其它特異結(jié)合成員接觸，并確定SHR多肽與樣品的結(jié)合，來確定植物細(xì)胞中SHR多肽的量。特異結(jié)合成員的結(jié)合量指示在該細(xì)胞中表達的SHR多肽的量。在其它實施方案中，SHR多肽的表達可以在核酸水平上確定。例如，可以確定編碼SHR多肽的核酸的量。產(chǎn)生具有增加的地上生長和/或生物量的植物的方法可以包括提供植物群體，確定所述群體的一種或多種植物的細(xì)胞中編碼SHR多肽的核酸如mRNA的水平或量，以及15酸的一種或多種才直物。植物細(xì)胞中編碼核酸的水平或量可以例如通過4企測細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的編碼核酸的量來確定。這可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如Northern印跡或RT-PCR來進行。適合的細(xì)胞可以來自植物的地上部分或組織，例如芽中的維管系統(tǒng)以及初生和次生分生組織，特別地形成層帶?？蛇x擇地，可以確定影響SHR多肽的表達或活性的序列變異的存在。產(chǎn)生具有增加的生長和/或生物質(zhì)的植物的另一方法可以包括提供植物群體，確定所述群體的一種或多種植物的細(xì)月包中，編碼SNR多肽的核酸內(nèi)存在一種或多種序列變異如多態(tài)性、突變或高曱基化(hypermethylation)區(qū)域，其中所述一種或多種序列變異降低但不消除所編碼的SHR多肽的表達或活性，以及鑒定所述群體中，相對于所述群體的其它成員，具有降低SHR多肽的表達或活性的一種或多種序列變異的一種或多種植物。在上文中對SHR多肽和編碼核酸有更詳細(xì)的i兌明。降低或消除表達或活性的序列變異，如突變和多態(tài)性，可以包括相對于野生型核苷酸序列的一個或多個核苷酸的缺失、插入或置換，基因擴增或曱基化的增加或減少，例如高曱基化。所述一種或多種序列變異可以位于核苦酸序列的編碼或非編碼區(qū)。編碼該組分的基因的編碼區(qū)內(nèi)的突變可以阻止全長活性蛋白的翻譯即截短突變，或者允許全長但無活性或功能受損蛋白的翻譯，即錯義突變。編碼該組分的基因的非編碼區(qū)(例如調(diào)節(jié)元件)內(nèi)的突變或表觀遺傳變化如曱基化可以阻止基因的轉(zhuǎn)錄。包含一種或多種序列變異的核酸可以編碼具有降低的或消除了活性的變體多肽，或者例如通過調(diào)節(jié)元件活性的改變，可以編碼野生型多肽，該野生型多肽在細(xì)胞內(nèi)極少表達或不表達。包含一種或多種序列變異的核酸可以相對于對照序列具有一個、兩個、三個、四個或更多個突變或多態(tài)性。核酸內(nèi)一種或多種序列變異的存在可以通過4企測變體核酸序列在一種或多種植物細(xì)胞中的存在或通過檢測該核酸序列編碼的變體多肽的存在來確定。優(yōu)選的核酸序列變異檢測技術(shù)包括ARMSTM等位基因特異擴增、OLA、ALEXTM、COPS、Taqman、分子信標(biāo)、RFLP以及基于限制性位點的PCR和FRET技術(shù)。本領(lǐng)域中有很多適合的方法來確定植物細(xì)胞中編碼SHR多肽的核酸的量，或者在編碼SHR多肽的核酸中是否存在序列變異(參見例如MolecularCloning:aLaboratoryManual:3rdedition(分子克隆實馬全室手冊第三版)，Sambrook&Russell(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPressNY;CurrentProtocolsinMolecularBiology(當(dāng)前分子生物學(xué)規(guī)程)，Ausubeletal.eds.JohnWiley&Sons(1992);DNACloning,ThePracticalApproachSeries(DNA克隆，實用方法系列)(1995)，序列版D.RickwoodandB.D.Hames，IRLPress,Oxford,UK以及PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(PCR^見禾呈方法和應(yīng)用指南)(Innis,etal.1990.AcademicPress,SanDiego,Calif.))。Nollauetal.,Clin.Chem.43，1114-1120,1997以及標(biāo)準(zhǔn)教科書如"LaboratoryProtocolsforMutationDetection(突變檢測的實驗室規(guī)程)"，U.Landegren編輯，OxfordUniversityPress,1996和"PCR",第二版，Newton&Graham,BIOSScientificPublishersLimited,1997對很多目前用于序列變異檢測的方法進行了綜述。優(yōu)選的多肽序列變異技術(shù)包括免疫測定法，其在本領(lǐng)域中是公知的，例如DMKemeny的APracticalGuidetoELISA(ELISA應(yīng)用指南)，PergamonPress1991;PrinciplesandPracticeofImmunoassay(免疫觀'J定的原理和應(yīng)用)，第二版，CPPrice&DJNewman,1997,在美國和加拿大由StocktonPress出X反，在英國由MacmillanReference出版。在一些實施方案中，可以對核酸或其所擴增區(qū)域進行測序，以鑒定或確定其中多態(tài)性或突變的存在?？梢酝ㄟ^將所獲得的序列與已知的SHR序列(例如在序列數(shù)據(jù)庫中列出的)進行比較而鑒定多態(tài)性或突變?？蛇x擇地，可以將其與來自對照細(xì)胞的相應(yīng)核酸的序列比較。特別地，可以確定引起功能降低但非完全廢除功能的一個或多個多態(tài)性或突變的存在。測序可以采用多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的任一種進行。對擴增產(chǎn)物的測序可以例如包括異丙醇沉淀、重懸浮和采用TaqFS+Dye終止測序試劑盒(例如，來自GEHealthcareUKLtdUK)的測序。延伸產(chǎn)物可以在ABI377DNA測序儀上進行電泳并采用SequenceNavigator軟件分析數(shù)據(jù)。物質(zhì)、生長和生長速率進行檢驗。產(chǎn)生具有增加的生長和/或生物質(zhì)的植物的方法可以包括讓第一和第二植物雜交以產(chǎn)生后代植物群體；確定該群體中后代植物的ShortRoot(SHR)多肽的表達，以及鑒定該群體中相對于對照，SHR多肽的表達降低但是未消除的后代植物。相對于對照(例如該群體中的其它成員)，SHR多肽的表達P爭低但是未消除(即未完全排除表達)的后代植物，可以顯示出相對于對照增加的初生和/或次生生長或增加的生物質(zhì)積累。木本植物可以顯示增加的木材密度。所鑒定的后代植物還可以繁殖或例如與所述第一或第二植物雜交(即回交)或自交以產(chǎn)生近交系。所鑒定的后代植物可以相對于對照就增加的生物質(zhì)、生長和生長速度進行檢驗。本發(fā)明的其它方面提供了本文所述SHORT-ROOT(SHR)多肽或編碼核酸作為標(biāo)志物用于選擇性植物育種的用途，其中該植物相對于對照植物，在其地上部分具有增加的生物質(zhì)或生長，以及采用SHORT-ROOT(SHR)氨基酸序列或編碼核酸序列的選擇性植物育種的方法，該植物相對于對照植物，在其地上部分具有增加的生物質(zhì)或生長。在一些實施方案中，可以通過隨才幾突變，然后篩選SHR表達降^f氐的突變體，來產(chǎn)生具有降低的SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的植物。適合的技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的，包括定向誘導(dǎo)基因組局部損傷(TILLING)。TILLING為高通量的篩選技術(shù)，其導(dǎo)致對特異靶基因中非GMO來源的突變的系統(tǒng)鑒定(ComaiandHenikoff,ThePlantJournal(2006)45,684~694)。產(chǎn)生具有增加的生長和/或生物質(zhì)的植物的方法可以包括讓植物群體暴露于誘變劑，確定所述群體中一種或多種植物的SHR多肽或核酸的表達，以及18鑒定相對于所述群體的其它成員具有降低的SHR多肽表達的植物。適合的誘變劑包括甲基磺酸乙酯(EMS)。確定植物中SHR多肽或核酸的表達的方法在上文有更詳細(xì)的說明。所鑒定的植物還可以相對于對照就增加的地上生物質(zhì)、生長和/或生長速率進行檢驗。被鑒定為相對于對照(例如群體的其它成員)具有降低的SHR多肽表達的才直物，可以顯示出相對于對照的、地上部分中增加的初生和/或次生生長或增加的生物質(zhì)積累。木本植物可以顯示出增加的木材密度。按上文所述產(chǎn)生或鑒定的植物可以有性或無性繁殖或栽種以產(chǎn)生子代或后代。從一個或多個細(xì)胞再生的植物子代或后代可以有性或無性繁殖或栽種。植物或其子代或后代可以與其它植物或與其自身雜交。本發(fā)明的另一方面提供了通過本文所述方法產(chǎn)生的植物，其中所述植物相對于對照植物顯示出增加的生長和/或生物質(zhì)。還提供所述植物的任何部分或繁殖體，例如種子、自身或雜交子代和后代。本發(fā)明的植物可以在一種或多種特性上不是純育的(breedtrue)。植物品種(plantvarieties)可以不包括在內(nèi)，特別地根據(jù)植物育種者權(quán)利的可登i己才直物品種。除了通過本文所述方法產(chǎn)生的植物，本發(fā)明還包括這種植物的任何克隆、種子、自身或雜交子代和后代，以及其中任一種的可以用于有性或無性繁育或繁殖的任何部分或繁殖體，例如插條和種子。本發(fā)明還包括作為有性或無性繁殖子代的植物，所述植物的克隆或后代，所述植物、子代、克隆或后代的任何部分或繁殖體。在其它實施方案中，SHORT-ROOT(SHR)多肽在細(xì)胞中的表達可以相對于對照物增加，以增加物的地上生長和/或生物質(zhì)。SHORT-ROOT(SHR)多肽在所述植物細(xì)胞內(nèi)的表達例如可以增加多至對照植物細(xì)胞內(nèi)表達的2倍、5倍、10倍或100倍。SHORT-ROOT(SHR)多肽在所述植物的細(xì)胞內(nèi)的表達可以通過任何便利的方法來增加。例如，可以通過在所述植物的細(xì)胞內(nèi)表達編碼SHORT-ROOT(SHR)多肽的異源核酸而增加所述植物細(xì)胞中的表達。SHORT-ROOT(SHR)多肽在上文有更詳細(xì)的i兌明。編碼SHR多肽的核酸可以包含SEQIDNO:1,3,5,7,9，11，13或15的核苷酸序列或由其組成，或者可以為這些序列中任一種的保留了SHR活性的變體或片段。變體序列可以為SEQIDNO:1,3，5,7,9,11，13或15的突變體、同源物或等位基因，可以通過核酸中一個或多個核香酸的一個或多個添加、插入、缺失或置換而與這些序列之一不同，所述添加、插入、缺失或置換導(dǎo)致所編碼多肽中一個或多個氨基酸的添加、插入、缺失或置換。當(dāng)然，也包括不影響所編碼氨基酸序列的核酸改變。具有作為SEQIDNO:1,3,5,7,9，11，13或15序列的變體的核苷酸序列的編碼SHR多肽的核酸可以包含與SEQIDNO:1,3，5，7,9,11，13或15的核酸序列有至少30%序列一致性的序列，所述序列一致性優(yōu)選高于40%、高于50%、高于60%、高于65%、高于70%、高于80%、高于90%或高于95%。上文描述了序列一致性。片段或變體可以包含編碼功能性SHR多肽的序列，所述功能性SHR多肽即保留了野生型SHR基因編碼的多肽的一個或多個功能性特征的多肽，所述功能性特征例如刺激植物生長的能力。在其它實施方案中，具有作為SEQIDNO:1,3,5,7,9,11,13或15序列的變體的核苷酸序列的編碼SHR多肽的核酸可以在嚴(yán)緊條件下與該核酸序列或其互補物選4奪性雜交。例如對于約80-90%—致性的序列的雜交，嚴(yán)緊條件包括在0.25MNa2HP04,pH7.2、6.5%SDS、10%硫酸葡聚糖中于42°C下雜交過夜，以及最后在O.lxSSC、0.1%SDS中于55°C洗滌。