專利名稱：：昆蟲的生物控制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種昆蟲控制方法和為此使用的組合物。本發(fā)明特別涉及到對昆蟲侵?jǐn)_動植物的控制和對由昆蟲傳播的動植物感染的預(yù)防。本發(fā)明也可被運(yùn)用于減輕由于昆蟲侵?jǐn)_引起的感染。本發(fā)明還特別涉及到幾種用于控制昆蟲的含肽酶抑制劑的組合物，并涉及到能表達(dá)肽酶抑制劑的抗蟲轉(zhuǎn)基因生物的利用?，F(xiàn)有技術(shù)描述昆蟲會對世界范圍的很多種類的動植物造成嚴(yán)重的蟲害。據(jù)估計(jì)，雖然使用了現(xiàn)有的控制手段，每年仍有約13％的作物收成被損失掉。一些昆蟲如鱗翅目(Lepidoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、嚙蟲目(Psocoptera)、等翅目(Isoptera)、纓翅目(Thysanoptera)和同翅亞目(Homoptera)的昆蟲會使很多種園藝作物和大田作物，以及儲存的谷物和谷產(chǎn)品遭到很大損失。雙翅目(Diptera)、Anaplura、食毛目(Malophaga和蚤目(Siphonaptera)的昆蟲會造成動物和人的寄生感染。其他目(膜翅目(Hymenoptera)、網(wǎng)翅目(Dictyoptera)、等翅目(Isoptera))中包括重要的生活害蟲和工業(yè)害蟲。許多現(xiàn)有的昆蟲控制手段依賴于使用化學(xué)殺蟲劑，如加氯烴(DDT、硫丹等)、有機(jī)磷酸鹽(毒死蜱、二嗪農(nóng)、馬拉息昂、硝基硫磷酯)、有機(jī)甲氨酸酯(甲氨酰、滅多蟲、proxypur)和合成的擬除蟲菊酯(氯氰菊酯、deltamethrin)。使用化學(xué)殺蟲劑的問題是靶昆蟲會產(chǎn)生抗藥性(有機(jī)磷酸鹽、合成擬除蟲菊酯)、環(huán)境中和動植物組織內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)殘留和化學(xué)殺蟲劑對非目標(biāo)生物的有害作用(有機(jī)氯制劑、昆蟲生長調(diào)節(jié)劑)。硼化合物(四硼酸鈉、polybor)也被用來殺蟲。硼化合物穩(wěn)定，在實(shí)用劑量下殺蟲相對慢一些(Mullens和Rodriguez，1992)，人體大劑量攝入會致命(Anon，1991)。其他類型的殺蟲劑有昆蟲生長調(diào)節(jié)劑(IGRs)和能殺蟲的細(xì)菌毒素(如蘇云金芽孢桿菌(Bt)毒素)。IGRs是通過某種途徑干擾幾丁質(zhì)合成的化合物，其中包括保幼激素類似物(蒙五一五)、幾丁質(zhì)合成抑制劑(雙氧威、diflubenzuron、flurazuron)和三嗪衍生物(cyromazine)。關(guān)于昆蟲對很多種IGR的抗藥性已有記載。某些鱗翅目昆蟲也在對Bt毒素產(chǎn)生抗藥性。使用IGR和Bt毒素，在技術(shù)上很難保證在生活史中的合適階段對昆蟲有足夠殺傷。有些IGR穩(wěn)定并可能造成環(huán)境危害。最有用的殺蟲劑是那些有高的殺蟲活性和低的環(huán)境殘留的種類(有機(jī)磷、合成的擬除蟲菊酯)。但使用這些殺蟲劑最大的問題是靶昆蟲會產(chǎn)生抗藥性。據(jù)認(rèn)為，90％使用的殺蟲劑仍然是以傳統(tǒng)的神經(jīng)毒素殺蟲劑為基礎(chǔ)的。因此，迫切需要研制出替代的、低殘留的、對于抗現(xiàn)有殺蟲劑的昆蟲有效的殺蟲劑。稱為增效劑類的藥劑可以最大限度地增強(qiáng)特殊殺蟲劑的效用。增效劑自身可以有，也可以不具有殺蟲作用。Blood和Studdert(1988)將增效劑定義為對另一種化學(xué)藥劑起作用或有增強(qiáng)作用的化學(xué)藥劑。例如，胡椒基丁醚是合成擬除蟲菊酯的增效劑。與一種特定的殺蟲劑聯(lián)用時(shí)有效的增效劑，在與其他種類殺蟲劑聯(lián)用時(shí)可能沒有效果。雖然昆蟲也可能對增效劑產(chǎn)生抗性，但增效劑仍可被用來解決昆蟲抗藥的難題。增效劑在殺蟲劑配方中的作用對于獲得一個(gè)商業(yè)上可行的結(jié)果以及對殺蟲劑抗性的管理都是非常重要的。尋找有效的增效聯(lián)用，如同尋找有效的殺蟲劑本身一樣迫切需要(Forrester等，1993)。近來，人們把注意力集中到昆蟲的肽酶上，該酶的抑制為昆蟲的控制提供了可能的途徑。肽酶是普遍存在的裂解蛋白質(zhì)和肽類的酶，有助于腸和細(xì)胞中的消化作用。它們與昆蟲的胚胎發(fā)育、蛻皮和化蛹時(shí)的組織重排有關(guān)，也與防御入侵的有機(jī)體和蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)作用有關(guān)。肽酶是種類繁多的一類酶。目前根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)分類(1)催化的反應(yīng)(2)催化位點(diǎn)的化學(xué)性質(zhì)以及(3)由化學(xué)結(jié)構(gòu)所揭示的進(jìn)化關(guān)系。(Barrett，1994)在酶命名法(1992)中，國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)會(IUBMC)以酶分類(EC)的各類別劃分肽酶。這些類別是EC3.4.11-3.4.19為外肽酶(這些酶只在接近于肽鏈末端處起作用)，EC3.4.21-3.4.99為優(yōu)先作用于肽鏈內(nèi)部的酶。EC3.4.99是一族催化機(jī)理尚未確認(rèn)或非特征性的酶類。綜述肽酶種類及其與昆蟲生物化學(xué)的關(guān)系如下1、絲氨酸肽酶類這一族酶類有絲氨酸羧肽酶EC3.4.16和絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶EC3.4.21。絲氨酸肽酶的典型特征在于其活性位點(diǎn)有一個(gè)起催化作用的絲氨酸以及這類酶對酶抑制劑3，4-dichloroisocoumarin(3，4-DCI)敏感。哺乳類絲氨酸肽酶起作用的適宜pH范圍為2-8，不過，昆蟲的絲氨酸肽酶普遍適于堿性環(huán)境。(一些鱗翅目幼蟲的絲氨酸肽酶的適宜pH范圍為pH9-pH＞11)。昆蟲體內(nèi)絲氨酸肽酶的活性也常常以酶和合成的底物的反應(yīng)來定義。三個(gè)普通類型的絲氨酸肽酶(類胰蛋白酶、類凝乳酶和類彈性蛋白酶)就可以按這種方式定義。類胰蛋白酶的絲氨酸肽酶可與下列合成底物起反應(yīng)P-甲苯磺?；?L-精氨酰甲基酯[p-tosyl-l-argininemethylester(TAME)]，α-N-苯甲?；?L-精氨酰乙酯[α-N-benzoyl-L-arginineethylester(BAEE)]，α-N-苯甲?；?DL-精氨酰-P-硝基苯[α-N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide(BAPNA)]和苯甲?；?DL-精氨酰萘胺[benzoyl-DL-argininenaphthylamine(BANA)]。類凝乳酶可根據(jù)其與以下物質(zhì)的反應(yīng)來確定N-乙?；?L-苯丙氨酰乙酯(N-acetyl-L-phenylalanineester)(APNE)N-乙?；?L-酪氨酰乙基乙酯(N-acetyl-L-tyrosineethylester)(ATEE)N-苯甲?；?L-酪氨酰乙基乙酯(N-benzoyl-L-tyrosineethylester)(BTEE)N-苯甲?；?L-酪氨酰-p-硝基苯(N-benzoyl-L-tyrosine-p-nitroanilide)(BTPNA)L-戊二酰基-L-苯丙氨酰-p-硝基苯(L-glutaryl-L-phenylalanine-p-nitroanilide)(GPPNA)N-琥珀酰-L-苯丙氨酰-p-硝基苯(N-succinyl-L-phenylalanine-p-nitroanilide)(SPAPNA)L-戊二?；?L-苯丙氨酰萘胺(L-glutaryl-L-phenylalanine-naphthylanide)(GPNA)類彈性蛋白酶的絲氨酸肽酶抑制劑可以據(jù)其和合成底物，如N-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-亮氨酰p-硝基苯(N-succinyl-ala-ala-pro-leup-nitroanilide)(SAAPLpNA)的反應(yīng)來確定。絲氨酸肽酶的活性可以據(jù)其與酶抑制劑的反應(yīng)來說明。絲氨酸肽酶類酶通常被二異丙基-氟磷酸鹽(Di-isopropyl-fluro-phosphate)(DipF/DFF)和對苯基甲基磺基氟化物(paraphenylmethylsulphonylfluoride)(PMSF)抑制。類胰蛋白酶的肽酶被甲苯磺?；?L-賴氨酰-氯甲基酮(tosyl-L-lysinechloromethylketone)(TLCK)抑制。類胰蛋白酶的肽酶被甲苯磺?；?L-苯丙氨酰氯甲基酮(tosyl-L-phenylalaninechloromethylketone)(TPCK)抑制。類彈性蛋白酶的肽酶被水蛀(蛋白酶)抑制劑C(Eglin-C)抑制。已發(fā)現(xiàn)一些天然形成的蛋白質(zhì)能抑制絲氨酸肽酶的活性。這些物質(zhì)包括結(jié)晶的大豆胰蛋白酶抑制劑Kunitz(SBTI)和大豆胰蛋白酶抑制劑包曼-畢爾克抑制劑Bowman-Birk(BBTI)。