專利名稱:一種馬比木的快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)，具體地說是一種馬比木的組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
植物是藥物的天然寶庫，人們利用藥用植物的歷史源遠流長，全世界約有75%的人口以植物作為治療預(yù)防疾病的藥物來源(邢建民，2001)。人類已經(jīng)從植物中發(fā)現(xiàn)了許多具有高度生理活性的藥物，目前從植物來源的藥物占藥物總量的25%以上(鄭光植，1987)。我國的傳統(tǒng)中草藥已有數(shù)千年的歷史，至今仍在我國和許多國家和地區(qū)廣為使用。但由于傳統(tǒng)的中草藥獲取方法是以采集和消耗大量的野生植物資源為代價的，當采集和消耗量超過自然資源的再生能力時，必然會導致物種的瀕危甚至滅絕。同時隨著自然生態(tài)環(huán) 境的日益破壞，也進一步導致藥用植物資源的匱乏。生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展為從根本上改變傳統(tǒng)藥材的生產(chǎn)提供了一個嶄新的方法，植物組織和細胞培養(yǎng)技術(shù)則是其中一個重要的手段。我國自1964年羅士韋教授首先報道了人參組織培養(yǎng)獲得成功的研究成果以來，許多科學家先后從事了多種藥用植物的組織培養(yǎng)研究。至今，我國藥用植物的組織培養(yǎng)研究迅速發(fā)展。目前，世界各國對植物的藥用開發(fā)和研究都十分重視，就以美國來說，其成藥中有47%是以植物為原料制成的(謝啟昆，1986)。為了解決藥用植物的供需矛盾，人們采用人工栽培的方法擴大藥源。但在人工栽培的藥用植物中，有不少名貴藥材等生產(chǎn)周期較長，如人參、黃連，如果以常規(guī)方法育種或育苗，需要花費很長的時間；另有一些藥用植物如貝母、番紅花等，因繁殖系數(shù)小、耗種量大，導致育種速度很慢，生產(chǎn)成本增加。利用植物的有性繁殖方式對其有效成分含量波動比較大，所以利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)解決藥用植物的植株再生與繁殖問題迫在眉睫。近年來，國內(nèi)外在這方面已做了大量工作，已成功離體培養(yǎng)獲得試管植株的藥用植物至少有200種，如云南黑節(jié)草、延齡草、高山紅景天、莪術(shù)、水母雪蓮、星花繡線菊、溪黃草、玉葉金花、遼東榴木等；其中包括一些具有抗癌有效成分的珍稀植物，如紅豆杉、馬比木、黃楊、大戟屬植物、長春花、米仔蘭、七葉一枝花、狗牙花和香榧等。
馬比木，又名公黃珠子、追風傘，屬于茶茱萸科植物，多年生矮灌木，高2-3 (-10)m。枝有棱，被短柔毛，后變無毛，芽被柔毛。葉互生或枝上部近對生；葉柄長l-3cm，上面具寬深精，槽里被糙伏毛；葉片長圓形或倒披針形，長7-24cm，寬2-4. 5cm,先端長漸尖，基部楔形，全緣，上面暗綠色，具光澤；中脈下凹，側(cè)脈6-7對，弧曲上升，遠離葉緣處網(wǎng)結(jié)。花兩性或雜性，聚傘花序頂生，長約7cm，總梗、分枝、花序軸通常扁平，被粗伏毛，花梗長l-2mm ；花萼綠色，鐘形，長約2mm，外面稀被粗伏毛，5裂齒，裂齒三角形；花瓣黃色，線形，反卷，長約7mm,寬約2mm ;雄蕊5,長約5mm,花絲長4_5mm,基部稍粗,花藥卵形；子房近球形，被長硬毛，花柱綠色，長約2mm，柱頭頭狀；花盤肉質(zhì)，具不整齊裂片或深圓齒，里面疏被長硬毛，果時宿存。核果橢圓形，稍扁，幼果綠色，轉(zhuǎn)黃色，熟時為紅色，長l_2cm，徑O. 6-0. 8cm，先端明顯具鱗臍，有萼宿存?；ㄆ?-6月，果期6-8月。生態(tài)環(huán)境生于海拔(150) 450- (2500)m的林中。資源分布分布于甘肅、湖北、湖南、廣東、海南、廣西、四川、貴州等地。[0004]馬比木根皮中含有喜樹堿及喜樹堿的甲氧基衍生物，其有效成分是喜樹果的三倍以上，喜樹堿的含量達到了 0.8%。馬比木種子很難發(fā)芽，野生馬比木主要以根莖芽繁殖，另外野生馬比木在根皮中含量不穩(wěn)定，其有效成分含量與野生馬比木的生長年限有關(guān)，一般在10年以上的野生馬比木含量較一致。