對于檢測大于約90%—致性的序列，合適的條件包括在0.25MNa2HPO4,pH7.2、6.5%SDS、10%硫酸葡聚糖中于65°C下雜交過夜以及最后在O.lxSSC、0.1%SDS中于60°C洗滌。另一選擇是5xSSPE(最終0.9MNaCl、0.05M磷酸鈉、0.005MEDTApH7.7)、5xDenhardt溶液、0.5%SDS的溶液，50°C或65°C過夜，所述選擇可能特別地適合于植物核酸制劑。根據(jù)需要，洗滌可以在65。C下于0.2xSSC/0.1%SDS中或50-60°C下于lxSSC/0.1%SDS中進行。編碼ShortRoot(SHR)多肽的核酸或抑制ShortRoot(SHR)多肽表達的核酸(即抑制物RNA分子)可以可操作地連4妄至調(diào)節(jié)序列，例如啟動子，如組成型、誘導(dǎo)型或組織特異或發(fā)育特異啟動子?？刹僮鞯剡B接至SHR核酸序列的調(diào)節(jié)序列優(yōu)選為對SHR核酸序列是異源的或外來的(例如，來自生物體的不同種、類或型)。優(yōu)選地，該調(diào)節(jié)序列為植物特異調(diào)節(jié)序列，以在植物細(xì)胞內(nèi)提供有效表達。植物特異調(diào)節(jié)序列或元件相對于其它細(xì)胞類型，優(yōu)先指導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)核酸的表達(即轉(zhuǎn)錄)。例如，自這種序列的表達在非植物細(xì)胞如細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞中可以降低或者消除。很多適合的調(diào)節(jié)序列在本領(lǐng)域中是已知的，并且可用在本發(fā)明中。適合的調(diào)節(jié)序列的實例可以源于植物病毒，例如在基本上所有植物組織中都高水平表達的花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)基因啟動子(Benfeyetal,(1990)EMBOJ9:1677-1684)。也可以使用葉特異啟動子(例如參見LagrangeetalPlantCell.19979(8):1469-1479)。其它適合的組成型調(diào)節(jié)元件包括花椰菜花葉病毒19S啟動子；玄參(Figwort)花葉病毒啟動子；以及胭脂堿合酶(nos)基因啟動子(Singeretal.,PlantMol.Biol.14:433(1990);An,PlantPhysiol.81:86(1986》。在一些實施方案中，可以采用誘導(dǎo)型啟動子，如酒精誘導(dǎo)型alc基因表達系統(tǒng)(Roslanetal.，PlantJournal;2001Oct;28(2):225-35)。異源核酸可以包含在核酸構(gòu)建體或載體上。所述構(gòu)建體或載體優(yōu)選適合于轉(zhuǎn)化進植物細(xì)胞和/或在其中表達。載體是任何雙鏈或單鏈的線狀或環(huán)狀質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或土壤桿菌二元載體及其它，它們可以或不可自我傳播或流動，并且可轉(zhuǎn)化原核或真核宿主，特別地植物宿主，其或者整合進細(xì)胞基因組或者在染色體外存在(例如具有復(fù)制原點的自主復(fù)制質(zhì)粒)。具體地，包括穿梭載體，穿梭載體指天然的或設(shè)計的DNA載體，其能夠在兩種不同生物體內(nèi)復(fù)制，所述生物體可以選自放線菌和相關(guān)物種、細(xì)菌和真核生物(例如高等植物、哺乳動物、酵母或真菌)細(xì)胞。包含上述核酸的構(gòu)建體或載體不需要包含啟動子或其它調(diào)節(jié)序列，特別地如果該載體是用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞以重組進基因組。構(gòu)建體和載體還可以包含由基因組成的可選擇遺傳標(biāo)志物，所述基21因賦予可選擇表型，例如對抗生素的抗性，所述抗生素如卡那霉素、潮霉素、草酊磷(phosphinotricin)、綠黃隆、氨曱蝶呤、慶大霉素、壯觀霉素、咪唑啉酮類、草甘膦和d-氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠為特別地在植物細(xì)胞中的重組基因表達構(gòu)建載體和設(shè)計操作步驟?？梢赃x擇或構(gòu)建含有適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的適合載體，所述調(diào)節(jié)序列包括啟動子序列、終止子片段、多腺苷化序列、增強子序列、標(biāo)志物基因以及^L情形而定的其它序列。至于進一步的細(xì)節(jié)，例如參見A/o/ecw/arC7om'"gv<3丄a6oratoo7^fo"wa/(分子克隆實馬全室手冊),第三版,Sambrook&Russell，2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress。本領(lǐng)域技術(shù)人員可針對例如在微生物或植物細(xì)胞內(nèi)的重組基因表達而構(gòu)建載體并設(shè)計操作步驟?？蛇x擇或構(gòu)建含有適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的適合載體，所述調(diào)節(jié)序列包括啟動子序列、終止子片段、多腺苷化序列、增強子序列、標(biāo)志物基因以及視情形而定的其它序列。至于進一步的細(xì)節(jié)，例^口參見Mo/ectz/arC7om力gva丄aZ)0n2to^yMawwa/(分子克隆實馬全室手冊)，第三版，Sambrooketal，2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress和尸ratocofe/"Mo/ec"/ar所o/ogy(分子生物學(xué)規(guī)程)，第二版，Ausubeletal.eds.JohnWiley&Sons,1992。Bevan在Nucl.AcidsRes.(1984)12,8711-8721中以及Guerineau和Mullineaux(1993)在PlantMolecularBiology(植物分子生物學(xué))Labfax(CroyRRDed)的Planttransformationandexpressionvectors(才直4勿專爭4b和表達載體),Oxford,BIOSScientificPublishers,pp121-148中描述了之前使用的在植物中獲得廣泛成功的具體程序和載體。當(dāng)將所選擇的基因構(gòu)建體引入細(xì)胞時，必須考慮到某些問題，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。待插入的核酸應(yīng)組裝在含有將驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的有效調(diào)節(jié)元件的構(gòu)建體內(nèi)。必定有可利用的將構(gòu)建體輸送進細(xì)胞的方法。一旦構(gòu)建體位于細(xì)胞膜內(nèi)，將發(fā)生或不發(fā)生整合進內(nèi)源染色體物質(zhì)。最后，把細(xì)胞類型優(yōu)選是可再生為完整植株的細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)可以用于將核酸構(gòu)建體和載體引入植物細(xì)胞，以產(chǎn)生具有本文所述特性的轉(zhuǎn)基因植物。土壤桿菌轉(zhuǎn)化為本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛使用的一種轉(zhuǎn)化木本植物物種、特別地硬木物種如楊木的方法。產(chǎn)生穩(wěn)定的、有繁殖力的轉(zhuǎn)基因植物現(xiàn)在在本領(lǐng)域是常規(guī)的(Toriyama,etal.(1988)6,1072-1074;Zhang,etal.(1988)P/a"ZCe〃7,379-384;Zhang,etal.(1988)77麼柳/G匿Z76，835-840;Shimamoto,etal.(1989)淑置338,274-276;Datta,etal.(1990)所o/7fec/wo/ogy8,736-740;Christou,etal.(1991)腸/7fec/mo/，9,957-962;Peng,etal.(1991)InternationalRiceResearchInstitute,Manila,Philippines563-574;Cao,etal.(1992)尸/a"/Ce〃11，585-591;Li,etal.(1993)尸/朋fCe〃12，250-255;Rathore，etal.(1993)尸/虛Mo/ec油rS油gy21,871-884;Fro匪，etal.(1990)所o/Tec/"o/ogy8,833-839;Gordon-Kamm,etal.(1990)P/a"/CW/2,603-618;D'Halluin,etal.(1992)P/朋/Ce〃4,1495-1505;Meters,etal.(1992)尸/朋ZAfo/ecw/ar歷o/ogy18，189-200;Koziel，etal.(1993)腸tec/mo/ogy11,194-200;Vasil，I.K.(1994)尸/滅Mo/鐘/w5油gy25,925-937;Weeks,etal.(1993)尸/朋Z尸A，/o/ogy102,1077-1084;Somers,etal.(1992)歷o/7k:/mo/ogy10,1589-1594;W092/14828;Nilsson,O,etal(1992)7hmsg綴'ciesearcA1,209-220)。當(dāng)土壤桿菌轉(zhuǎn)化例如在一些棵子植物物種中不高效或無效時，可以優(yōu)選其它的方法，如孩i彈或顆粒轟擊(US5100792,EP-A-444882,EP-A-434616)、電穿孑L(EP290395,WO8706614)、顯孩i注射(WO92/09696,WO94/00583,EP331083,EP175966，Greenetal.(1987)尸/a"Zrzht/eam/Ce〃CW^w,AcademicPress)、直接DNA攝取(DE4005152,WO9012096，US4684611)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝取(例如Freemanetal.戶/a"fCe〃尸/^w'o/.29:1353(1984))或者渦》走方法(vortexingmethod)(例如Kindle,/WASt/.".87:1228(1990d))。用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的物理方法在Oard,1991,5/oto:A.A/v.9:1-11中有綜述?？蛇x擇地，可以采用不同技術(shù)的組合，以增強轉(zhuǎn)化過程的有效性，例如以土壤桿菌包被的微粒轟擊(EP-A-486234)或者微彈轟擊，以引發(fā)傷口，接著與土壤桿菌共培養(yǎng)(EP-A-486233)。轉(zhuǎn)化后，可以例如從單個細(xì)胞、愈傷組織或葉盤再生植抹，這在本領(lǐng)域是標(biāo)準(zhǔn)方法?；旧先魏沃参锒伎蓮脑撝参锏募?xì)胞、組織和器官完整再生。在Vasiletal.，Ce〃朋c/S函加,cCe〃Gewe".csq/^P/a打fe卩控*勿應(yīng)培#和#細(xì)應(yīng)遽#教^/'7/和瓜丄aZ)簡to^y/Voc油my77z".,'y^/&a"<ms卩^-發(fā)皇^^及^j^」，AcademicPress,1984以及Weissbach禾口^Veissbach,_/br尸/a",A/o/ecw/ar參夢才法人AcademicPress,1989中對可利用的技術(shù)進行了綜述。4奪特定方法實施本發(fā)明的人員的經(jīng)驗和偏好來確定。對技術(shù)人員顯而易見的是，對將核酸？1入植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的特定選擇對本發(fā)明不是必要的，也不是限制，對植物再生技術(shù)的選擇也是如此。