其他不同的豆科作物種子含有占全部蛋白質(zhì)的1-4％的胰蛋白酶抑制劑，如鷹嘴豆胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制劑(CT)、菜豆胰蛋白酶抑制劑(LBTI)和豇豆胰蛋白酶抑制劑(CPTI)(MacIntosh等，1990)。動物來源的絲氨酸肽酶抑制劑有牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI，抑肽酶Aprotinin)，來源于卵的卵粘蛋白和血中的α-l-抗胰蛋白酶。絲氨酸肽酶具堿性最適pH條件，被認(rèn)為是昆蟲消化液中首要的可溶性酶。如天蛾科(sphingidae)(Miller等，1974)、夜蛾科(noctuidae)(Ahmed等，1976，1980；Ishaaya等，1971；Prichet等，1981；Teo等，1990；Broadway和Duffy，1986)、蠶蛾科(bombycidae)(Sasaki和Suzuki，1982；Euguchi和Iwanito，1976；Euguchi和Kuriyama1985)、粉蝶科(pieridae)(Lecadet和Dedonder，1966；Broadway等，1989)，螟蛾科(pyralidae)(larocque和Houseman，1990；Houseman等，1989；Mohammed和Altias，1987)和雙翅目(diptera)(Bowles等，1990)。Christeller等(1992)指出絲氨酸肽酶與十二種植食性的鱗翅目昆蟲的酪蛋白消化活性有關(guān)。在這篇文獻(xiàn)中，Christeller指出未發(fā)現(xiàn)其他肽酶顯示重要的消化活性。他還發(fā)現(xiàn)絲氨酸肽酶在消化角朊的鱗翅目昆蟲中起主要作用(Christeller等，1994；Prowning和Irzykiewicz，1962；ward1975a，b)。而且，它們在一些鞘翅目昆蟲(McGhie等，1995，Dymock等，1992)、一些直翅目昆蟲(Sakal等，1989；Christeller等，1990)、一些異翅目昆蟲(Cohen，1993)和一些雙翅目昆蟲(Bowles等，1990)的消化活動中起著重要作用。種內(nèi)和種間的消化性的絲氨酸肽酶在數(shù)目和催化特性上都有相當(dāng)大的不同(Applebaum，1985)。在一些實(shí)例中，認(rèn)為昆蟲食物中絲氨酸肽酶的抑制劑會引起消化抑制、以及攝食障礙(Dymock等，1992)。類胰蛋白酶的絲氨酸肽酶被認(rèn)為是涉及蛻皮關(guān)鍵的生長調(diào)節(jié)區(qū)。它們所顯示的作用包括蛻皮過程控制、將幾丁質(zhì)纖維暴露給幾丁質(zhì)酶以及表皮物質(zhì)的循環(huán)(Samuels和Paterson，1991)。由于其顯著的代謝作用、普遍的自然發(fā)生以及動植物體內(nèi)很多天然抑制劑的出現(xiàn)，絲氨酸肽酶作為昆蟲控制劑受到了極大關(guān)注。值得注意的是，將絲氨酸肽酶用于昆蟲防治的內(nèi)容幾乎都是在轉(zhuǎn)基因植物方面。2、半胱氨酸肽酶這一類酶包括半胱氨酸型羧肽酶(EC3.4.18)和半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶(EC3.4.22)。這些酶的特征是在活性位點(diǎn)具有催化活性的半胱氨酸殘基，以及對某些抑制劑敏感。半胱氨酸肽酶特征性地在還原條件下被激活(加入半胱氨酸、二硫蘇糖醇或其他還原劑)。半胱氨酸肽酶是昆蟲中腸中常見的可溶性酶。雖然在昆蟲體內(nèi)半胱氨酸肽酶適宜的pH值是中性或弱酸性，但哺乳動物的半胱氨酸肽酶則一般在低pH值條件下起作用(Wolfson和Murdock，1987)。半胱氨酸肽酶的活性可以根據(jù)它和合成的底物n-α-苯甲酰-L-精氨酰-p-硝基苯胺(n-α-benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide)(BAPNA)或苯甲酰-氧-羰基-苯丙氨酰-精氨酰-7-(4甲基)香豆酰胺(benzoyloxycarbonyl-phe-arg-7-(4methyl)coumarylamide)(Z-Phe-Arg-MCA)的反應(yīng)為例來說明。絲氨酸肽酶，特別是E-64的活性也可以據(jù)其和酶抑制劑，如碘乙酰胺、碘乙酸、重金屬、p-對氯[高]汞苯甲酸、胱氨酸氰化物、N-乙基-順丁烯二酰亞胺的反應(yīng)來說明。E-64是由日本曲霉(Aspergillusjaponicus)的一個(gè)菌株中得到的一個(gè)小肽(L-反-環(huán)氧-琥珀酰-亮氨酰胺-4-胍乙基-丁烷)，已在微生物(E-64)、植物(稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑I和II及馬鈴薯多半胱氨酸蛋白酶抑制劑PCM)和動物(母雞卵細(xì)胞半胱氨酸蛋白酶抑制劑HEC)中鑒定了天然產(chǎn)生的半胱氨酸肽酶?？雇此?Antipain)是另一種熟知的半胱氨酸肽酶抑制劑。半胱氨酸肽酶作為腸道的可溶性消化酶類在一些昆蟲中起著主要作用，顯著的如鞘翅目(coleopteran)昆蟲(Orr等，1994；Thie和Houseman，1990；Liang等，1991)。利用半胱氨酸肽酶的抑制劑控制昆蟲，已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行了大量探索(Orr等，1994；Wolfson和Murdock，1987)。3、天冬氨酸肽酶(EC3.4.23)這類酶典型地在活性位點(diǎn)具2個(gè)天冬氨酸殘基。大多數(shù)天冬氨酸肽酶在低pH值時(shí)活性最強(qiáng)。這類酶的合成底物包括N-芐氧羰基谷氨酰-L-酪氨酸和N-乙酰-L-phenanyl、二碘酪氨酸(diiodotyrosine)。天冬氨酸肽酶的特征性抑制劑包括胃蛋白酶抑制劑(pepstatin)和二苯基重氮甲烷(diphenyldiazomethane)(McDonald，1985)。胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin)是一種來源于微生物的天然產(chǎn)生的抑制劑。Applebaum(1985)曾指出一些天冬氨酸肽酶對雙翅目的昆蟲(dipteran)的重要性。Wolfson和Murdock(1987)曾證實(shí)通過胃蛋白酶抑制劑(pepstatin)對一種鞘翅目昆蟲馬鈴薯葉甲幼蟲造成的一些生長抑制，但是，更強(qiáng)的生長抑制是針對半胱氨酸肽酶造成的。通過廣泛查尋有關(guān)肽酶的文獻(xiàn)結(jié)果表明，將昆蟲天冬氨酸肽酶用于昆蟲控制，不論是以植物的轉(zhuǎn)基因改造還是局部的應(yīng)用，都只進(jìn)行了有限的研究。Christeller等(1992)發(fā)現(xiàn)，天冬氨酸肽酶的活性顯然在鱗翅目昆蟲的腸道物中不明顯。4、金屬肽酶公認(rèn)這類酶典型地在活性位點(diǎn)含有催化活性的金屬離子(一般為鋅離子)，而且對螯合劑敏感。金屬肽酶的類型包括一些肽鏈內(nèi)切酶(酶切肽鏈中間的酶)和肽鏈端解酶(由肽鏈末端酶切氨基酸的酶)。肽鏈端解酶可以進(jìn)一步劃分為羧肽酶類(這類酶從C末端酶切氨基酸)或氨肽酶類(這類酶從N末端酶切氨基酸)。金屬肽鏈內(nèi)切酶(EC3.4.22)這類酶除了在以角蛋白為食的鱗翅目昆蟲消化羊毛時(shí)可能起作用外，還未曾涉及昆蟲的生物化學(xué)(Prowning和Irykiewicz，1962；Ward，1975a和b；Christeller等，1990，1994)。金屬羧肽酶(EC3.4.17)金屬羧肽酶的活性需要一個(gè)二價(jià)陽離子(常為Zn2+)。它們以游離態(tài)存在或處于膜被結(jié)構(gòu)中，高的pH(8-10)有利于其活性。羧肽酶的合成底物包括馬尿酰-DL-苯基-乳酸(hippuryl-DL-phenyl-lacticacid)和馬尿酰-L-精氨酸(hippuryl-L-arginine)，它們分別是羧肽酶A和B的底物。羧肽酶A類似的酶在昆蟲體內(nèi)顯得更普遍些，已在直翅目、鞘翅目、雙翅目和鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)。金屬羧肽酶的合成抑制劑包括1，10-鄰二氮雜菲、乙二胺四乙酸(EDTA)，β-羥基喹啉和磷酰胺(phosphoramidon)。金屬羧肽酶的天然產(chǎn)生的抑制劑是來源于土豆的羧肽酶抑制劑(PCPI)。已確認(rèn)在鱗翅目幼蟲的中腸物質(zhì)中有游離的或膜被形式的羧肽酶(Ferreira等，1994；Christeller，1990)。Chriteller等(1992)將這類酶描述為蛋白質(zhì)消化體系中所需的成份。在本申請的優(yōu)先權(quán)日之前，這類酶還未被公認(rèn)是植物轉(zhuǎn)基因改造的目標(biāo)，更不用說用作局部控制劑的成份。氨肽酶(EC3.4.11-3.4.13)氨肽酶從肽鏈的N-末端水解氨基酸，一般根據(jù)其對金屬(如Zn2+或Mg2+)的依賴性來分類。研究最徹底的氨肽酶既以膜被也以可溶形式存在于哺乳類的消化道中。常以標(biāo)示其適宜pH酸性(A)、堿性(B)或中性(N)的下標(biāo)字母，或者以其膜被(M)狀況，或者以從肽鏈底物切下來的氨基酸的數(shù)目和類型來命名氨肽酶。這些名稱并非專有；因此亮氨酸氨肽酶M或N是一種優(yōu)先，但不是專門由肽鏈切去亮氨酸的酶，它由膜包被，在中性pH時(shí)活性最佳。氨肽酶優(yōu)先水解亮氨酰、精氨酰、甲硫氨酰、天冬氨酰、丙氨酰、谷氨酰、脯氨酰、纈氨酰和半胱氨酰殘基；但是底物特異性常常較廣，而且依賴于肽鏈中的其他殘基(Taylor，1993a和b)。雖然已知一些細(xì)菌來源的酶的活性不需要金屬離子，大多數(shù)氨肽酶是金屬肽酶(Taylor，1993a和b)。很顯然，氨肽酶沒有天然抑制劑。昆蟲氨肽酶最適pH通常為堿性，一般會被貝他定(bestatin)(Taylor，1993)和鄰二氮雜菲(Barrett，1994)抑制。如上所述，氨肽酶的底物特異性廣泛，但典型的底物包括亮氨酸-戊糖核酸(leu-pNA)、精氨酸-戊糖核酸、甲硫氨酸-戊糖核酸和脯氨酸-戊糖核酸。金屬氨肽酶會被螯合劑(如EDTA)抑制，這些螯合劑或者從肽酶移去金屬離子，或者與酶形成失活的絡(luò)合物(Terra&Ferriera，1994)。某一特定螯合劑的作用會隨氨肽酶的類型和螯合劑自身的結(jié)構(gòu)而改變。氨肽酶還被認(rèn)為是昆蟲的有消化作用的肽補(bǔ)體，并認(rèn)為它們涉及蛋白質(zhì)消化的最后階段(Terra&Ferriera，1994)。Christellar等(1990，1992)曾斷言這些肽鏈端解酶(包括氨肽酶)對于昆蟲控制是沒什么用的，因?yàn)檫@些酶在消化攝入的蛋白質(zhì)中的作用與絲氨酶和半胱氨酸肽酶相比很小。還未見將昆蟲幼蟲暴露給特異的亮氨酸氨肽酶(LAP)抑制劑后，出現(xiàn)生長遲滯的報(bào)道。Christellar等(1990)曾以粗制的黑蟋蟀的腸道提取物證明，雖然肽鏈端解酶的含量，尤其是LAP的量在這種昆蟲中是重要的，但肽鏈端解酶消化的蛋白質(zhì)僅占16-20％。在Christellar等(1990)的研究中，還發(fā)現(xiàn)在2種有效的絲氨酸肽酶的抑制劑存在時(shí)，肽鏈端解酶對蛋白質(zhì)的消化會被大大減弱。這是由于缺乏作為肽鏈端解酶底物的寡肽末端。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明了氨肽酶在昆蟲控制中的作用很小。上述發(fā)現(xiàn)有力地說明，肽鏈端解酶抑制劑(主要是氨肽酶抑制劑)不能作為昆蟲控制劑，而且特別有力地說明了不能將絲氨酸肽酶抑制劑和氨肽酶抑制劑聯(lián)用作為昆蟲控制劑。除了消化功能，氨肽酶還被證實(shí)在鱗翅目昆蟲Manducasexta的蛻皮液中有活性(Jungries，1979)。但也又一次表明了氨肽酶的功能似乎是次于絲氨酸(類胰蛋白酶)肽酶的功能。尚未有在昆蟲發(fā)育中重要的氨肽酶或金屬肽酶的天然抑制劑對延緩?fù)懫び行У膱?bào)道。也還沒有將這些抑制劑用于產(chǎn)生抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物。理論上，將肽酶抑制劑用于控制對化學(xué)殺蟲劑有抗藥性的昆蟲似乎有很大潛力。首先，肽酶抑制作用的機(jī)理不同于有機(jī)磷類和合成的擬除蟲菊酯的作用機(jī)理。其次，肽酶的活性位點(diǎn)的氨基酸順序似乎是高度保守的(Taylor，1993)，因而發(fā)生突變而無隨之而來的活性喪失的可能性小。最后，如果發(fā)生昆蟲對一種特定的肽酶抑制劑產(chǎn)生抗性，那么這種抗性不會繼續(xù)到其他的肽酶介導(dǎo)的代謝活動中去。但是，將肽酶抑制劑用于昆蟲控制有一些嚴(yán)重的問題。可能需要的頻繁使用，會使一種產(chǎn)品沒有好效益。而且，肽酶抑制劑雖然會限制幼蟲的生長，但當(dāng)使用量增加時(shí)，可能在劑量-反應(yīng)曲線中達(dá)到一個(gè)停滯期。以肽或蛋白質(zhì)為主劑的肽酶抑制劑雖然在環(huán)境中可能不會殘留，但可能難以保存太長的時(shí)期，而且在硬水中分裝時(shí)可能失效。需要說明一下可能涉及到的一種特定酶抑制劑來源的細(xì)微問題。例如，已注意到的異常反應(yīng)涉及Costelytrazealandica的生長會受到大豆、土豆和豇豆的胰蛋白酶抑制劑的抑制，而被鷹嘴豆的胰蛋酶抑制劑刺激(Dymock等1992)。大量的研究工作集中在昆蟲蛋白質(zhì)代謝的生物化學(xué)研究，主要是利用昆蟲組織、腸提物、體外半純化或純化的酶研究消化代謝。很多工作是為植物轉(zhuǎn)基因改造而選擇酶抑制劑，通過研究消化酶與蛋白質(zhì)或肽抑制劑的關(guān)系而進(jìn)行的。(Applebaum，1985；Christeller等1989，1990，1992；Lenz等1991；Teo等，1990；Pritchett等1981，Santos和Terra，1984；Dow1986；Sakal等，1984，1989)。相對較少的研究證明了肽酶抑制劑對昆蟲生長和/或繁殖直接的不利影響。已證明絲氨酸肽酶和半胱氨酸肽酶抑制劑會減少各種昆蟲，包括四紋豆象(Callosobruchusmaculatus)、Leptinotarsadecemlineat、Heliothisspp、沙草夜蛾(Spodopteraexiqua)、Costelytrazealandica、TeleogrylluscommodusDiabroticasp、Manducasexta、赤擬谷盜(redflourbettle)和大豆象(beanweevil)的幼蟲生長量或存活率(Gatehouse和Boulter1983；Shukle和Murdock，1983；Shade等，1986；Wolfson和Murdock，1987；Broadway和Duffy1986，Hilder等1987；Dymock等，1992；Orr等1994；Burgess等，1994；Hines等1990)?？偟膩碚f，昆蟲生長的抑制是通過使用腸道主要消化酶的抑制劑而達(dá)到的。Christeller等(1992)描述了一種以這些酶為基礎(chǔ)，選擇合適的殺昆蟲的抑制劑的方法(1992)。上述研究中似乎沒有直接以生產(chǎn)局部施用的昆蟲控制劑，通過干擾蛋白質(zhì)代謝為目標(biāo)的。不過，在Czapla的國際專利申請No.WO94/16565中，一個(gè)次要的權(quán)利要求引證了局部使用抑蛋白酶肽(aprotinin)或另一種與抑蛋白酶肽有90％同源性的絲氨酸肽酶，用于控制歐洲玉蜀黍鉆蛀蟲(ECB)和南方玉蜀黍根蠕蟲(SCR)。根據(jù)權(quán)利要求，抑蛋白酶可以單獨(dú)或與一種殺蟲的植物凝集素聯(lián)用。Czapla在實(shí)驗(yàn)室分析中發(fā)現(xiàn)，抑蛋白酶肽在食物中的比例為20mg/ml時(shí)殺死了100％的ECB的新生幼蟲，并能殺死60％的SCR的新生幼蟲；而通過局部應(yīng)用很難達(dá)到這樣高的攝入率，而且其處理費(fèi)用無法與化學(xué)殺蟲劑競爭。Czapla發(fā)現(xiàn)絲氨酸肽酶抑制劑SBTI(Kunitz和Bowman-Birk)和半胱氨酸肽酶抑制劑抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(cystatin)不及抑蛋白酶肽(aprotinin)有效。Deloach和Spates(1980)曾對吸血昆蟲直接喂飼SBTI進(jìn)行了研究。他們發(fā)現(xiàn)在SBTI被牛紅細(xì)胞包被并用作螫蠅的誘餌時(shí)，死亡率增高而且卵孵化受抑制。已知在血液中有幾種天然的肽酶抑制劑(主要為絲氨酸抑制劑)。但是，這些抑制劑在保護(hù)動物不受昆蟲侵害方面功效有限(Sandeman等，1990)。Wolfson和Murdock(1987)注意到雖然有很多有關(guān)植物中的肽酶抑制劑的存在和分布的記載，并且可以推測這些抑制劑是針對昆蟲消化的肽酶的，但與此同時(shí)，卻幾乎沒有支持其在抑制昆蟲的生長和發(fā)育方面有效作用的直接證據(jù)。他們證實(shí)了在馬鈴薯葉片上用50μg/ml閾水平的E-64(一種半胱氨酸肽酶抑制劑)喂飼馬鈴薯葉甲蟲時(shí)，幼蟲的生長會減慢。但是在一個(gè)高得多的施用水平時(shí)(1000μg/ml)，會發(fā)現(xiàn)有一個(gè)死亡率為74-85％的遲滯時(shí)期，這一死亡率對于實(shí)際應(yīng)用是不夠的。SBTI類(Kunitz和Bowman-Birk)用作生長延緩劑是無效的，且昆蟲對pepstatin的反應(yīng)小。Dymock等(1992)的一篇研究論文曾就肽酶(peptidase)抑制劑對鞘翅目昆蟲幼蟲(新西蘭天然草場蠐螬)的生長抑制進(jìn)行了探討。由于蠐螬以草根為食，這一研究集中在對重要的牧草種類進(jìn)行遺傳改造上。生物檢定表明了使用肽酶抑制劑對生長具抑制作用。人們已注意到對特殊的抑制劑的不正常反應(yīng)(被SBTI、POTI、POTII、CpTI抑制，被LBTI刺激)。盡管事實(shí)是正常情況下鞘翅目腸肽酶在半胱氨酸肽酶中占優(yōu)勢，Christeller等(1989)在這之前證明了上述蠐螬中胰蛋白酶是主要的腸肽酶。在局部應(yīng)用中，要達(dá)到致死效果時(shí)，通常肽酶抑制劑的使用量太高而在成本上沒有實(shí)益。通過抑制金屬肽酶(包括氨肽酶或LAP)起作用的組合物，還尚未進(jìn)行商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)以控制昆蟲。