本發(fā)明的另一方面提供了產(chǎn)生具有增加的生長和/或生物質(zhì)的植物的方法，包括借助轉(zhuǎn)化將異源核酸并入4直物細(xì)胞，該核酸改變SHORT-ROOT(SHR)多肽的表達，以及；從一個或多個所轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物。在上文所述的一些實施方案中，該異源核酸可以增加SHORT-ROOT(SHR)多肽的表達。例如，該異源核酸可以編碼SHORT-ROOT(SHR)多肽。才直物地上部分的生長和/或生物質(zhì)可以通過SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的增力口而i曾力口。在上文所述的其它實施方案中，該異源核酸可以降低但是不消除SHORT-ROOT(SHR)多肽的表達。例如，該異源核酸可以編碼或轉(zhuǎn)錄抑制SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的核酸，例如RNAi分子。用這類方法產(chǎn)生的植物可以相對于對照植物顯示出增加的生長和/或生物質(zhì)。例如，植物的地上部分可以相對于對照顯示出增加的生長和/或生物質(zhì)。優(yōu)選地，該核酸與細(xì)胞基因組核酸重組，以致它穩(wěn)定地并入其中。SHR多肽、編碼核酸和/或包含該核酸的載體在上文有更詳細(xì)的描述，并且對其所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以是異源的(例如，外源的或外來的)。所再生的^i物相對于對照顯示出增加的生長和/或生物質(zhì)。例如，該植物的地上部分可以顯示出增加的生長和/或生物質(zhì)。再生的木本植物可以顯示出增加的木材密度。從植物細(xì)胞再生的植物可以有性或無性繁殖或者栽培以產(chǎn)生子代或后代。從一個或多個細(xì)胞再生的植物的子代或后代可以有性或無性繁殖或栽培。本發(fā)明的另一方面提供了通過本文所述方法產(chǎn)生的植物，其中所述植物相對于對照植物顯示出增加的生長和/或生物質(zhì)，例如增加的地上生長和/或生物質(zhì)。例如，提供了這樣的植物，所述植物在其一個或多個細(xì)胞中包含編碼SHORT-ROOT(SHR)多肽或SHORT-ROOT(SHR)多肽表達抑制物的異源核酸。還提供了這種植物的任何部分或繁殖體，例如種子、自身或雜交子代和后代。植物可以為在一個或多個特性上非純育的植物。植物品種可以不包括在內(nèi)，特別地根據(jù)植物育種者權(quán)利的可登記植物品種。應(yīng)注意的是，不需要僅僅因為在植物基因組內(nèi)穩(wěn)定含有轉(zhuǎn)基因(被引入該植物或其先祖的細(xì)胞)而認(rèn)為該植物為"植物品種"。除了植物，這種植物的任何克隆、種子、自身或雜交子代和后代，以及其中任一種的任何部分或繁殖體，例如插條和種子，都可以用于有性或無性繁育或繁殖。作為有性或無性繁殖子代的植物，這樣的植物的克隆或后代，所述^i物的任何部分或繁殖體，子代、克隆或后代也可能是有用的。植物可以相對于野生型(即"未修飾的")植物具有增加的或降低的SHR多肽表達?？梢岳缤ㄟ^在植物細(xì)胞內(nèi)表達編碼SHR多肽的核酸而增加SHR表達，或者可以例如通過在植物細(xì)胞內(nèi)表達引起SHR反義、正義或RNAi下調(diào)的核酸而降低SHR表達，如上文所述。視情況可以在本文所述方法中進行對照實驗。進行適當(dāng)?shù)膶φ胀耆幱诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員的技能和能力范圍內(nèi)。用于根據(jù)本文所述發(fā)明的任一方面的適合植物的實例包括單子葉植物、雙子葉植物、棵子植物和藻類、蕨類和蘚類。特別關(guān)注被改造為攜帶了如上文所述異源核酸的轉(zhuǎn)基因高等植物，尤其是農(nóng)作物，例如谷物和花，包括煙草、葫蘆、胡蘿卜、蔬菜型蕓苔、瓜類、辣椒、葡萄藤、萵苣、草莓、油籽型蕓苔、甜菜、小麥、大麥、玉米、水稻、大豆、豌豆、高粱、向日葵、番茄、土豆、胡椒、菊花、康乃馨、亞麻籽、大麻和黑麥。本文給出了源于擬南芥、楊木、水稻、大麥和苜蓿的SHR蛋白序列實例。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述植物為多年生植物，例如木本多年生植物。木本多年生植物具有大于2年的生命周期并包括僅發(fā)生營養(yǎng)生長的長幼年期。這與一年生植物或草本植物如擬南芥(JraZ^o;whAfl/^mz)或番茄(丄yco/eraZcw2eycw/e^wm)不同，它們具有在1年內(nèi)完成的生命周期。木本多年生植物具有堅硬的木質(zhì)化組織并形成灌木或喬木。優(yōu)選的多年生植物為喬木(即，形成喬木物種的植物)。木本多年生植物可以為棵子植物(無花植物)或被子植物(有花植物)。被子植物分為兩大類，而多年生植物可以為單子葉或雙子葉^C子植物。木本多年生植物的實例包括針葉樹，如柏樹、花旗松、冷杉、巨杉、鐵杉、雪松、刺柏、落葉松、松樹、紅杉、云杉和紫杉；硬木樹，如刺槐、桉樹、鵝耳櫪、山毛櫸、桃花心木、胡桃、橡樹、白蠟樹、柳樹、山胡桃木、樺樹、栗樹、楊木、榿木、楓樹和西克莫樹；結(jié)果實植物，如蘋果樹、李樹、梨樹、橡膠樹、橘樹、獼猴桃樹、檸檬樹、櫻桃樹、葡萄樹和無花果樹；以及商業(yè)上重要的其他植物，如棉花、竹和橡膠。本發(fā)明的其它方面涉及SHR啟動子在篩選改變(即增加或降低)植物中SHR多肽表達的化合物方面的用途。篩選增加植物地上生長和/或生物質(zhì)的化合物的方法包括提供包含可操作地連接到報告基因的SHR啟動子的核酸構(gòu)建體，該報告基因在表達系統(tǒng)中表達，讓該構(gòu)建體與測試化合物接觸，以及確定該報告基因的表達，其中測試化合物存在時相對于測試化合物不存在時，報告基因的表達增加或降低指示該化合物增加植物的地上生長和/或生物質(zhì)。SHR啟動子可以具有SEQIDNO:22或23的序列，或者可以為其變體或片段。參照SHR序列如SEQIDNO:22和23的變體和片段在上文有描述。適合的報告基因在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，包括編碼熒光蛋白如GFP的基因。SHR啟動子還可以用于驅(qū)動異源基因在木本多年生植物的木材形成組織中的表達。木材形成組織包括芽中的維管系統(tǒng)以及初生和次生分生組織，包括形成層帶。產(chǎn)生植物的方法可以包括通過轉(zhuǎn)化向植物細(xì)胞并入包含可操作地連接至異源基因的SHORT-ROOT(SHR)啟動子的核酸構(gòu)建體或載體，以及；從一個或多個所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生該植物。優(yōu)選地，該植物為木本多年生植物且該SHORT-ROOT(SHR)啟動子驅(qū)動該異源基因在該木本多年生植物的木材形成組織內(nèi)表達。適合的異源序列可以包括這樣的序列，其編碼改變所轉(zhuǎn)化^iL物的細(xì)胞、組織和/或器官的生長或組成的多肽，特別地是生長促進基因和改善木材質(zhì)量的基因。所再生的^:物可以如上文所述雜交或繁殖。本發(fā)明的其它方面提供了包含可操作地連接至異源基因的SHORT-ROOT(SHR)啟動子的核酸構(gòu)建體或載體，所述核酸構(gòu)建體或載體在特異地在木本多年生植物的木材形成組織內(nèi)表達異源基因方面的用途，以及通過將所述構(gòu)建體或載體引入木本多年生植物而在所述木本多年生植物的木材形成組織內(nèi)表達異源基因的方法。鑒于目前的公開內(nèi)容，本發(fā)明的各個其它方面和實施方案對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。在本說明書中提到的所有文件都通過引用其整體并入本文。用在本文時，認(rèn)為"和/或，，是兩指定特征或組分的每一個的具體公開，伴隨或不伴隨另一個。例如，認(rèn)為"A和/或B"是對(i)A、(ii)B以及(iii)A和B的每一個的具體公開，如同每一個在本文中被單獨指出一樣。除非上下文另有說明，以上給出的特征說明和定義不限于本發(fā)明的任何特定方面或?qū)嵤┓桨福峭鹊貞?yīng)用于所描述的所有方面和實施27方案。本發(fā)明的某些方面和實施方案現(xiàn)在將通過實施例并參考以下描迷的附圖進行闡述。圖1顯示了與AtSHR具有相似性的楊木和擬南芥序列的無根進化樹。以來自GRAS家族SHR分枝的楊木和擬南芥成員的全長預(yù)測氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)生分析。ClustalW被用于比對蛋白序列。Phylip格式用于樹輸出，采用1000bootstrap重復(fù)。采用TreeViewX(版本0.5.0)顯示該進化樹。圖2顯示了預(yù)測的y^S/漢編碼序列與三種楊木SHR樣蛋白尸"Z/i^、尸"Z/iZ4和尸Wi/i2B之間的核苷酸序列比對。圖3顯示了PtSHRl、PtSHR2A、PtSHR2B和AtSH的推斷氨基酸序列的比較。相同的、相似的和保守的氨基酸分別以黑色和灰色背景顯示。顯示了在GRAS家族的成員間保守的氨基酸基序。圖4顯示了WTT89和PtSHRlRNAi系2B樹的差異生長。在溫室內(nèi)生長52天后的樹和作為組織培養(yǎng)中的原始幼苗(initialplantlets)的兩抹相同樹(小圖)。圖5顯示溫室內(nèi)生長52天后，楊木樹干的干周測量。楊木PtSHRlRNAi系(2A、2B和4A)的獨立轉(zhuǎn)化事件與WTT89比較。結(jié)果表示為均值加減1SD。均值為每一RNAi和WTT89系的9棵樹的10節(jié)間的平均寬度，從地上200mm的節(jié)間開始。圖6顯示了WTT89和PtSHRlRNAi系2B的橫切面。切面取自地上約500mm的節(jié)間的中間并以曱苯胺藍(lán)染色。雙箭頭指示木質(zhì)部(木質(zhì)細(xì)胞)。圖7顯示了溫室內(nèi)生長52天后，楊木樹干的所積累的生物質(zhì)。楊木PtSHRlRNAi系(2A、2B和4A)的獨立轉(zhuǎn)化事件與WTT89比較。結(jié)果表示為均值加減lSD。均值為自地上200mm的樹干加上樹葉的平均總鮮重(克)，n=9。圖8顯示了在溫室內(nèi)生長52天后，楊木樹干的平均節(jié)間長度。楊木PtSHRlRNAi系(2A、2B和4A)的獨立轉(zhuǎn)化事件與WTT89比較。結(jié)果表示為均值加減1SD。均值為從地上200mm開始的15個完全伸展的節(jié)間的平均長度，n=9。圖9顯示了溫室內(nèi)生長52天后，楊木樹干的平均葉片(節(jié))數(shù)。楊木PtSHRlRNAi系2B與WTT89比較。結(jié)果表示為均值加減1SD。均值為/人地上200mm起至至少40mm長的最嫩葉片的平均葉片凄t,n=9。圖10顯示了來自楊木PtSHRlRNAi系(2A和2B)的獨立轉(zhuǎn)化事件和WTT89的完全伸展節(jié)間中間的管胞的長度和寬度比較。結(jié)果表示為均值加減1SD。均值為管胞的平均寬度和長度(任意單位)，n=30。A&C和圖11顯示了溫室內(nèi)生長52天后，楊木樹干的完全伸展葉片的平均葉片面積和鮮重。楊木PtSHRlRNAi系(2A、2B和4A)與WTT89比較。結(jié)果表示為均值加減1SD。均值為系2A、2B、4A和WTT89每一種的9棵不同樹的從地上200mm起的15個完全伸展葉片的平均面積和重量。圖12顯示了楊木植抹多種器官的PtSHRl轉(zhuǎn)錄水平的比較。數(shù)據(jù)表示為相對表達log2量度，誤差棒指示1SD。數(shù)據(jù)表示相對于所有組織合并樣品的PtSHRl轉(zhuǎn)錄本水平(例如頂端相對合并，葉片相對合并)。頂端=芽頂端；PrimRoot:初生根(組織培養(yǎng)生長)；SecRoot二次生(側(cè)面)根(組織培養(yǎng)生長)。圖13顯示了71"http:///抑制的擬南齊1^^和\￥丁對照植物的萌發(fā)和早期生長。A.轉(zhuǎn)基因系4、6和11的種子和WT種子的萌發(fā)。B.23。C下18小時后WT和系11種子。