實(shí)際上，現(xiàn)有技術(shù)說明了以肽為主劑的肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑不能用于昆蟲控制。因?yàn)?a)還未驗(yàn)證上述類型中有適合于植物遺傳改造的有效抑制劑。(b)與昆蟲腸道中占優(yōu)勢的半胱氨酸肽酶和/或絲氨酸肽酶相比，這類酶抑制劑的作用很小。Shenvi(1993)曾討論將α-氨基的硼酸衍生物用作哺乳類氨肽酶的有效抑制劑。Shenvi注意到在合成α-氨基硼酸衍生物中，某些中間產(chǎn)物有殺蟲性能；但這些中間產(chǎn)物沒有氨基基團(tuán)，被認(rèn)為既不作為氨肽酶抑制劑，也不作為任何類型的肽酶抑制劑起作用。Samuels和Paterson(1995)，以及Ferreira和Terra(1986)認(rèn)為六齒的(hexadentate)金屬螯合劑EDTA是來自蛻皮液和消化膜的氨肽酶抑制劑。人們對EDTA的殺蟲效果并無公認(rèn)，但Tomalia和Wilson(1985，1986)認(rèn)為金屬螯合劑有殺蟲作用，但他們未給出任何證據(jù)。可以預(yù)計(jì)，將硬水用于噴灑施藥時(shí)，或有礦質(zhì)或有要處理的金屬或土壤污染時(shí)，金屬螯合劑對昆蟲控制的作用會受到不利影響?，F(xiàn)在我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，這個(gè)含有氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑，并還含有非緊密螯合的金屬肽酶抑制劑的組合物，能阻止昆蟲卵的孵化和/或昆蟲幼蟲的發(fā)育。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，正如本文所定義的那樣，絕大多數(shù)這種氨肽酶抑制劑實(shí)際上都是非緊密螯合的。很容易理解，通過各種不同途徑可將此發(fā)明應(yīng)用于昆蟲控制。本發(fā)明的方法可以是導(dǎo)致實(shí)際滅殺昆蟲，或者干擾昆蟲的生長發(fā)育而延緩或阻止成熟。由于很多經(jīng)濟(jì)上重要的昆蟲會由于其幼蟲的攝食活動而造成損害，因此，阻止昆蟲卵的孵化顯得尤其必要。人們也會理解，由于昆蟲綱的成員中個(gè)體生化能力的差別很大，不同的種對特定的抑制劑和/或抑制劑聯(lián)用的反應(yīng)也會不同。因而，有可能本發(fā)明范圍內(nèi)的一些組合物抗某些昆蟲的效果不好或者甚至無效，但可以高效地抗其他昆蟲。對于特殊的昆蟲來說，反應(yīng)的差異可見于亞種水平或生活史中不同階段，甚至是隨所攝入食物不同而異。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員能夠通過應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室和田間實(shí)驗(yàn)的漸次逼近法將相關(guān)的抑制劑同靶昆蟲對應(yīng)起來。顯然，對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說，這一發(fā)明可以采用各種不同的方式應(yīng)用，包括但不限于(a)直接應(yīng)用于易受昆蟲侵害的植物或動物來控制昆蟲侵?jǐn)_；(b)通過將本發(fā)明的藥劑施于昆蟲棲息地或繁殖地來減少昆蟲數(shù)目；(c)通過預(yù)防或減少由昆蟲傳播的動植物感染的嚴(yán)重性來控制昆蟲；和(d)通過預(yù)防或減少由于昆蟲侵?jǐn)_而導(dǎo)致的植物或動物感染的嚴(yán)重性來控制昆蟲。為理解本說明書，“肽酶抑制劑”一詞應(yīng)該理解為任何可以抑制任意肽酶的物質(zhì)。實(shí)際使用時(shí)，可以按如下步驟確認(rèn)一種肽酶抑制劑。1、選擇典型的有活性的肽酶，這種酶可以是純化了的或是含該活性酶的組合物。2、對每一有代表性肽酶選擇酶活性測定法，即為酶選擇合適的底物和反應(yīng)條件，使反應(yīng)在適當(dāng)時(shí)間內(nèi)達(dá)到合適的可定量的反應(yīng)終點(diǎn)。3、如果在任意上述酶活性分析中發(fā)現(xiàn)有50％或更大的反應(yīng)抑制，就認(rèn)為測試物為肽酶抑制劑。尤其是金屬肽酶抑制劑或氨肽酶抑制劑可以采用這種方法來確認(rèn)?！胺抢喂舔系碾拿敢种苿币辉~應(yīng)理解為在競爭性結(jié)合的評定中，螯合Zn2+不及EDTA牢固的肽酶抑制劑。反應(yīng)混合物中EDTA和抑制劑應(yīng)該濃度相同，如可以方便地定為0.1mM。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員能夠選擇合適的反應(yīng)條件和方法來測定Zn2+的分布。(如利用多核核磁共振(NMR)、紫外分光鏡、電量測量技術(shù)和軟性離子團(tuán)分光鏡)。本發(fā)明概述一方面，本發(fā)明包括用于控制昆蟲的組合物，所述組合物含有一種氨肽酶抑制劑或一種金屬肽酶抑制劑，還含有一種非牢固螯合的肽酶抑制劑。氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑可以含有一個(gè)氨基基團(tuán)或其衍生的基團(tuán)，或者一個(gè)或多個(gè)氨基酸部分或其衍生物。優(yōu)選該氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑含有一個(gè)亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸或半胱氨酸的部分結(jié)構(gòu)或其衍生物。更優(yōu)選的氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑含有一個(gè)亮氨酸部分或其衍生物。氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑可以與氨肽酶或金屬肽酶活性位點(diǎn)的金屬離子起反應(yīng)。氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑可以含有一種螯合劑，優(yōu)選二齒、三齒、四齒或六齒螯合劑。優(yōu)選這種螯合劑為有螯合作用的氨基酸羧酸部分和其鹽類，更優(yōu)選為乙二胺四乙酸或次氮基三乙酸或其有螯合作用的鹽或衍生物。氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑可以含有水溶性的過渡金屬，包括銅、鈷、鋅、釩、鎂、錳和鐵的離子、配合物或衍生物。氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑可以含有硼、磷?；蜢Ⅴ；糠?。氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑可以不可逆地結(jié)合到氨肽酶或金屬肽酶上去。氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑可以含有不抑制胰蛋白酶或需鈣蛋白酶(calpain)的選擇性抑制物，而且優(yōu)選不抑制其他絲氨酸或半胱氨酸肽酶。氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑可以抑制下列酶中的一種亮氨酸氨肽酶、A、B、N和M型氨肽酶、精氨酸氨肽酶、甲硫氨酸氨肽酶、D-氨基酸氨肽酶、肽鍵-二肽酶、Zn-氨肽酶、N-甲酰甲硫氨酸氨肽酶、二肽鍵-氨肽酶、羧肽酶A和B、三肽鍵-肽酶、二肽鍵肽酶和肽鍵-三肽酶。優(yōu)選氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑能抑制亮氨酸氨肽酶，更優(yōu)選抑制昆蟲亮氨酸氨肽酶。非牢固螯合的肽酶抑制劑可以含有絲氨酸肽酶抑制劑，半胱氨酸肽酶抑制劑，天冬氨酸肽酶抑制劑或氨肽酶抑制劑。本發(fā)明中適用的抑制劑包括但不限于·胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制劑，如pefabloc；·來源于豆科作物、蔬菜、水果或谷物的絲氨酸或半胱氨酸肽酶抑制劑；·抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(cystatins)和E-64；·馬鈴薯或其他來源的羧肽酶抑制劑；·水蛀(蛋白酶)抑制劑C(EglinC)；·L-巰基亮氨酸(L-Leucinethiol)。胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制劑包括但不限于Kunitz胰蛋白酶抑制劑(SBTI)、Bowman-Birk胰蛋白酶抑制劑和糜蛋白酶抑制劑、大豆胰蛋白酶抑制劑、牛胰蛋白酶抑制劑、雞卵類粘蛋白胰蛋白酶抑制劑、筍瓜胰蛋白酶抑制劑、POT-I和POT-II胰蛋白酶抑制劑、α-l-抗胰蛋白酶劑、慈菇胰蛋白酶抑制劑、紅細(xì)胞胰蛋白酶抑制劑和人inter-alpha胰蛋白酶抑制劑。豆科作物、蔬菜、水果或谷類的絲氨酸肽酶或半胱氨酸肽酶包括但不限于來源于紅豆、豇豆、wingbean、綠豆、歐白芥屬、南瓜、葛縷子、cajunpea、棉花、玉蜀黍、小麥、高粱屬、油菜籽、粟(millet)、大麥和西葫蘆的肽酶抑制劑。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(cystatins)包括但不限于來源于稻的稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑I和II(oryzacystatinI和II)、馬鈴薯多抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(multicystatin)和用胰蛋白酶消化的亞單元以及雞卵細(xì)胞抑半胱氨酸蛋白酶蛋白。本文每一例中都以普通名稱提及肽酶抑制劑，這些提法應(yīng)包括這類抑制劑的類似物，即與普遍確認(rèn)的物質(zhì)有相似的結(jié)構(gòu)和/或抑制特點(diǎn)(與靶酶的活性位點(diǎn)起反應(yīng))的抑制劑。合適的類似物可以是被命名的抑制劑的部分、其同源物，或者與被命名的物質(zhì)有至少70％同源性、優(yōu)選至少80％同源性和更優(yōu)選至少90％同源性的物質(zhì)。本發(fā)明的組合物也可以任意含有一種或多種添加劑，如分散劑、粘度調(diào)節(jié)劑、抗凍劑、潤濕劑、助溶劑、紫外線吸收劑、染料和載體，這些添加劑都是藥學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)或園藝學(xué)應(yīng)用中可接受的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物含有選自于L-巰基亮氨酸(L-Leucinethiol)、放線酰胺素(actinonin)、貝他定(bestatin)、1，10-菲咯啉(1，10-phenanthroline)和EDTA的氨肽酶抑制劑，以及選自SBTI、pefabloc和抗痛素的非牢固螯合的肽酶抑制劑。優(yōu)選氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑或非牢固螯合的肽酶抑制劑含有肽、多肽和/或蛋白質(zhì)。另一方面，本發(fā)明提供了包括根據(jù)本發(fā)明，將所述昆蟲暴露給某種組合物以控制昆蟲的方法。優(yōu)選通過將所述昆蟲卵或幼蟲暴露給本發(fā)明的混合物，以阻止昆蟲卵孵化和/或阻止昆蟲幼蟲發(fā)育，從而來控制昆蟲。優(yōu)選這種昆蟲是下列靶昆蟲中某一種鱗翅目(Lepidoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、嚙蟲目(Psocoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、網(wǎng)翅目(Dictyoptera)等翅目(Isoptera)、纓翅目(Thysanoptera)、同翅目(Homoptera)、雙翅目(Diptera)、廢翅目(Anaplura)、Malophaga、和蚤目(Siphonaptera)。這種昆蟲更優(yōu)選為下列昆蟲蛆蠅、芽蟲、跳蚤、黑蟋蟀、蟑螂、蘋淺褐卷葉蛾和谷類與面粉儲藏昆蟲。根據(jù)本發(fā)明的方法，靶昆蟲可以以任何合適的方式暴露給酶抑制劑。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以體會到，這些方式可以根據(jù)抑制劑是施于植物還是動物，靶昆蟲的特性以及動、植物的特性而有很多變化。將酶抑制劑直接施于被昆蟲侵?jǐn)_的植物或動物的合適方法，可能與將酶抑制劑施于昆蟲棲息地或繁殖地的方法大不相同。將酶抑制劑施于動物的適宜方法包括但不限于直接局部施用，如浸蘸或噴灑，或者內(nèi)部施用，如口灌、植入法、適于在瘤胃中停留的大團(tuán)緩釋藥劑或裝置以及昆蟲誘餌和藥片等。將本發(fā)明的抑制劑施于人時(shí)，適于局部施用的方式包括但不限于噴灑、煙霧劑、乳劑和洗劑，適于內(nèi)部施藥的方法包括但不限于片劑、膠囊或液體配方。某些情況下，對人或動物來說，采用注射的非腸道途徑可能是最合適的治療方式。將酶抑制劑施于植物，合適的方式包括但不限于噴劑、粉劑、丸劑或煙霧劑。本發(fā)明的方法也包括同時(shí)或連續(xù)施用2種或更多種的金屬肽酶抑制劑，或使用一種或多種金屬肽酶抑制劑或氨肽酶抑制劑，結(jié)合一種或多種其他類型酶的抑制劑、或一種或多種其他昆蟲生理過程的抑制劑、或一種或多種無論采用外部、內(nèi)部還是遺傳改造的方法施用的殺昆蟲劑。對于本發(fā)明有用的一些抑制劑在性質(zhì)上屬于肽、多肽或蛋白質(zhì)。這種情況下，氨肽酶或金屬肽酶的抑制劑和非牢固螯合的肽酶抑制劑中的任一種或兩者，都可以在靶植物或非人類的動物中通過轉(zhuǎn)基團(tuán)表達(dá)獲得。當(dāng)在這兩種抑制劑中只有一種通過轉(zhuǎn)基團(tuán)表達(dá)時(shí)，另一種可以采用局部施用的方法。優(yōu)選轉(zhuǎn)基因生物為易被昆蟲侵?jǐn)_的植物或非人類的動物，但也可以是居留在易受侵?jǐn)_的動物或植物體上的生物。后一情況下，優(yōu)選這種生物與植物或動物共生或共棲。適合居留的生物包括但不限于芽孢桿菌(Bacillusspp.)，或假單胞菌(Pseudomonasspp.)，或分枝桿菌(Mycobacteriumspp.)。在一個(gè)優(yōu)選方案中，這些生物為蘇云金芽孢桿(Bacillusthuringiensis)或分枝桿菌(Mycobacteriumphlei)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物的方法是本領(lǐng)域中熟知的，表達(dá)蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)晶體蛋白的植物能抵抗昆蟲侵?jǐn)_。在本發(fā)明的優(yōu)選但沒有限制性的實(shí)施方案中(a)以本發(fā)明的方法處理的動物選自人、綿羊、牛、馬、豬、家禽、狗和貓。(b)以本發(fā)明的方法處理的植物選自棉花、油料作物、觀賞植物、花卉、果樹、谷類作物、藤本植物、塊莖植物、牧草和蔬菜。(c)應(yīng)用本發(fā)明在園藝和大田中控制的昆蟲為鱗翅目(Lepidoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、等翅目(Isoptera)、纓翅目(Thysanoptera)或同翅目(Homoptera)。而所控制的引起動物感染的昆蟲為雙翅目(Diptera)、Anaplura、Malophaga或蚤目(Siphonaptera)，或者為居家或工業(yè)害蟲的等翅目(Isoptera)、網(wǎng)翅目(Dictyoptera)和膜翅目(Hymenoptorn)。(d)轉(zhuǎn)基因植物選自于棉花、油料種子作物，觀賞植物、花卉、果樹、谷類作物、藤本作物、塊莖作物、牧草和蔬菜，和(e)棲息于動植物體內(nèi)或體表的轉(zhuǎn)基因生物為芽孢桿菌(Bacillusspp.)、假單胞菌(Pseudomonasspp.)或分枝桿菌(Mycobacteriaspp.)。轉(zhuǎn)基因植物或生物可以按本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知的技術(shù)來制備。例如，一種非人類的動物、植物或其它生物可以按下列步驟進(jìn)行改造·制備一種合適的載體，它含有編碼抑制氨肽酶或“非牢固螯合的”肽酶的肽制劑的核苷酸序列，還含有一個(gè)啟動子，其核苷酸序列能被含有此載體的宿主表達(dá)。·將載體整合到宿主體內(nèi)，·保持含有該載體的宿主于合適條件，使該核苷酸序列轉(zhuǎn)錄和翻譯為所述肽制劑。本發(fā)明的詳細(xì)描述現(xiàn)僅以參考下述非限制性的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。下述實(shí)例說明了應(yīng)用本發(fā)明達(dá)到的昆蟲生長抑制或殺滅作用。不過，其他方法和應(yīng)用也可以采用。絲氨酸和半胱氨酸肽酶抑制劑單獨(dú)作用(不在本發(fā)明的范圍內(nèi))在此用來說明不同種對抑制劑反應(yīng)的差異，或者用以說明應(yīng)用本發(fā)明產(chǎn)生的加性作用或協(xié)同增效作用。實(shí)施例1單獨(dú)的抑制劑對綿羊麗蠅(Luciliacuprina；雙翅目Diptera)幼蟲的生長和存活的影響方法幼蟲從表面以0.5％次氯酸鈉消毒的卵孵化而來，并于27℃保溫過夜。收集一齡幼蟲，并置于1ml標(biāo)記好的含或不含抑制劑的經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)基上。這種培養(yǎng)基是在無菌小瓶中，含有溶于蒸餾水的2％瓊脂、10％酪蛋白、2％酵母和0.5％葡萄糖。根據(jù)所要培養(yǎng)的時(shí)間，將5至50條幼蟲置于每個(gè)小瓶中，然后蓋上裝有塑料細(xì)網(wǎng)的蓋子。這種蓋子能使空氣自由交換進(jìn)出小瓶。然后將瓶子放入一個(gè)大的密封的無菌容器中，隔絕其與周圍環(huán)境接觸。該容器有導(dǎo)入管和導(dǎo)出管，它們分別與無菌的溫暖濕潤空氣和一個(gè)真空泵相連。將這些裝置，包括培養(yǎng)瓶，置于35℃下24-72小時(shí)，使幼蟲生長到所要需的成熟階段。在無菌的空氣流通的罩內(nèi)建立培養(yǎng)，并在無菌的環(huán)境中保溫以減少被細(xì)菌感染的可能性。細(xì)菌感染可能有助于或阻礙幼蟲生長，從而使結(jié)果無效。經(jīng)所需時(shí)間的培養(yǎng)，取出培養(yǎng)瓶并冰凍殺死幼蟲。然后將它們一起或單獨(dú)干燥、稱重。