C.23。C下40小時后WT和系11種子。D.23。C下5.5天后WT和系11苗。E.23。C下5.5天后黃化的WT和系11種子。R23。C下5.5天后光下生長的WT和系11苗的平均子葉大小。G.23°C下5.5天后黃化苗的平均胚軸長度。H.23°C下5.5天后WT、Wr和轉(zhuǎn)基因苗的平均根長度。用于在光下生長的植物的平皿(A、B、C、D、F和H)含有1%蔗糖。黃化苗在不含蔗糖的平i上生長。A的結(jié)果表示為140粒種子樣品隨時間的萌發(fā)百分比。所有的實驗都進行三次，具有類似結(jié)果。所顯示的結(jié)果為所有三次實驗的代表。用于實驗的WT和RNAi種子在相同條件、相同時間下生長。收集這些種子后，讓它們在進行萌發(fā)和生長實驗前完全成熟至少2月。F、G和H的結(jié)果表示為均值加減1SD。圖14顯示了擬南芥RNAi轉(zhuǎn)基因和WT對照植物生長的比較。A.1529DAG時階段1.06(Boyesetal.，ThePlantCell,Vol.13，1499-1510,2001)的系11植抹。B.相同發(fā)育階段(18DAG時)的WT植抹。C.完全伸展的真葉1和2的面積。D.18DAG時的系11植林(比較B和D)。E.RNAi系和WT對照中18DAG時的總?cè)~面積。F.第18天，WT對照和系11轉(zhuǎn)基因植株的頂端的徑向縱切面。A和B中的圓圈突出了第五真葉。F中的點線代表WT頂端半球(apicaldome)的直徑。圖15顯示了PtSHR基因、AtSHR和水稻以及苜蓿預(yù)測序列的多重氨基酸比對。圖16顯示了白楊(Aspen)的三個獨立S/漢RNAi抑制系(2A-P兩次重復(fù)、2B-P兩次重復(fù)和4A-P)和五個WTT89系的轉(zhuǎn)錄本水平，其通過RT-PCR測定。實驗楊木轉(zhuǎn)化將用于的CaMV35S:反向重復(fù)DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進pK7GWIWG2(I)二元載體(Karimietal,,TrendsPlantSci.2002May;7(5):193-195)，隨后轉(zhuǎn)移至根癌土^裏桿菌04graZ7ac/ehwm似me/ade"力并用于轉(zhuǎn)4匕雜種白才勿(歐洲山才勿(尸o;m/w51tremula)x美洲山片勿(尸ojw/m51^emw/ozV;fes),克隆T89)的干片,殳，如之前所述(Nilssonetal.,1992TransgenicResearch1:209-220)。如之前所述(Nilssonetal.，同上)再生卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體?？寺∮糜谒龇聪蛑貜?fù)構(gòu)建體的序列的引物為5，-^04X4GC7UGG7^4CC4CC4CC4:rC4rC4C7^rC-3，(含有ATTB2位點)和5，"^^GC4GGCrGC7TrC4CCrrC4A4:TGC7TCC-3，(含有ATTB1位點)。用于該序列PCR擴增的模板為EST克隆UB21CPG06。根據(jù)制造商建議的方法(Gateway,Invitrogen,USA)克隆進所述二元載體。用于RT-PCR分析轉(zhuǎn)基因系中殘余轉(zhuǎn)錄本水平的引物序列為5'-C4:rC4CCr04CC7TC4CrCC-3，和5，-G7TCG(^7TG7TGrrGa4a4C-3，。用于確定丹5^i7RNAi抑制系中密切同源物(尸W/fiZ4和尸WZ/i28)的轉(zhuǎn)錄本水平的引物為5，-AGCAACAACAACAACAATCAG-3，和5，-GCACACTCACTAAGAAGCC-3，。分析顯示這兩個基因的轉(zhuǎn)錄本水平?jīng)]有下調(diào)。產(chǎn)生了24個獨立的種系。采用shortroot構(gòu)建體產(chǎn)生的這組轉(zhuǎn)基因桐-在下文稱為"構(gòu)建組"。該構(gòu)建組內(nèi)的每一轉(zhuǎn)基因系都是不同的轉(zhuǎn)化事件，并因此最可能具有插入到植物基因組中不同位置的重組DNA。這可以使得一個構(gòu)建組內(nèi)不同種系間有部分差異。例如，已知當(dāng)采用這里所用類型的RNAi構(gòu)建體時，不同的轉(zhuǎn)化事件將產(chǎn)生具有不同的基因下調(diào)水平的植物。楊木纟直纟朱生長在組織培養(yǎng)中起始并建立生根后，使轉(zhuǎn)基因楊木種系與它們的野生型對照(WTT89)樹一起栽種在溫室中，光周期18h，溫度22。C/15。C(日/夜)。濕度為RH70%。植株每周施肥，采用1比100稀釋的肥料"WeibullsRikaSNPK7畫l-5"(終濃度N03,55g/l;NH4，29g/l;P，12g/l;K，56g/l;Mg7,2g/l;S,7,2g/l;B,0,18g/l;Cu,0,02g/l;Fe,0,84g/l;Mn,0，42g/l;Mo,0,03g/l;Zn,0,13g/L)。收集前才直4朱生長7-9周。在此期間，它們在溫室內(nèi)的位置每2-3天改變一次，并且如結(jié)果中所述，測量其高度和直徑。很多棵野生型樹(一般8-25棵)和包括構(gòu)建組的很多轉(zhuǎn)基因樹在相同的上述條件下平行生長在溫室中。野生型樹和構(gòu)建組之間的所有比較都在各生長組內(nèi)進行。楊木生長測量結(jié)果在以上定義的生長條件下，楊木植抹在溫室中顯示了指數(shù)生長模式(植3朱高度)，直至約80cm的高度或至多第40天最大。在結(jié)果中規(guī)定的時間進行高度測量。在以上定義的生長條件下，樹干寬度隨時間表現(xiàn)出相對線性的增加。高度生長速率測量(這里稱為"最大高度生長速率")定義為在四個連續(xù)高度數(shù)據(jù)點上擬和的線性函數(shù)的斜率。以逐步方式對數(shù)據(jù)點1-4、數(shù)據(jù)點2-5等計算高度生長速率值，例如參見圖4。為每一植抹計算定義為最大值的最大生長速率，其產(chǎn)生自逐步線性回歸分析。核對來自構(gòu)建組內(nèi)個體轉(zhuǎn)化體的高襲義葛,^長遽率值的原始數(shù)據(jù)，以致它們不會基于壞值。免疫細(xì)胞化學(xué)和共聚焦激光掃描顯術(shù)將組織制備為曱基丙晞酸丁酉旨-曱酯樹脂(butyl-methylmethacrylateresin)包埋的半薄切片材料。利用100(iM溶于25mMPipes緩沖液(Sigma),pH6.9的間馬來酰亞胺苯曱酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sigma)預(yù)固定該樹脂包埋的材料。然后以含有3.7%曱醛以及0.2%(v/v)戊二醛的25mMPipes緩沖液，pH6.9將其固定，使其包埋在曱基丙烯酸丁酯-曱酯樹脂混合物中，在UV光下聚合并制備7pm切片。在以丙酮除去樹脂后，在使用初級抗體之前，將切片在含有溶于PBS的5。/。脫脂奶粉的封閉溶液中孵育約45分鐘，該PBS含有137mMNaCl、2.7mMKC1、2mMNa2HP04、2mMKH2P04、pH7.2至7.4以及l(fā)。/。吐溫20。切片在初級抗體溶液中室溫下孵育2h或4。C下過夜，然后在含有0.1。/。吐溫20的PBS中洗滌并使用偶聯(lián)至異硫氰酸熒光素(FITC)的次級抗體。然后將切片在室溫下孵育l小時，如上所述充分洗滌并使用0.01%曱苯胺藍(lán)0染色1分鐘以最小化組織自發(fā)熒光。將切片在Vectashield(VectorLaboratories)中封片，采用帶有488-nm和568-nm氬-氪激光器(產(chǎn)生FITC信號(在505nm至550nm下檢觀'J)和自發(fā)熒光信號(在〉585nm下檢測))的ZeissLSM510儀器，通過共聚焦激光掃描顯微術(shù)片企查切片。這些信號在不同通道中檢測。在組織制備的第二種方法中，用剃刀刀片對新鮮材料切片，并在含有4%多聚曱醛的50mMPipes緩沖液，pH7(其含有5mMMgS04和5mMEGTA)中固定30分鐘。固定后，基本上如同曱基丙烯酸曱酯包埋材料一樣處理所述材料，除了不需要自發(fā)熒光淬滅。因為細(xì)胞壁的自發(fā)熒光低，所以將FITC信號4殳射在透射光成^^上，用于解剖學(xué)細(xì)節(jié)?？贵w針對重組蛋白PtSHRl在兔中產(chǎn)生的單克隆抗體被用于PtSHRl定位。次級抗體為以1:100稀釋度使用的抗兔FITC偶聯(lián)物(JacksonImmuno-ResearchLaboratories,WestGrove，PA)。對照和實驗制備物被平行處理并在相同的共聚焦激光掃描顯微鏡設(shè)置下觀察。為了測試組織自發(fā)熒光，在沒有次級抗體情況下處理材料。初級抗體還用10nmol/mL的抗原飽和，以確定來自實驗切片的信號是可歸因于與靶抗原反應(yīng)的抗體還是某些其它抗體。這些對照產(chǎn)生被認(rèn)為是非特異的最小背景信號。共聚焦掃描激光顯微術(shù)以裝配在LeicaDMIRE2倒置顯微鏡上的LeicaTCSSP2AOBS掃描系統(tǒng)進行CLSM,采用LeicaTCS軟件。采用油校正的(oil-corrected)633物鏡NA二1.4(HCXPLAPOlbd.BL63.0x1.40Ol，Leica)和水校正的633物4竟NA=1.2(HCXPLAPO63.0x1.20WBDUV，Leica)。激發(fā)波長對GFP和FITC為488nm(氬激光器)，對復(fù)染劑4丐熒光白(calcofluorwhite)為340-380nm。對于GFP,在505nm至520nm檢測發(fā)射，對于FITC，在520nm至550nm檢測發(fā)射，對于4丐熒光白，在420nm至440mn檢測發(fā)射。用AdobePhotoshop7.0疊力口圖像。擬南芥轉(zhuǎn)化和生長pK7GWIWG2D(II)二元載體(Karimietal.,TrendsPlantSci.2002May;7(5):193-195)被用于將用于ASi/i的反向重復(fù)DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進Columbia(Co10)WT擬南芥植抹，所述轉(zhuǎn)移采用之前描述的浸花法(CloughandBent，1998,PlanU16:735-43)。另夕卜，采用了以下的種子儲備(純合儲備)，Col0背景，^i/::GUS系A(chǔ)l,純合的，Columbia(Col)背景(MalcolmBennett贈)。對平皿上萌發(fā)的種子，以70%乙醇表面滅菌5分鐘，在Bayrochlor(Bayrol,Planegg,Germany;每400mlH20—片)中聘育30分鐘，然后以無菌蒸餾水(dH20)洗滌三次。經(jīng)滅菌的種子"l妄種在含有l(wèi)xMSJ咅養(yǎng)基(DuchefaBiochemie,Haarlem,TheNetherlands)、1%才直物瓊脂(Duchefa)、1%蔗糖(或?qū)τ邳S化生長為0%蔗糖)，并以1M嗎啉乙磺酸(Sigma,Steinheim,Germany)緩沖至pH5.7的瓊脂平皿上。經(jīng)滅菌的4妄種種子在黑暗中4。C春化最少3天，隨后使其在光子通量密度1780|iEm—2s"的連續(xù)光照或16小時光照/8小時黑暗、70%相對濕度和23。C恒溫下生長。為了檢測葡萄糖苷酸酶(GUS)活性，輕^f斂振動下將新鮮的組織切片在底物溶液中于37°C孵育16至18小時，該底物溶液由1mM5-溴-4-氯-3-33口引咮-)8-D-葡糖苷酸，環(huán)己基銨鹽(BioVectra,PEI,Canada),50mM磷酸鈉緩沖液，pH=7.2,0.1%TritonX-100,1mMK3[Fe(CN)6H。1mMK4[Fe(CN)6]組成。然后在固定液(5%甲醛、5%乙酸和50%乙醇)中固定切片10分鐘，在50%和100%乙醇中洗滌幾分鐘，并通過在含有0.24MHC1的20%曱醇中57。C孵育15分鐘以及隨后在含有7%NaOH的60%EtOH中室溫下孵育15分鐘來^f吏其清楚。然后在分級的乙醇系列(40%、20%和10%EtOH)、水中讓切片復(fù)水(rehydrate),并在50%甘油中封片。采用Axioplan2顯樣M竟才企查切片，以AxioVision相機(二者都來自Zeiss)記錄圖像。