將對照培養(yǎng)(除無抑制劑外，在同樣的環(huán)境條件和食物條件下同時(shí)培養(yǎng)幼蟲)的昆蟲幼蟲的體重，與有抑制劑條件下培養(yǎng)的幼蟲的體重相比較，并根據(jù)下式計(jì)算抑制百分比(I)I=c-ac×100]]>其中a＝有抑制劑存在時(shí)的幼蟲體重；和c＝對照幼蟲的體重在這一培養(yǎng)體系中對大量的抑制劑進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，挑選一部分示于表1.1；抑制劑對一齡幼蟲的生長和存活的效果示于表1.2。表1.1對麗蠅幼蟲進(jìn)行離體試驗(yàn)的肽抑制劑和相關(guān)化合物</tables>*除非另外說明，酶抑制劑在無菌磷酸鹽緩沖液或無菌水中是可溶的。將僅溶于二甲亞砜/水或甲醇/水的酶抑制劑組，與含有同樣量的二甲亞砜或甲醇的對照組進(jìn)行比較。表1.2各種抑制劑對一齡幼蟲生長和存活的作用<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="846">抑制劑所測試的濃度(mM)生長抑制大豆胰蛋白酶種抑制劑0.17，0.20，0.40，10.17mM時(shí)抑制76％0.4mM時(shí)抑制64％Pefabloc0.5，1，10，25，5010mM時(shí)抑制72％50mM時(shí)抑制92％APMSF1，2，55mM時(shí)抑制43％E641，2，5未檢測到抑制作用EDTA1，2.5，5，105mM時(shí)抑制84％10mM時(shí)全部殺死L-巰基亮氨酸1，2，52mM時(shí)抑制47％5mM時(shí)全部殺死貝他定1，2.5，55mM時(shí)抑制63％亮抑蛋白酶肽(Leupeptin)1，2，5，102mM時(shí)抑制71％10mM時(shí)抑制80％TLCK1，2.5，5，105和10mM時(shí)全部殺死TPCK1，2，5，10未檢測到抑制作用需鈣蛋白酶抑制劑I1，2，52mM時(shí)抑制71％Leuhistin1，2，55mM時(shí)抑制65％Amastatin1，2，510mM時(shí)抑制90％2mM時(shí)抑制60％Diprotin1，2，5，10未檢測到抑制作用EbelactoneB1，2，52mM時(shí)抑制18％放線酰氨素(Actinonin)1，2.5，1010mM時(shí)抑制95％25mM時(shí)抑制83％胃蛋白酶抑制劑1，2，10未檢測到抑制作用抗痛素(Antipain)0.3125，0.625，1.25，2.5，55mM時(shí)為63.22.5mM時(shí)為45.51，10-菲咯啉1，2.5，5所有幼蟲死去</table></tables>結(jié)果表明，作用于類胰蛋白酶的抑制劑在延緩幼蟲生長方面有效，或存在TLCK(N-甲苯磺酰-L-賴氨酰-氯甲基酮)時(shí)，試驗(yàn)的最高濃度對殺死幼蟲有效。E64(一種半胱氨酸肽酶抑制酶)無效；但是，需鈣蛋白酶對生長的抑制效果，及亮抑蛋白酶肽和APMS(氨肽酶M)(非半胱氨酸特異的抑制劑)的中間抑制作用表明半胱氨酸肽酶可能有非常重要的作用。胃蛋白酶抑制劑對天冬氨酰肽酶抑制無效，這與現(xiàn)有的文獻(xiàn)是一致的。本實(shí)驗(yàn)令人驚訝的結(jié)果是一些氨肽酶抑制劑對幼蟲生長有明顯影響。這些結(jié)果表明抑制幼蟲的氨肽酶是有效的。L-巰基亮氨酸，EDTA(乙二胺四乙酸、1，10-菲咯啉、苯丁抑制素、氨肽酶抑制劑、Leuhistin和放線酰胺素為有效的生長抑制劑。而抑制劑二肽氨肽酶(DiprotinA)和蛋氨酸氨肽酶(Ebalactone)無效。實(shí)施例2肽酶抑制劑聯(lián)用對綿羊麗蠅(L.cuprina；Diptera)幼蟲的生長和存活的影響(a)結(jié)合絲氨酸和絲氨酸氨基肽酶抑制劑聯(lián)用的方法。實(shí)施例1概述的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，將類胰蛋白酶的酶和/或氨肽酶的抑制劑聯(lián)用可能有加性或協(xié)同增強(qiáng)效果。應(yīng)用前述的方法進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)這種可能性。結(jié)果示于表2.1表2.1抑制劑聯(lián)用及其在離體試驗(yàn)下對一齡幼蟲生長和存活的影響將SBTI和亮抑蛋白酶肽或Pefabloc聯(lián)用沒有明顯效果。SBTI和EDTA聯(lián)用時(shí)有中等的效果。SBTI和TLCK或L-巰基亮氨酸聯(lián)用時(shí)抑制作用較大。這些結(jié)果表明類胰蛋白酶的肽酶的和氨肽酶的多重抑制對幼蟲能產(chǎn)生有效的抑制作用。(b)一種絲氨酸肽酶抑制劑(SBTI)和一種氨肽酶抑制劑(L-巰基亮氨酸)聯(lián)用對抑制L.cuprina幼蟲生長的效果的研究在某一濃度范圍內(nèi)研究了SBTI和L-巰基亮氨酸抑制劑結(jié)合使用時(shí)幼蟲生長的影響，以調(diào)查協(xié)同抑制作用發(fā)生的可能性。在嚴(yán)重致死前結(jié)束這一實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表2.2。表2.2抑制劑SBTI和L-巰基亮氨酸(L-leu)聯(lián)用時(shí)對幼蟲生長的抑制作用</tables>*這些聯(lián)用反應(yīng)進(jìn)一步證實(shí)了Cornell所定義的協(xié)同作用(1981，P24)(c)研究聯(lián)用2種氨肽酶抑制劑(EDTA和L-巰基亮氨酸)對L.cuprina幼蟲的生長的效果。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表2.3表2.3EDTA和L-leu聯(lián)用</tables>實(shí)施例3肽酶抑制劑對綿羊麗蠅(L.cuprina；Diptera)和Heliothispunctigens的卵孵化的影響下述實(shí)驗(yàn)用于評價(jià)本發(fā)明的組合物能否通過抑制卵孵化而起到殺蟲作用。將綿羊麗蠅的卵置于多片肝(0.9g)上，然后將肝片放入24孔組織培養(yǎng)板的各個(gè)孔中。將含有指定濃度抑制劑的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1ml)加到每個(gè)小孔中，每一小孔中有30個(gè)新放置的消毒過的綿羊麗蠅的卵。然后將培養(yǎng)板保持在35℃下無菌環(huán)境中24小時(shí)，計(jì)算孵化的百分率。在24孔組織培養(yǎng)板內(nèi)(2枚卵/孔)，用指定培養(yǎng)基(酪蛋白3g，麥芽3g，蔗糖5g，瓊脂2.25g，復(fù)合維生素B片劑5mg，連同青霉素和鏈霉素溶于80ml磷酸鹽緩沖液中)培養(yǎng)Heliothis的卵。于27℃溫育3天后計(jì)算卵孵化情況。結(jié)果見表3.1。表3.1離體條件下酶抑制劑對綿羊麗蠅(L·cuprina)卵孵化率的影響</tables>在最初的體外實(shí)驗(yàn)中，含0.17mMSBTI和5mM放線酰胺素混合物中10枚Heliothis的卵未孵化，而對照的10枚卵都孵化了。實(shí)施例4本發(fā)明對喂飼人工食物的棉蚜(Heliothispunctigens，Lepidoptera)幼蟲的生長和存活的影響如下制備人工食物菜豆(HaricotBeans)468克(g)麥芽100g酵母70g維生素C70gParaben44g山梨酸2.2g瓊脂28g水800ml*磷酸和丙酸4ml*磷酸和丙酸儲備液含29ml丙酸21ml正磷酸270ml蒸餾水總體積500ml1、菜豆(Haricotbeans)于微波爐中煮40分鐘。2、向熱水中加入瓊脂并于熱的平臺上攪拌至幾乎沸騰。3、將菜豆、瓊脂混合物、酵母和麥芽于電動混勻器中混合3分鐘。4、溫度降至60℃時(shí)，加入酸并與培養(yǎng)基混勻。5、將指定濃度的抑制劑溶液或等量的水加入到消毒過的玻璃管中。用消毒的10ml注射器向每管(1.5ml)加入人工培養(yǎng)基。將Heliothispunctigens的一齡幼蟲(每管1條幼蟲)置于玻璃管并加蓋。25℃下將這些管保溫10天。再將管置于-70℃24小時(shí)凍死幼蟲，各自稱重。與對照幼蟲比較來計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù)。結(jié)果見表4.1表4.1以含或不含抑制劑的人工食物喂飼Helothispunctigens幼蟲的生長情況</tables>實(shí)施例5肽酶抑制劑對貓?jiān)?Ctenocephalidesfelis；蚤目Siphonaptera)的生長和存活的影響從5歲的已有18個(gè)月未用外寄生藥劑處理的美利奴羊的頸靜脈取血。將血收集到一個(gè)盛有0.8ml肝素的100ml塑料瓶中并保持在4℃。預(yù)先稱重抑制劑，然后加入到5ml的無菌塑料瓶中，再加入4.5ml血液。樣品混合后，置于-70℃24小時(shí)，再冷凍干燥。冷凍干燥的樣品以63微米的不銹鋼篩過篩，再加到無菌的5ml塑料瓶中(0.15g/每瓶)。每瓶放入4枚蚤卵，瓶子上端用橡皮筋將一張面巾紙?jiān)谄靠?。培養(yǎng)瓶于25℃、70-80％相對溫度下保溫6天。然后向每瓶加入蛭石，為蚤化蛹提供支持介質(zhì)。再于25℃、70-80％相對溫度下保溫10天。對10個(gè)對照瓶和每一處理的3個(gè)瓶進(jìn)行測試。保溫期結(jié)束時(shí)將培養(yǎng)瓶置于-20℃下24小時(shí)以殺死蚤。對孵化的卵數(shù)目和生活史的階段進(jìn)行記錄。結(jié)果見表5.1表5.1干血食物中蚤卵的發(fā)育(16天)處理發(fā)育至蛹化的蚤的百分?jǐn)?shù)對照97.5EDTA1.5625mg3.125mg6.25mg000Actinonin1.40mg2.80mg016.8Leupeptin1.70mg3.40mg00SBTI5.0mg10.0mg00Pefabloc1.10mg2.20mg00EDTA1.5625mg&SBTI5mg0EDTA3.125mg&SBTI5mg0</table>實(shí)施例6肽酶抑制劑對以自然食物喂飼的黑蟋蟀(Teleogrylluscommodus，直翅目)幼蟲存活的影響(i)抑制劑和對照溶液儲備液按表6.1制備為水溶液或懸浮液。(ii)從一齡若蟲開始研究死亡率。(iii)將卷心菜葉片(5×8mm直徑葉片/每一處理)涂上抑制劑或?qū)φ諆湟?00μl并晾干。將葉片單個(gè)置于40mm平皿中，并同時(shí)放一濕棉毛墊供給水分和一塊有溝的塑料片作為遮蔽物。(iv)在每一葉片放置10條若蟲，并把培養(yǎng)皿置于25℃保溫。(v)每天計(jì)算死亡率并移走死去的個(gè)體。結(jié)果見表6.1表6.17天后各種抑制劑對黑蟋蟀幼蟲死亡率的影響</tables>*無/低，10-20％死亡率/中，21-40％死亡率/高41-100％死亡率。實(shí)施例7肽酶抑制劑對綿羊虱(Bovicolaovis；Anoplura)的生長和存活的影響在澳大利亞和很多其他國家綿羊虱是一種主要的農(nóng)業(yè)害蟲，這類昆蟲的一些品系正在對有機(jī)磷和合成的擬除蟲菊酯形成強(qiáng)的抗性。本次實(shí)驗(yàn)是為(i)拓寬對本發(fā)明有用的抑制劑的生長抑制或殺蟲活性的評價(jià)；和(ii)評價(jià)本發(fā)明對已知能抗高濃度殺蟲劑的昆蟲品系的生長抑制或殺蟲活性。所選虱的品系是稱作Hartley的參考品系。它對合成的擬除蟲菊酯有很強(qiáng)的抗性(表7.1，LevotGW.，“澳大利亞畜牧獸醫(yī)雜志”(Aust.VetJ.)，199269120)。(i)從嚴(yán)重感染虱的綿羊身上剪下一小塊面積的羊毛，再用棉布在剪過毛的地方覆蓋1分鐘以收集虱。將棉布上的虱刷到一容器中。(ii)將抑制劑的溶液或懸浮液狀的儲備液施于從最接近皮膚的40mm處剪下的幾簇羊毛。提供虱的羊已有2年未用殺蟲劑處理，在剪毛時(shí)其毛平均長度為100mm。(iii)為防止交叉感染，將毛樣品一式四份，浸入到抑制劑的水溶液或懸浮液中進(jìn)行處理，除去水份并在空氣中干燥24小時(shí)。(iv)將羊毛樣品放入帶標(biāo)簽的加蓋塑料瓶中。(v)使虱爬過紙張離開光源(作為生活力測試)，并向每管的羊毛中放入成蟲、三齡幼蟲、二齡幼蟲和一齡幼蟲各10只虱。(vi)將管于35℃，60-80％相對濕度條件下保溫，并每天進(jìn)行觀察。(vii)以假定觸碰虱時(shí)不能活動作為死亡標(biāo)準(zhǔn)來評定存活率。結(jié)果見表7.1表7.1在35℃保溫24小時(shí)后生長在抑制劑處理過的羊毛上的活虱數(shù)目</tables>表7.2所試驗(yàn)的虱對殺蟲劑的抗性特征</tables>本發(fā)明的組合物對抗殺蟲劑的綿羊虱有很好的效果。實(shí)施例8肽酶抑制劑對豆象(Triboliumcastaneum；鞘翅目)的生長和存活的影響用由有機(jī)小麥制得的清潔、磨碎并篩過的粗面粉培養(yǎng)昆蟲。將裝有預(yù)先稱重物質(zhì)的各瓶中的抑制劑與面粉干拌，并以少量水中洗瓶中殘留的抑制劑。將沖洗的水份加到面粉中并將混合物重新研磨。浸漬的面粉被轉(zhuǎn)移到一個(gè)20ml的瓶中并搖動和顛倒使完全混勻。讓T.castaneum的成蟲在面粉上產(chǎn)卵，將卵從面粉中篩出并用一根毛發(fā)將卵一個(gè)個(gè)轉(zhuǎn)移到盛有少量面粉的微孔管，管內(nèi)裝少量面粉。每一處理水平用32孔，并做三個(gè)平行樣。培養(yǎng)物于30℃和55％相對濕度下保溫。6天后將每一重復(fù)的32孔合在一起，對幼蟲計(jì)數(shù)并將數(shù)目與對照處理(無抑制劑)中的數(shù)目進(jìn)行比較。如果明顯小于參照幼蟲則將幼蟲歸類為“小的”，或者，如果觀察到異常的行為或狀態(tài)(如扭曲的或被扭曲的幼蟲)則將幼蟲歸類為“異常的”。實(shí)驗(yàn)的抑制劑和劑量等級同實(shí)施例4中所使用的一致。結(jié)果(第6天)-在第6天卵的孵化受到的影響情況是不一致的。-在所有劑量水平的放線酰胺素和EDTA的作用下的幼蟲都被歸類為“小的”，但在以1，10-菲咯啉和其他處理下，幼蟲是正常的。實(shí)施例9肽酶抑制劑對谷物儲藏害蟲鋸谷盜(Oryzaephylussurinamensis；鞘翅目)的生長和存活的影響除了保溫是在32.5℃和70％相對溫度下進(jìn)行外，對這種昆蟲的生物測試方法同所述的T.castaneum的方法一樣。8天后將昆蟲從面粉中篩出并稱重。結(jié)果見表9.1表9.1鋸谷盜(O.surinamensis)幼蟲體重減少的百分?jǐn)?shù)</tables></tables>*相對于未處理幼蟲的生長情況對各氨肽酶抑制劑的反應(yīng)是不同的。1，10-菲咯啉為高效的生長抑制劑，EDTA為中等效果的，貝他定(bestatin)無效。顯而易見，對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說，雖然為達(dá)到清楚和理解的目的而對本發(fā)明進(jìn)行了一些詳細(xì)的描述，但仍可在不超出本說明書所說明的發(fā)明范圍的前提下，對文中所述的發(fā)明具體實(shí)施和方法進(jìn)行各種修改和變更。文中所引用的參考文獻(xiàn)在后面幾頁列出，并入此文中。參考文獻(xiàn)AhmadZ.，SaleemuddinM.和Siddigi“昆蟲生物化學(xué)”(InsectBiochemistry)19766501-505。AhmadZ.，SaleemuddinM.和Siddigi“昆蟲生物化學(xué)”(InsectBiochemistry)198010667-673。Anon參見“殺蟲劑指南”(ThePesticideManual)，TomlinC.編，RoyalSoc.ofChemistry/BCPCCropProtectionPublication，Bath出版社，英國Bath(1994)。Applebaum“消化生物化學(xué)”(BiochemistryofDigestion)參見“比較昆蟲生理學(xué)，生物化學(xué)和藥理學(xué)”(ComparativeInsectPhysiology，BiochemistryandPharmacology)(KerkutG.A.和GilbertL.I.編)。1985279-300。Permagon出版社，倫敦。BarrettA.J.“酶學(xué)方法”(MethodsinEnzymology)，19942441-15。BloodD.C.和StuddertA.參見“Bailliere綜合獸醫(yī)詞典”(BaillieeComprehensiveVeterinaryDictionary)。BaillieveTindall。悉尼。1988p889。BowlesV.M.，F(xiàn)eehanJ.P.和SandemanR.M.“國際寄生蟲學(xué)雜志”(InternationalJournalforparasitology)，199020169-174。BroadwayR.M.“化學(xué)生態(tài)雜志”(J.Chem.Ecol)，1989152101-2113。BroadwayR.M.和DuffeyS.A.“昆蟲生理學(xué)雜志”(JournalofInsectPhysiology)，1986341111-1117。BurgessE.P.J.，MainC.A.，StevensP.S.，ChristellerJ.T.，GatehouseA.M.R和LaingW.A.“昆蟲生理學(xué)雜志”(JournalofInsectPhysiology)，199440803-814。ChristellerJ.T.，LaingW.T.，ShawB.D.和BurgessE.P.J.“昆蟲生物化學(xué)”(InsetctBiochemistry)，199020157-164。ChristellerJ.T.，GatehouseA.M.R和LaingW.A.“昆蟲生物化學(xué)和分子生物學(xué)”(InsectBiochemistryandMolecularBiology)，199424103-109。ChristellerJ.T.，LaingW.A.，MarkwickN.P.，BurgessE.P.J.“昆蟲生物化學(xué)和分子生物學(xué)”(InsectBiochemistryandMolecularBiology)，199222735-746。ChristellerJ.T.，ShawB.D.，GardinerS.E.和DymockJ.“昆蟲生物化學(xué)”(InsectBiochemistry)，198919221-231。CohenA.C.“昆蟲生理學(xué)”(JournalofInsectPhysiology)，199339823-829。CornellJ.A.