RT-PCT根據(jù)制造商規(guī)程(Biorad)，對轉(zhuǎn)基因雜種白楊種系的mRNA表達進行定量。實時RT-PCR在MyiQPCR儀器(Bio-Rad)上運行，采用SYBRGreenSupermix試劑盒(Bio-Rad)。用于WT和RNAi種系中尸W/漢轉(zhuǎn)錄本水平的RT-PCR分析的引物序列為5，-CC4rC4CCr04CC7TC4C7TC-3，和5'-rGrrCG04r7U7TG7TG0404C-3，。結(jié)果三個楊木基因編碼SHR樣蛋白基于序列和功能，包括SHR的GRAS蛋白家族可以分為數(shù)個不同的亞組((BolleC,,Planta.2004Mar;218(5):683畫92))。對與充分表4i的AtSHR蛋白最密切相關(guān)的楊木和擬南芥同源物(欽押山V多PtSHRl(eugene3.01860017),PtSHR2A(eugene3.00070144),PtSHR2B(eugene3.00640143)，PtSCL35b(eugene3.00050544),PtSCL53b(eugene3.00640007),PtSCL62(fgenesh4_pm.C—LG—III000210),PtSCL69b(eugene3.00070272),PtSCL92b(eugene3.00030248)，PtSCL97b(eugene3.00011016);AtSHR(At4g37650)，AtSCL29(At3gl3840)，AtSCL32(At3g49950)(圖l)的系統(tǒng)發(fā)生分析表明，在楊木中有三個SHR樣基因，并且這三個中，PtSHRl是與AtSHR最密切相關(guān)的。整個楊木基因組是公眾可以從JointGenomeInstitute(聯(lián)合基因組研究,斤)網(wǎng)3占(當(dāng)前^立于http:〃genome.jgi-psf.org/Poptr1—1/Poptrl—1.home.html)在線獲得的，并在Tuscanetal.(2006)5We"ce313(5793)，1596中有說明。多重序列比對表明，楊木核苷酸(圖2)和氨基酸序列(圖3)與對應(yīng)的AtSHR序列之間有強序列相似性。/^//i7與J"/漢有67%的核苷酸相似性，所預(yù)測的540個氨基酸的PtSHRl序列與擬南芥序列有73.52%的相似性。蛋白之間的最明顯差異為約110個N末端氨基酸殘基，其存在于PtSHRl和AtSHR中，而不存在于PtSHR2A和PtSHR2B(圖3)中。PtSHR2A和PtSHR2B的預(yù)測的411個氨基酸的序列，在序列長度上有93%的氨基酸一致性，并且分別與AtSHR有71.14。/。和68.78。/Q的氨基酸相似性。所有三個楊木SHR樣序列都在區(qū)別性的GRAS家族特異VHIID基序及其必要的附近的富亮氨酸區(qū)域上含有變異(圖3)。它們也都含有保守的GRASC末端SAW基序，但是只有PtSHR2A和PtSHR2B在存在于許多GRAS蛋白家族成員中的RVE驢序上含有變異。所有三個基因的基因組序列是相似的，不存在內(nèi)含子編碼序列。尸Wifi/的部分抑制導(dǎo)致加速生長的功能。與我們的預(yù)期相反，在生成的24個獨立轉(zhuǎn)化種系中，沒有一個顯示降低的生長，但是許多顯示出初生(高度)(圖4，表1)和次生(干周)(圖5和圖6)生長兩者的顯著增加。綜合效果是在溫室中生長52天后，總地上生物質(zhì)積累實質(zhì)地增加(圖7)。在顯示生長增加的種系中發(fā)現(xiàn)具有P/SZ/i^轉(zhuǎn)錄本的部分抑制。代表獨立轉(zhuǎn)化事件的三個種系，系2A、系2B和系4A,具有在\￥丁樹中發(fā)現(xiàn)的尸"http://77轉(zhuǎn)錄本水平的50-80%。在以統(tǒng)一的三葉楊木插條(圖4小圖)開始的樹中測量生長。組織培養(yǎng)4周后，將樹移種土壤并搬至溫室。從第一次測量(移種16天后，DAT)，轉(zhuǎn)基因系比對照T89植抹顯著地高(表l)。至52DAT，RNAi系2B植株比WTT89植抹平均高270/0,盡管轉(zhuǎn)基因植物的平均節(jié)間長度顯著地小于WT植株(圖8)。增加的高度由轉(zhuǎn)基因系中加速的節(jié)(葉)產(chǎn)生而導(dǎo)致(圖9)。千周的增加來自樹干的多個組分寬度的成比例增加(圖6)。在轉(zhuǎn)基因和WT植抹之間不存在管胞長度和寬度的持續(xù)性顯著差異(圖10)，說明增加的生長主要是細(xì)胞數(shù)量增加的結(jié)果。在轉(zhuǎn)基因系和WT樹之間也不存在葉片形狀或平均完全伸展葉片表面積和鮮重的顯著差異(圖IIA和圖IIB)。楊木插條通過產(chǎn)生不定根而建成。我們未能觀察到RNAi和WTT89植林之間根建成或早期根生長的任何差異。采用RT-PCR，對轉(zhuǎn)基因雜種白楊種系(歐洲山楊x美洲山楊，克隆T89)中的mRNA表達定量。在圖16和表6中看到的穩(wěn)態(tài)尸W///^轉(zhuǎn)錄本水平的WT水平的部分抑制20-80。/。，導(dǎo)致相對于野生型(WT)T89樹的初生和次生生長兩者的明顯加速(圖4、圖5和圖6)。擬南芥Wr突變體芽具有改變的次生維管發(fā)育與楊木基因敲減系(knockdownline)的表型完全相反，擬南芥基因敲除系(knockoutline)的芽明顯矮小。盡管如此，我們還是研究了Wr胚軸和花莖以揭示不同或相似之處，這將有助于闡明楊木表型。突變體中次生生長明顯降低。經(jīng)有花植物的胚軸的橫切面揭示，Wr胚軸與WT相比變細(xì)。突變體胚軸內(nèi)維管束小且無規(guī)則，缺乏典型的WT導(dǎo)管徑向排列。有花WT植物的胚軸具有大量的借助維管形成層活性產(chǎn)生的次生木質(zhì)部以及借助木栓形成層活性產(chǎn)生的厚周皮。相反，有花s/ir植物的胚軸顯示了非常小的維管形成層活性，產(chǎn)生3-9層的次生木質(zhì)部。也沒有明顯的木栓形成層。爿"http://7和尸股^7的類似表達模式為它們在功能上相當(dāng)提供進一步的證據(jù)來自BASE楊木微陣列數(shù)據(jù)庫的表達數(shù)據(jù)顯示，/^/狄/轉(zhuǎn)錄本存在于多種器官中(圖12)。我們采用天然啟動子報告基因構(gòu)建體和免疫組織定位來更精確地確定/^S/漢7和爿W/漢的表達模式。尸W/漢7啟動子驅(qū)動的GFP表達類似于公開的v4"/Zi根部表達譜(Nakajimaetal.,Nature.2001Sep20;413(6853):307-11)。在才艮內(nèi)，尸WZ/i^編碼序列上游的2.5kbp序列驅(qū)動GFP在中柱中并在側(cè)根的起始和早期發(fā)育期間表達。在芽內(nèi)，在葉、枝和主干的維管中觀察到GFP。在活躍生長的兩月齡楊木樹干中的完全伸展節(jié)間的橫切面和徑向縱切面中，觀察到GFP遍及形成層帶(CZ)。CZ為細(xì)胞分裂帶，在這里干細(xì)胞和傳遞擴增(母)細(xì)胞(transitamplifying(mother)cell)發(fā)生分裂，形成用于持續(xù)的木質(zhì)部(木材)和韌皮部形成以及隨后的干周增加的新細(xì)胞。也在韌皮薄壁組織和射線薄壁組織以及原始細(xì)胞中觀察到GFP。觀察到GFP在從形成層至韌皮部的射線縱列(rayfiles)中，并深入正成熟的木質(zhì)部(邊材)。以單克隆抗PtSHRl抗血清進行的免疫熒光標(biāo)記也表明在這些細(xì)胞中存在PtSHRl表位。免疫熒光標(biāo)記被竟?fàn)幬颬tSHRl多肽完全抑制。在芽頂端，在頂端半球內(nèi)原套下方緊鄰的原體內(nèi)的一組細(xì)月包中觀察到GFP。在前形成層組織內(nèi)和葉原基內(nèi)也有強的GFP表達。對經(jīng)芽頂端的徑向縱切面的免疫熒光標(biāo)記證實了PtSHRl表位遍及頂端半球和兩側(cè)組織，從而表明該蛋白在芽頂端內(nèi)至少部分地是非細(xì)胞自主地起作用。緊鄰頂端下方的橫切面顯示，GFP表達限于束內(nèi)前形成層，但是至第4節(jié)間時，該表達擴展到束間前形成層，且可在任何有維管系統(tǒng)發(fā)育的地方觀察到，例如在莖的葉跡內(nèi)。在擬南芥中，天然啟動子驅(qū)動的GUS活性表明，類似于楊木中的尸^////，v^S/^的表達遍及根和芽的維管系統(tǒng)。在新出現(xiàn)的苗的維管系統(tǒng)內(nèi)和在完全發(fā)育的子葉和蓮座葉內(nèi)觀察到GUS活性。也在花的各個部分的維管系統(tǒng)內(nèi)觀察到。當(dāng)在開花莖(inflorescencestem)中存在束間形成層活性時，在束內(nèi)和束間形成層帶內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有GUS。在表現(xiàn)次生生長的胚軸內(nèi)，活性與形成層帶和該帶的韌皮部側(cè)相關(guān)，類似于GFP在promPtSHRl:GFP系中的表達。此外，一些GUS標(biāo)記散布在莖和胚軸兩者的次生木質(zhì)部內(nèi)，在這里其與旁管薄壁組織相關(guān)聯(lián)。/^//i7互補Ar突變體表型為了測試楊木PtSHR樣蛋白是否能夠至少在擬南芥內(nèi)發(fā)揮類似于AtSHR的功能，我們在W"(ColO)功能缺失突變體內(nèi)個別地表達PtSHRl、PtSHR2A和PtSHR2B的編碼序列，其由天然AtSHR啟動子的2.5kbp5，上游序列驅(qū)動。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗證顯示，在各個被互補種系中，有該構(gòu)建體表達。用于PtSHR2A和PtSHR2b的引物對擴增到兩PtSHR2互補種系內(nèi)的序列，因為這兩基因有幾乎相同的核苷酸序列。所有三個PW/漢基因都能夠部分地互補Wd突變體表型。矮小的根和芽生長表型被完全互補，37但是被互補種系的花莖仍保持向地性(agravitropic)。有趣的是，以類似的AtSHR啟動子序列驅(qū)動的AtSHR:GFP融合蛋白互補Wr突變體，也未能互補向地性芽表型。另外，WT(ColO)擬南芥植抹內(nèi)異位CaMV35S啟動子驅(qū)動的AtSHR表達導(dǎo)致花芽向重力性的喪失。合起來，這些結(jié)果表明，AtSHR表達的精確空間/時間控制對于這方面的AtSHR功能是必要的。對擬南芥內(nèi)ASi/i的部分抑制導(dǎo)致類似于在楊木/^S7^7iA^'系中觀察到的表型。Wr突變體的功能缺失表型和楊木種系的基因敲減表型之間的差異的另一種可能性為，在蛋白減少和全部缺失之間可能存在根本差異。由于所有的Wr突變體等位基因都是無效的，我們在擬南芥中使用了類似于楊木轉(zhuǎn)基因中使用的RNAi策略，以便獲得保留了」&//7殘余表達的種系。我們生成了26個單獨的1^八1」"http:///抑制系。選擇了3個種系，系這些種系都在營養(yǎng)發(fā)育(vegetativedevelopment)的幾個方面顯示出實質(zhì)加速。在4。C層積處理(stratification)3天后，在含有l(wèi)xMS和l。/。蔗糖的瓊脂平皿上，在光照和23。C下，WT(ColO)種子群體需要18至27小時來完全萌發(fā)(根出現(xiàn))(圖13A)。來自三個RNAi抑制種系的種子樣品在WT種子之前幾小時開始萌發(fā)，并且完全萌發(fā)比WT群體達到相同萌發(fā)水平早3小時(圖13A和13B)。在將種子置于23。C40小時后，與WT苗相比，大部分的轉(zhuǎn)基因苗完全脫離種皮并快速延伸(圖13C)。5.5天時，在光照下生長的RNAi苗的子葉(圖13D和13F)和根(圖13H)在實質(zhì)上比在相同平皿上生長的WT的要大。相反，在5.5天時，在0。/。蔗糖平皿上生長的WT和RNAi系的黃化苗的胚軸長度和子葉大小之間沒有顯著差異(圖13E和13G)。Boyesetal.(Boyesetal.,ThePlantCell,Vol.13，1499-1510,2001)發(fā)表了用于擬南齊植抹生長階段的模型。在轉(zhuǎn)基因系中，至播種15天后，達到生長階段1.06(6蓮座葉〉1mm長)(圖14A)。WT苗直至第18天才達到這個階段(圖14B)。到第18天時，WT和轉(zhuǎn)基因種系中未成熟葉片1和2完全伸展。