參見“概率和數(shù)理統(tǒng)計(jì)中的Wiley級數(shù)”(WileySeriesinProbabilityandMathematicalStatistics)，JohnWiley和SonsInc.USA。CzaplaT.H.(1993)“PioneerHybrid國際專利(PCT)申請”(PioneerHybridInternationalPatent(PCT)ApplicationUS94/00630PublicationNo.WO94/16565。DeloachJ.R.和SpatesG.“經(jīng)濟(jì)昆蟲雜志”(JournalofEconomicEntomology)，198073590-594。DowJ.A.T.“昆蟲生理學(xué)進(jìn)展”(AdvancesinInsectPhysiology)，198619187-328。DymockJ.J.，LaingW.A.，ShawB.D.，GatehouseA.M.R.，ChristellerJ.T.“新西蘭動物學(xué)雜志”(NewZealandJournalofZoology)，199219123-131。EguchiM.和IwamotoA.“昆蟲生物化學(xué)”(InsectBiochemistry)，19766491-496。EguchiM.和KuriyamaK.“生物化學(xué)雜志”(JournalofBiochemistry)，1986971437-1445。FerreiraC.，CapellaA.N.，SitnikR.和TerraW.R.“昆蟲生物化學(xué)和生理學(xué)文獻(xiàn)”(ArchivesofInsectBiochemistryandPhysiology)，199426299-313。FerreiraC.和TerraW.R.“生物化學(xué)和生物物理文獻(xiàn)”(ArchBiochemBiophys.)，1986244478-485。GatehouseA.M.R.和BoulterD.“食品科學(xué)和農(nóng)學(xué)雜志”(JournalofFoodScienceandAgriculture)，198334345-350。HilderV.A.，GatehouseA.M.R.，SheermanS.E.，BarkerR.F.和BoulterD.“自然”(Nature)，1987330160-163。HinesM.E.，NielsonS.S，ShadeR.E.和PomeroyM.A.“昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用”(EntomologiaExp.Appl.)，199057201-207。HousemanJ.G.，PhilogeneB.J.R.和DowneA.E.R.“加拿大動物學(xué)雜志”(CanadianJournalofZoology)，198967864-868。IshaayaI.，MooreI.和JosephD.“昆蟲生理學(xué)雜志”(J.InsectPhysiology)，197117945-943。“國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會”(IUBMC)(InternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology)參見酶命名法(EnzymeNomenclature)1992(WebbE.C.編)。學(xué)術(shù)出版社，AcademicPressInc.，Orlando，F(xiàn)loridaJungreisA.M.參見“昆蟲生理學(xué)進(jìn)展”(AdvancesinInsectPhysiology)(TreherneJ.E.，BerridgeM.J.和WigglesworthV.B.編)1979PP193-183。AcademicPress，London.LarocqueA.M.和HousemanJ.G.“昆蟲生理學(xué)雜志”(JournalofInsectPhysiology)，199036691697。LacadetM.M.和DedonderR.“化學(xué)生物學(xué)協(xié)會公報(bào)”(Bull.Soc.Chim.Biol.)，196648631-660。LenzC.J.，KangJ.S.，RiceW.C.，McIntoshA.H.，ChippendaleG.M.和SchubertK.R.“昆蟲生物化學(xué)和生理學(xué)文獻(xiàn)”(ArchievesofInsectBiochemistryandPhysiology)，199116201-212。LiangC.，BrookhartG.，F(xiàn)engG.H.，BeekG.R.和KramerK.J.“遠(yuǎn)東生物科學(xué)通訊”(FEBSLetters)，1991278139-142。MacIntoshS.C.，KishoreG.M.，PerlackF.J.，MarroneP.G.，StoneT.B.，SimsS.R.和FuchsR.L“農(nóng)學(xué)和食品化學(xué)雜志”(JournalofAgricultureandFoodChemistry)，199031145-1151。McDonaldJ.K.“組織化學(xué)雜志”(HistochemicalJournal)，198517773-785。McGhieT.K，ChristellerJ.T.，F(xiàn)ordR.和AllsopP.G.“昆蟲生化和生理學(xué)文獻(xiàn)”(ArchivesofInsectBiochemistryandPhysiology)，199528351-363。MillerJ.W.，KramerK.J.和JawJ.H.“比較生化和生理學(xué)”(ComparativeBiochemistryandPhysiology)，197448B117-129。MohamedB.B.H.和AttiasJ.“昆蟲生物化學(xué)”(InsectBiochemistry)，198717653-658MullensB.A.和RodriguezJ.L.“經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志”(JournalofEcon.Entomology)，199285137-143。OrrG.L.，SricklandJ.A.和WalshT.A.“昆蟲生理學(xué)雜志”(JournalofInsectPhysiology)，40893-900。PrakashI.“昆蟲”(Entomon.，)，19921715-19。PritchettD.W.，YoungS.Y.和GerenC.R.“昆蟲生物化學(xué)”(InsectBiochemistry)，198111523-526。ProwningR.F.和IrzykiewiczH.“昆蟲生理學(xué)雜志”(JournalofInsectPhysiology)，19628275-284。SakalE.，ApplebauumS.W.和BirkY.“國際蛋白質(zhì)研究雜志”(InternationalJournalofProteinResearch)，198934498-505。SamuelsR.I.，CharnleyA.K.和ReynoldsS.E.“昆蟲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án)利要求42中的生物，該生物既表達(dá)一種氨肽酶抑制劑或一種金屬肽酶抑制劑，也表達(dá)一種非牢固螯合的肽酶抑制劑。44.權(quán)利要求42的生物，該生物表達(dá)一種氨肽酶抑制劑或一種金屬肽酶抑制劑。45.權(quán)利要求42的生物，該生物表達(dá)一種非牢固螯合的肽酶抑制劑。46.權(quán)利要求42-45的任意一項(xiàng)中的生物，其中所述生物棲息在易被所述昆蟲侵?jǐn)_的植物或動物體上，或者其體內(nèi)。47.權(quán)利要求46的生物，其中所述生物和所述動物或植物共生或共棲。48.權(quán)利要求46或47的生物，該生物選自芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和分枝桿菌屬(Mycobacterium)。49.一種控制昆蟲的方法，包括按權(quán)利要求44，將轉(zhuǎn)基因生物暴露給一種非牢固螯合的抑制劑的步驟。50.一種控制昆蟲的方法，包括按權(quán)利要求45，將生物暴露給一種氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑的步驟。51.一種控制昆蟲的方法，包括按權(quán)利要求42-49的任意一項(xiàng)，將轉(zhuǎn)基因生物暴露給權(quán)利要求1-34的任意一項(xiàng)中的組合物的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及組合物以及應(yīng)用它控制昆蟲的方法。該組合物含有氨肽酶抑制劑或金屬肽酶抑制劑，還含有一種非牢固螯合的肽酶抑制劑。優(yōu)選該組合物局部施用，并且優(yōu)選引起昆蟲卵孵化受抑制和/或昆蟲幼蟲的發(fā)育受抑制和/或昆蟲幼蟲死亡。文檔編號A01N43/36GK1158551SQ95194621公開日1997年9月3日申請日期1995年6月15日優(yōu)先權(quán)日1994年6月17日發(fā)明者本杰明·J·里德,理查德·M·桑德曼,戴維·S·錢德勒申請人:拉·特羅比大學(xué),紐法姆有限公司