在這個階段，WT和RNAi葉面積沒有顯著差異(圖14C)。相反，RNAi系中(圖14E并比4交圖14B和14D),每一才直4朱所有出現(xiàn)的葉片的總面積顯著大于WT系。這是由于RNAi系中展開葉的更大尺寸和出現(xiàn)了更多葉。換言之，RNAi植抹比WT在發(fā)育上更超前。18天時，徑向縱切面表明，系ll植抹的頂端半球基本上比WT的更大(圖MF)。楊木的高度生長速率圖4和表1顯示了楊木RNAi和T89WT植株的高度比較的實例。從表1可看出，在生長的早期高度生長優(yōu)勢最明顯。因為生長期在不同的植抹中有不同的時間安排并且有一些噪聲加入，所以上述方法可用于計算這些條件下不同個體樹的最大生長速度?？稍诒?和表5中看到這些結(jié)果(對每一獨立轉(zhuǎn)化事件采用了較少的生物學(xué)重復(fù))。直徑生長速率在以上定義的生長條件下，莖寬度顯示出隨時間相對線性的增加。對直徑數(shù)據(jù)的線性回歸被用于評估直徑生長。其中d。為起始寬度，c為直徑生長的速率(斜率)。在WTT89和轉(zhuǎn)基因RNAi植抹之間，比較了這些高度和寬度生長測量值。對于這些結(jié)果，WTT89植林統(tǒng)稱為野生型群體，轉(zhuǎn)基因樹統(tǒng)稱為構(gòu)建組。表4顯示了KR462(PtSHRlRNAi)構(gòu)建組和對應(yīng)的野生型組的生長數(shù)據(jù)。表才各行含有KR462(PtSHRlRNAi)組和對照野生型組的個體的高度和直徑測量值。這些數(shù)據(jù)總結(jié)在表5中。發(fā)現(xiàn)KR462(PtSHRlRNAi)構(gòu)建體使高度生長速率增加了約12%，使直徑生長速率增加了約18%。5//i的部分抑制在確定和未確定物種中加速形態(tài)發(fā)生。在擬南芥中，AtSHR蛋白的完全缺失導(dǎo)致根分生組織的崩潰、芽矮小和次生生長的P爭低。相反，我們在楊木和擬南芥中分別觀察到尸W/漢7和^^/化部分抑制的效果，其導(dǎo)致芽的生長速率的加速。該增加的生長速率似乎是由于VC和芽頂端分生組織(SAM)內(nèi)有絲分裂的速率增加。很多植株進化出通過節(jié)間細(xì)胞的增加的延伸來增加高度，從而避免被鄰近植物遮擋的機制。在楊木轉(zhuǎn)基因系中，節(jié)間比WTT89系短，并且WTT89植抹與轉(zhuǎn)基因植株之間沒有顯著的導(dǎo)管元件長度差異。高度增加，而沒有相應(yīng)的節(jié)間或細(xì)胞長度的增加表明，類似于干周的增加，力口速的高度生長為額外的細(xì)胞分裂的結(jié)果。較高植林、較短節(jié)間和細(xì)胞長度不減小的組合表明，轉(zhuǎn)基因系中間隔期(在SAM中產(chǎn)生新器官的時間安排)減小。已經(jīng)鑒定了多個間隔期受影響的突變體。例如，玉米^wn'朋/ear/,(Veltetal"1998.Nature393,166-168)和擬南芥"http://^^/wen^few;ragraw/,謂//(Chaudhuryetal.，1993.PlantJournal4,907-916;Helliwelletal.,2001.PlantCell13,2115-2125)。除了改變的間隔期，這兩種突變體還具有改變的葉序(將莖上兩連續(xù)葉分開的圓周部分)。楊木W(wǎng)TT89與RNAi轉(zhuǎn)基因植株之間以及擬南芥WT和RNAi系之間都沒有葉序差異。最近在水稻中鑒定了一種突變體，其具有減小的間隔期(Miyoshietal.,PNASVol.101No.32004，875-880)。尸7」^TOO^OA^基因編碼在葉原基中表達的細(xì)胞色素P450。類似于PW/^7和JC/7iRNAi系，p/MtocAra"/突變體在產(chǎn)生新葉的時間安排方面受影響，但是不在新葉起始的空間安排(葉序)方面受影響(Miyoshietal.,PNASVol.101No.32004，875-880)。幾個方面的證據(jù)進一步表明了尸"/W/和^S/漢之間的保守功能假定PtSHRl和AtSHR的誤調(diào)節(jié)(mis-regulation)都影響VC活性，我們就考慮在這兩物種中可能有轉(zhuǎn)錄本積累的保守模式。BASE全球轉(zhuǎn)錄本《鼓陣列數(shù)據(jù)表明，P^S/Zi^在遍及根和芽的多種器官中表達(圖12)。天然尸W/漢/啟動子驅(qū)動的GFP表達也表明該基因在整個芽表達，并且這種表達主要與維管發(fā)育相關(guān)。在芽頂端，在頂端半球內(nèi)原套下方緊接的原體內(nèi)的細(xì)胞組中觀察到GFP。SAM的中央帶兩側(cè)的帶中缺乏GFP信號且存在免疫熒光標(biāo)記的組合提示，PtSHRl具有在細(xì)胞間遷移的能力。在擬南芥中，AtSHR的細(xì)胞間遷移對于蛋白功能和正常的根發(fā)育是關(guān)鍵的(Nakajimaetal.Nature.2001Sep20;413(6853):307-ll;Benfeyetal.，Benfeyetal.,Development.1993Sep;119(1):57-70)。芽尖生長最終源于SAM中央干細(xì)胞群(FletcherJC,,2002AnnualReviewofPlantBiology,53,45-66)。PtSHRl表位可存在于不表達該基因的細(xì)胞中所借助的另一機制為，該基因可在干細(xì)胞中表達，然后當(dāng)它們在細(xì)胞分裂和頂端發(fā)育期間從頂端移出時可將其保留在這些細(xì)胞中以及子細(xì)胞中。擬南芥40pmmAtSHR:GUS種系內(nèi)GUS染色表明，ASZ/i在遍及擬南芥植沖朱的類似帶中表達，為該兩蛋白發(fā)揮相同功能提供了進一步的證據(jù)。支持這種假說的其它證據(jù)為，當(dāng)由天然AtSHR啟動子的2.5kbp5'上游序列(以及由組成型CaMV35S啟動子)驅(qū)動時，所有三種楊木PtSHR樣蛋白都能夠個體地互補W"功能缺失突變體表型。擬南芥中A57/W的部分抑制導(dǎo)致類似于在楊木/^S/W//A^'系中觀察到的表型。AtSHR基因敲減系的表型提供了進一步的有力證據(jù)來支持PtSHRl和AtSHR具有類似功能的假說。/^//i^iA^'系中營養(yǎng)發(fā)育被加速。擬南芥中，至萌發(fā)時，AtSHRRNAi系比WT苗在發(fā)育上超前約3小時。Boyesetal.(Boyesetal.，ThePlantCell,Vol.13，1499-1510，2001)發(fā)表了對擬南芥的分析，其定義了一系列用于分析轉(zhuǎn)基因和突變體種系的生長階^:。至播種轉(zhuǎn)基因系后的15天，達到它們的生長階段1.06(系ll)(圖14)。WT苗中直至第18天才達到這個階段。與顯示葉片l和2的最終完全伸展尺寸無差異的數(shù)據(jù)結(jié)合，這表明，與PtSHRlRNAi系類似，抑制AtSHR表達的影響為增加新器官起始的速率，而不是這些器官的最終大小。該數(shù)據(jù)強烈提示，AtSHR蛋白的降低表達和完全缺失有根本差異。Wr突變體芽具有改變的形態(tài)發(fā)生，但是間隔期保持不變。我們數(shù)據(jù)的總和為AtSHR和PtSHRl在功能上等同提供了強力證據(jù)。在楊木和擬南芥轉(zhuǎn)基因系中，SHR轉(zhuǎn)錄本水平的降低引起增加的生長速率。這表明所述蛋白起細(xì)胞分裂和生長的負(fù)調(diào)節(jié)物的作用。在Wr突變體中，當(dāng)該蛋白完全缺失時，根頂端分生組織崩潰，芽矮小且次生維管發(fā)育顯著減弱。顯然，一定水平的AtSHR對于根和芽內(nèi)正常的細(xì)胞分裂都是必要的。但h/^突變體中營養(yǎng)發(fā)育的速率以及從營養(yǎng)發(fā)育到成花轉(zhuǎn)變的時間安排沒有延遲。在開花期，平均起來，它們具有與WT植抹相同的葉片數(shù)量。這說明，盡管SHR調(diào)節(jié)芽內(nèi)的細(xì)胞分裂和營養(yǎng)發(fā)育，但是擬南芥和楊木RNAi系內(nèi)降低的間隔期為抑制SH錄因表達的次級效應(yīng)。主要效應(yīng)為刺激SAM內(nèi)的細(xì)胞分裂。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表1用于PtSHRlRNAi系2A、2B和4A與對照T89樹的溫室生長比較的樹高度均值(n=9)(SDs在圓括號內(nèi))星號表明每一種系與野生型T89之間均值差異的顯著性值(以Dunett事后檢驗來檢驗，以將所有樣品與對照比較)^〈0.05,**;<0.01，0.001<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>序列PtSHRleugene3.01860017(SEQIDN0:1)TTAPtSHRleugene3.01860017(SEQIDNO:2)PtSHR2Aeugene3.00070144(SEQIDNO:3)TGTCTTCTGTACTCCAACTTTTCTTTTCTTATGCTPtSHR2Aeugene3.00070144(SEQ工DNO:4)WDDVKALiljKRYRAGWALjVLiPQGDHDSGIYIiTWKEEPVVWASAWKPPtSHR2Beugene3.00640143(SEQIDNO:5)TTCATGCATATTTGTATCTTATGCACTCCAACTTTTCTTTTCTTATGTTATATPtSHR2Beugene3.00640143(SEQ工DNO:6)WDDVKALLKRYKAGWALVLPQGDHESGIYLTWKEEPWWASAWKPAtSHRAt4g37650(SEQATGGATACTCACAAATCAATTATCACTACAGAAGAAGACCACTTACTACTTCCTCCACCGGACCCTTCCGAAGTGGGCAGCGTGCGCAACCAAAAACTGGCGATGCTACCACGCGAAAAAGCGGCAAACGATAAGCTCCAGACGACACGCCAAACGGCGTCTTATGGGAGGATCTCAACGATGCATGGGATTAAGACCGAGGTGGCTTTGTGCTTCGAGTCGTGCAGCGGAGGCGAGAGAGGGTATAGTGGTTTGGTCGACCGGTGGTTTTCTTTAGACTCTTCGTTAAGACTTTCCACATTTCCTCTTCCTCCTTTCACCCGCAGCCGCCGTTCTCCATACTCGGTCCTAAATCCTATGCTTCTTACTTGAACCATGGTCTGTACTAAAGAGCAATCTTCGTTTTGCACCTCACCTAAGCGCATCGGATTTCCTTTCAAAACTCGACGTTCGCTTCACGGGATTGTGACATGATGAGTTCATGGGAAGAGACGTGCGATCAGCGAGGAAATGAGGTGGCTGGTACAGTGGGGCTAGTGCIDNO:7)AGTCAGTCTCCAGAACTTCCAAACGACGTCTTCTTCTCACTACTCCCACCAGCTTTAGCCACCTCAAACTTCTTGAAGCGGACGCTCAACCCTCCAAGCTAACAGCTGCAGTTCCAAGAAGGAAGCAGTATCAATGGCCGGCTAACCACAGATGAAAGAGATTTAACATTTAAACCAGACTGGAAGCCCTGGTCGTAGAACTTGAGAGGGGAGTTTTCCACGTTGATCTTGTGGTCGAGGGGATGATGTCTCCTGATGCCGTGGCGGCCACAACAACAACACCACCACTAGTCGAAGAATCACAACCATCCAATACCATCTCGCCTTACTCCTCCGTCCTGCACGTGCCTGAGCTCTCTTCTCTTCAACCGCCACAGAGAGTTAGCCCCTGACGGAGAGGACTCTTCTAGGTTGTCGTGGATCGGAAACCATTCATCACGGAAGTCTTGGAGAGACGCTGGAAGAAGCTGTTTGGAGAATAGGACGAGCAGTGGCTTGTGAGGATGAGGAAGAGCTTTGTGCCGGAATATACGTAAAACAATCCGACTGGCTCTCCGCTTCAACTTACAACCACAACCGCCACATCCCTCCTCCGGTCGACTTCTCTCTCCGACAACTCCGTACGGGCATGACCGGAGACTTGCTCGGGCCACGTTCAAAGATCCAAAGCTTTAGCCCAACAAGTTGAATGGAGAATTGGAGATTTCCATTAACTGTGATATCGAGATCTTGTCGGGTTTACGATGACGAGAGGTTAGCCGTCGGAATAGTGGGTTTGAGGAGATATCCTTTGTTGTAGTATCATTACAAACTGCTTTTCATGGATCAATCCTAATATCAACCCCTCCACCATAATAGCCAATGCCAGACACTGCAAGACACCGAGTTCAGGCGAACTTCGAGTCATGGACACGTGCATCGTTGACCACAAGATCATGTCAACGATATTCGCTAGGATCTGAGTTTCGTAGGCGCGTTTCCGACGGAGAAGAAGAAGTTTAGGGTTGATGCTAGAGTTCCACGGAGTGGAGCGGTGTAAAGAAGGTGAGAGATCAGAtSHRAt4g37650(SEQIDNO:8)IFLjCWRD^PWWASAWRPT水稻SHR核苷酸序列(SEQIDNO:9)CTACTAATAGTTTATTTGTTTTACCGGTT水稻SHRAAS07303.1GI:41469537(SEQ工DNO:10)MDTLiFRIjVSLjHHHHHHGHAASPSPPDGPHKSYPSSRGSTSSPSSHHTH皿TYYHHSHSHYNNNSNTNYYY(QGGGGGGGGYYYAEEQQPAAYLEECGNGHQFYMDEDFSSSSSSRQFHSGTGAPSSAPVPPPPSATTSSAGGHGLFEAADFSFPQVDISLDFGGSPAVPSSSGAGAGAGAAPSSSGRWAAQLLMECARAVAGRDSQRVQQL麗M!LNELjASPYGDVDQKLASYFLQGIjFARLiTTSGPRTLiRTIjATASDRNASFDSTRRTAIjKFQELSPWTPFGHVAANGAILiESFLEAAAAGAAASSSSSSSSSTPPTRIjH工LDLSNTFCTQWPT!LLjEAIjATRSSDDTPHLiS工TTWPTAAPSAAAQRVMRE工GQRLEKFARLMGVPFSFRAVHHSGDLADLDLAALDLREGGATAALAVNCVWALRGVARGRDAFVASLRRLjEPRWTWEEEADLAAPEADASSEADTDAAFVKVFGEGIiRFFSAYMDSLEESFPKTSNER!LSIiERAVGRA工VDLiVSCPASQSAERRETAASWARRMRSAGFSPAAFSEDVADDVRSLLjRRYKEGWSMRDAGGATDDAAGAAAAGAFLAWKEQPWWASAWKP水稻SHR核苷酸序列(SEQIDNO:11)AAATTTTACGTGCATGGTTTTTATCATGCGTACCCGCAA水稻SHRBAD30442.1G工MEKASKAKAEAAKGAHTHCRSGSRSSS恥TNASYSYYHHS恥LjYMDEDFSSSSSSRHFHH50509213(SEQIDNO:CKLIjIjPPMDTIjFRLjVSIjQAASNSGGGGGGGGGYYYGG④PGARVQQQQPPASSTPTGTAP4912)SEQQQQQQQSASYNSRSTTSPPSQYYYLiEPYQEECGNAPHTPPLSTSSTAAGAGHGLFEAADLSFPPDLNLDFSSPASSSGGGTASSGAVL畫MLNELASPYGDVEQKLASYFLQGLFARRFQELjSPWSSFGHVAANGAILjESFIjEVAAArsadetphls工ttwsaapsaptaavqrvmeljDIjDAIjD:lreggattalavncws:lrgwIjVASDPDASSATEEGGDTEAAFLKVFGEGLAIVDLVSCPASESMERRETAASWARRMRSAAGTDDSAAGAGVFLAWKEQPLVWASAWRPGGGGGGRWASQIjIiLiECARSVAARDSQRVQQLiTASGPRTLRTLAAASDRNTSFDSTRRTALASSETGRFHILDLSNTFCTQWPTLLEALATRE工GGRMEKFARLMGVPFRFRAVHHSGDLAPGRARRRDAFAASLRRLDPRWTWEEEADRFFSAYMDSLjEESFPKTSNERLjALjERGAGRGFSPVAFSEDVADDVRSLLRRYREGWSMRE大麥SHR核苷酸序列(SEQIDNO:13)GCGTGATGGGTGTAAGCACTATGATTGTTGTTACAGT大麥SHRHvGITC147542(SEQIDNO:14)MADTPTSRM工HPFSNMQRQNPKQFQFQYPDNPQHPCHPYQPSPDTHWPQHHYSLKSHSSDASYENHVAQMKHTLVDSSAAAGCMRHDSPSSHSFTPPSIRSGSGSPSSHDDSHSDSTDGSPVSASCVTVTTEDPNDLiKQKLjKDIjEAEMIjGPDAAEIVNSIjESSVAKQLjSLEPEKWAQMMDFPRGNLKELLLACARAVEEKNMYAVDVMVPELRKMVSVSGTPLERLGAYMVEGLVARLASSGHSIYKALRCKEPKSSDLLSYMHFLYEACPYFKFGYMSANGAIAEAVKGEDR工H工工DFHIAQGAQWISLLQAIjAARPGGPPTVRITGIDDSVSAYARGGGLDLVGRRLSHIAGLCKVPFEFRSVAMAGEEVEEGHLGVVPGEALAVNFTLELHHIPDETVSTANHRDRILRLVKGLRPKVLTLVEQESNTNTAPFPQRFAETLDYYTAIFESIDLTLPRDDRERVNMEQHCLAREWNLIACEGAERVERHEVFGKWKARLTMAGFRPSPLSSLVNATISKLLQSYSDNYKLAERDGAIjYLiGWKKRPIiWSSAWH大麥SHR核苷酸序列(SEQIDNO:15)TGGCGGACGTGGCGCAGAAGCTGGAGCAGCTCGAGATGGCCATGGGGATGGGCGGCCCCGCCCCCGACGACGGCTTCGCGACCCACCTCGCCACGGACACCGTCCACTACAACCCCACCGACCTCTCCTCCTGGGTCGAGAGCATGCTGTCCGAGCTCAACGCGCCGCCGCCGCCCCTCCCGCCGGCCCCGCCGCAGCTCAACGCCTCCACCTCTTCCACCGTCACGGGCGGCGGCGGATACTTCGATCTCCCGCCCTCTGTCGACTCCTCCAGCAGCACCTACGCCCTGCGCCCGATCATCTCGCCGCCCGTCGCGCCGGCCGACCTCTCCGCTGACTCCGTCCGGGACCCCAAGCGGATGCGCACTGGCGGCAGCAGCACGTCGTCTTCGTCCTCCTCGTCGTCCTCGCTCGGCGGTGGTGCCGCCAGGAGCTCTGTGGTGGAGGCTGCTCCGCCGGTGGCGGCTGCGGCTGCTGCGCCCGCGCTGCCGGTCGTCGTGGTCGACACGCAGGAGGCCGGGATTCGGCTGGTGCACGCGCTGCTGGCGTGCGCGGAGGCCGTGCAGCAGGAGAACCTCTCGGCCGCCGAGGCGCTGGTGAAGCAGATACCCTTGCTGGCAGCGTCGCAGGGCGGCGCGATGCGCAAGGTCGCCCCCTACTTCGGCGAGGCCCTCGCCCGCCGCGTCTTCCGCTTCCGCCCGCAGCCGGACAGCTCCCTCCTCGACGCCGCCTTCGCCGACCTCCTCCACGCGCACTTCTACGAGTCCTGCCCCTACCTCAAGTTCGCCCATTTCACCGCCAACCAGGCCATCCTGGAGGCGTTCGCCGGCTGCCGCCGCGTCCACGTCGTCGACTTCGGCATCAAGCAGGGGATGCAGTGGCCGGCCCTTCTCCAGGCCCTCGCACTCCGTCCCGGCGGGCCCCCTTCGTTCCGCCTCACCGGCGTTGGCCCCCCGCAGCCGGACGAGACCGACGCCCTGCAGCAGGTGGGCTGGAAGCTCGCCCAGTTCGCGCACACCATCCGCGTCGACTTCCAGTATCGCGGCCTCGTCGCCGCCACGCTCGCGGACCTGGAGCCGTTCATGCTGCAGCCGGAGGGCGAGGAGGACCCTAACGAGGAGCCCGAGGTAATCGCCGTGAACTCAGTCTTCGAGATGCACCGGCTCCTCGCGCAGCCCGGCGCCCTCGAGAAGGTCCTGGGCACGGTGCGCGCCGTGCGGCCGAGGATCGTCACCGTGGTCGAGCAGGAGGCGAACCACAACTCCGGCTCATTCCTGGACCGCTTCACCGAGTCCCTGCACTACTACTCCACCATGTTCGATTCTCTCGAGGGCGGCAGCTCCGGCGGCCCGTCCGAGGTCTCATCGGGGGGTGCCGCTCCTGCCGCCGCCGCCGGCACGGACCAGGTCATGTCCGAGGTGTACCTCGGCCGGCAGATCTGCAACGTGGTGGCCTGCGAGGGCACGGAGCGCACAGAGCGGCACGAGACACTGGGGCAGTGGCGGAACCGGCTGGGCAACGCCGGGTTCGAGACCGTGCACCTGGGCTCCAATGCCTACAAGCAGGCGAGCACGCTGCTGGCCCTCTTCGCCGGCGGCGACGGGTACAAGGTGGAAGAGAAGGAAGGGTGCCTGACTCTCGGGTGGCACACGCGCCCGCTGATCGCCACTTCCGCATGGCGCCTCGCCGCGCCGTGATCGCGAGTTTTGAACGCTGTAAGTAGACATCGTGAGAGCATGGAGCGCTACGACACAACCCCGGCCGCCCGCCCGCCCCGGCTCTCCGGCGCACGCACACGCACTTGAAGAAGAAGAAGATGAAGAAGAAGCTAAATGTCAGTGATACGCTGAATTGCAGCGACCGGCTAGGATCGATCGGGTTACCACTCTACGGTTTGGTTCTGCGTCCGGCGTGAAGACATGGACACGACCAACTCCGACCAGACCGCCGGCATGTAATGTAATCCCTCCTTCGTTCCCAGTTCACCATCACCCGTAAAACTCCTTATTAAGCCCTATTACTATTATTATTATGTTTAAATGTCTATTACTATTGCTATGTGTAATTCCTCCAATCGCTCATATTGAAATAAGCACGGGCCGGACTTTTGNTAGCAAGCTGCTTCATTTGAGAATTTTTGTACCGCAAGGGCACATCT大麥shraal66734.1gi:18254373(匿rey⑨gggsggggdemgssrdkmmvsssLE(QLjEMAMGMGGPAPDDGFATHIiATDTVHYnastsstvtggggyfdlppsvdsssstyalTSSSSSSSSSIiGGGAARSSVVEAAPPVAAAvqqenlsaaealvkq工pllaasqggamrkvllhahfyescpylkfahftanqaileafagppsfrltgvgppqpdetdalqqvgwklaqfeedpneepev工awsvfemhrllaqpgalerfteslhyystmfdsleggssggpsevssggterterhetlgqwrnrlgnagfetvhlgsGWHTRPLj工ATSAWRIjAAP3eqidno:16)eagegeevdellaalgykvrasdmadvaqkNPTDLSSWVESMLSELNAPPPPLPPAPP(QIjRPIISPPVAPADIiSADSVRDPKRMRTGGSSaaapalpwvvdtqeag工rlvhallacaeaapyfgealarrvfrfrpqpdsslldaafadcrrvhwdfgikqgmqwpallqalalrpggAHTIRVDFQYRGLVAATXADIjEPFMLjQPEGkv;lgtvravrprivtweqeanhnsgsfldgaapaaaagtdqvmsevylgrq工cnwacenaykgastllalfaggdgykveekegcltlPtSHRl的殘基1-120(SEQIDNO:17)NQQQQHQHQTTTTTPTTTTTNTSTPSTHHVLiDSADFSFSPSHDIiNFESEQ工DNO:18VMKE工G(N/Q)RMEKFARLMGVPF(K/E)(F/L)(N/K)V工SEQ工DN〇19LNEL(G/A〉SPYGD(T/C)(E/D)QKLAS(Y/H)FLQALFSEQ工DN〇20LKFQEVSPW(T/A)TFGHVSEG工DNO:21CTQWPTLLEALATRAtSHR啟動子(SEQIDNO:22)agcgtggggtttcttctaataattgtagaagaaactgatcatgagaacatttgatctaccagagatggtgatgtaattagtttggaattttagcatgatatagcatatatctaaatatgtccgaaactttcctacatactagaaaaacgaaattaaacaatgggcatgagctcggggggatagacaagattaatgctttgtatcgagacaaacgagaaarctcaggtg二ctgagataataattacagcttttctcatgtctctatgttactatgtaaatggtgaccacttaagtatttatatatcatgtatatatcttataggtatcatacaaaatggtcatgaaacttttgcaatttcaatctacttgttcattgtagatgctagcttttcacatgtttttttcatgcaccagtgttgatagtaacgtagtcgcggaatgtctaaaacgattatgagtttggtgttttgattggttagaattggtattagtaggacattctaacttttttgttagtctgttgatttaggatgcgtaaagagtctttatataaacaaacatcgtaattatatacggatttttttcggaattttacgccatatctgtaagtatatataacatgcatgtcgttttcaaattcatatgatgaacgatccacgtaagtgctactactcctacaatattgcatgagagagatatgtatttataaattttattttgaagaagaaataagagggaaggttacttgggtggatcgatgtgaaaaagaaaattatataagatattgttgatattttgtaactagaaaatatatttgctctgtaatttttcgtaagttccaaaagataaacatgggacaacaattcgatgcaaaaaatcctcttttcatgctctttttttattctctagtcjctgatgcaatatacacaacaaagtattaaatcttagataPtSHR啟動子(SEQ工DNO:23)CAAGCCATCCCCAACAAACTCCATCCGAA權(quán)利要求1.增加植物生長和/或生物質(zhì)的方法，包括相對于對照植物，改變所述植物細(xì)胞內(nèi)SHORT-ROOT(SHR)多肽的表達。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述SHORT-ROOT(SHR)多肽包含與SEQIDNOS:2、4、6、8、10、12、14或16中的4壬一種有至少70%序列相似性的氨基酸序列。3.如^l利要求2所述的方法，其中所述SHORT-ROOT(SHR)多肽包含與SEQIDNO:17、SEQIDNO:18和SEQIDNO:19中的一種或多種有至少90%序列相似性的氨基酸序列。4.如權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的方法，其中所述SHORT-ROOT(SHR)多肽包含SEQIDNOS:2、4、6、8、10、12、14或16中的任一種的氨基酸序列。5.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中使所述植物的地上部分的生長和/或生物質(zhì)增加。6.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述SHORT-ROOT(SHR)多肽的表達在所述植物的細(xì)胞內(nèi)被降低但不是被消除。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中通過在所述植物的細(xì)胞內(nèi)表達編碼抑制物RNA分子的異源核酸而降低表達。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抑制物RNA分子包含編碼SEQIDNOS:2、4、6、8、10、12、14或16中的任一種的核酸序列的正義或反義鏈的10至40個核苷酸。9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中通過包括以下步驟的方法降低表達使第一植物和第二植物雜交，以產(chǎn)生子代植物群體；確定所述SHORT-ROOT(SHR)多肽在所述群體內(nèi)子代植物中的表達，以及鑒定所述群體內(nèi)的子代植物，在所述子代植物中，所述SHORT-ROOT(SHR)多肽的表達相對于對照降低。10.如^5L利要求6所述的方法，其中通過包括以下步驟的方法降低表達將植物群體暴露于誘變劑，確定所述SHORT-ROOT(SHR)多肽在所述群體內(nèi)一種或多種植物中的表達，以及鑒定具有降低的所述SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的植物。11.如權(quán)利要求5所述的方法，其中使所述SHORT-ROOT(SHR)多肽的表達在所述植物的細(xì)胞內(nèi)增加。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中通過在所述植物的細(xì)胞內(nèi)表達編碼所述SHORT-ROOT(SHR)多肽的異源核酸來增加表達。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述異源核酸包含與SEQIDNOS:1、3、5、7、9、11、13或15中的任一種有至少60%序列一致性的核苷酸序列。14.如權(quán)利要求7、8、12或13中任一項所述的方法，其中所述異源核酸可操作地連接至啟動子。15.如權(quán)利要求7、8或11至14中任一項所述的方法，其中所述核酸包含在載體中。16.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，包括有性或無性繁殖或栽培具有改變的SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的植物的子代或后代。17.產(chǎn)生具有增加的生長或生物質(zhì)的植物的方法，包括通過轉(zhuǎn)化將改變SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的異源核酸并入植物細(xì)胞，以及；從一個或多個所轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生所述植物。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述SHORT-ROOT(SHR)多肽包含與SEQIDNOS:2、4、6、8、10、12、14或16中的任一種有至少70%序列相似性的氨基酸序列。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述SHORT-ROOT(SHR)多肽包含與SEQIDNOS:17至21中的任一種有至少90%序列相似性的氨基酸序列基序。20.如權(quán)利要求18或權(quán)利要求19所述的方法，其中所述SHORT-ROOT(SHR)多肽包含SEQIDNOS:2、4、6、8、10、12、14或16中的任一種的氨基酸序列。21.如權(quán)利要求18至20中任一項所述的方法，其中所述植物的地上生長部分相對于對照表現(xiàn)出增加的生長和/或生物質(zhì)。22.如權(quán)利要求17至21中任一項所述的方法，其中所述異源核酸編碼降〗氐所述SHORT-ROOT(SHR)多肽表達的抑制物RNA分子。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述抑制物RNA分子包含編碼SEQIDNOS:2、4、6、8、10、12、14或16中的任一種的核酸序列的正義或反義鏈的10至40個核苷酸。24.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述異源核酸編碼SHORT-ROOT(SHR)多肽。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述異源核酸包含與SEQIDNOS:1、3、5、7、9、11、13或15中的任一種有至少60%序列一致性的核苦酸序列。26.如權(quán)利要求17至25中任一項所述的方法，其中所述異源核酸可操作地連接到調(diào)節(jié)序列。27.如權(quán)利要求17至26中任一項所述的方法，其中所述異源核酸包含在載體內(nèi)。28.如權(quán)利要求17至27中任一項所述的方法，包括有性或無性繁殖或栽培從所述一個或多個細(xì)胞再生的植物的子代或后代。29.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述植物為高等植物。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述植物為農(nóng)業(yè)植物，所述農(nóng)業(yè)植物選自煙草、葫蘆、胡蘿卜、蔬菜型蕓苔、瓜類、辣椒、葡萄藤、萵苣、草莓、油籽型蕓苔、甜菜、小麥、大麥、玉米、水稻、大豆、豌豆、高粱、向日葵、番茄、土豆、胡椒、菊花、康乃馨、亞麻籽、大麻和黑麥。31.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述植物為多年生植物。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述植物為硬木、針葉或結(jié)果實植物。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述硬木植物選自刺槐、桉樹、鵝耳櫪、山毛櫸、桃花心木、胡桃、橡樹、白蠟樹、柳樹、山胡桃木、樺樹、栗樹、楊木、榿木、楓樹和西克莫樹。34.如權(quán)利要求32或權(quán)利要求33所述的方法，其中所述硬木植物為楊屬(Populus)或楊柳科(Salicaceae)組的植物。35.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述針葉樹選自柏樹、花旗松、冷杉、巨杉、鐵杉、雪松、刺柏、落葉松、松樹、紅杉、云杉和紫杉。36.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述結(jié)果實植物選自蘋果樹、李樹、梨樹、橡膠樹、橘樹、獼猴桃樹、檸檬樹、櫻桃樹、葡萄樹和無花果樹。37.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述多年生植物選自棉花、竹和橡膠植物。38.通過權(quán)利要求17至37中任一項所述的方法產(chǎn)生的植物，其相對于對照顯示出增加的生長或生物質(zhì)。39.如權(quán)利要求38所述的植物，其中所述植物的地上部分相對于對照顯示出增加的生長或生物質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及通過部分抑制SHORT-ROOT(SHR)多肽如AtSHR或PtSHR1的表達而增加植物生長和/或生物質(zhì)的方法。操縱SHORT-ROOT表達可以用于例如在轉(zhuǎn)基因植物中加速生長和增加生物質(zhì)生產(chǎn)。文檔編號C07K14/415GK101679494SQ200880020019公開日2010年3月24日申請日期2008年4月10日優(yōu)先權(quán)日2007年4月12日發(fā)明者布賴恩·瓊斯,戈蘭·桑德伯格,王潔華申請人:瑞典樹木科技公司