所以以野生馬比木的提取會造成資源枯竭，還有造成其喜樹堿的產(chǎn)量不穩(wěn)定。公開號為CN102071233A的中國專利公開了一種人工誘導臭馬比木內(nèi)生菌合成喜樹堿的技術(shù)方法，將臭馬比木未成熟的細胞按照接種量為50-200g/L濕重的比例，置于添加了 50-80ymol/L的生長調(diào)節(jié)劑萘乙酸(N AA)或5-10 μ mol/L芐氨基嘌呤(BA)的MS基本培養(yǎng)基中，在25-30°C中培養(yǎng)；在細胞指數(shù)生長初期，加入濃度為1-2000 μ mol/L的非生物誘導劑和20_50g/L的蔗糖或葡萄糖；在細胞指數(shù)生長中期，再加入濃度為1-2000 μ mol/L的非生物誘導劑。該發(fā)明雖利用了富含喜樹堿的植物臭馬比木，通過人工誘導，組織培養(yǎng)的方法實現(xiàn)喜樹堿的合成，在一定程度上可提高喜樹堿的產(chǎn)量，由于喜樹堿在其根皮中長期積累所致，所以很難工業(yè)化生產(chǎn)。
因此，為了滿足日益增大的藥用需求，種子收獲量小，種子繁殖出苗率極低，種子培育過程煩瑣，生長速度慢，同時保護馬比木的野生資源，利用組培快繁技術(shù)，實現(xiàn)人工栽培是最好的解決方法。
迄今為止，在國內(nèi)外尚未見關(guān)于馬比木組織培養(yǎng)快繁成功的報道。我們通過大量試驗，終于摸索出一套成熟的方法，成功實現(xiàn)了馬比木的組培快繁，可以快速培育出大量幼苗，為實現(xiàn)工業(yè)化人工栽培馬比木提供可能。馬比木的組培快繁技術(shù)方法的成功建立，可以為大規(guī)模人工栽培藥用植物馬比木提供種苗，為現(xiàn)代科技農(nóng)業(yè)提供了一種切實可行的開發(fā)項目。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供馬比木的快速繁殖方法，該方法非常適合工業(yè)化生產(chǎn)，配方效果佳，出芽率高，培養(yǎng)時間短，植株生長旺盛，可操作性強，應(yīng)用價值高等優(yōu)點。具有投入少，產(chǎn)出高的特點。
本發(fā)明所述馬比木的快速繁殖方法，其具體操作步驟如下
I)外植體的選取與滅菌選用馬比木的嫩莖上芽體作為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經(jīng)O. 1%的升汞消毒后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用；
2)芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在Ms+6-BAl. 2mg/L+IBA0. 2mg/L培養(yǎng)基上，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照12小時，光照強度1000LX，接種后10-15天芽體的萌發(fā)，30天左右形成帶葉的小苗；
3)叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉(zhuǎn)接于Ms+6-BAl. 2mg/L+IBA0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照15小時，光照強度1000LX,25天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數(shù)為5以上；
4)生根培養(yǎng)選擇Ms+6-BAO. 5mg/L+NAA I. 5mg/L作為生根培養(yǎng)基，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到95%以上，只需要30天左右形成完整植株；
5)試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土或富養(yǎng)土中，注意保水保溫保濕，移載45天，移載成活率達到92%以上。
在一個具體實施方案中，步驟I中采用O. I %升汞進行消毒，消毒時間控制優(yōu)選在12-15分鐘。
在另一個具體實施方案中，步驟5中大田移栽濕度控制在40-70%;溫度控制在20-30。。。
技術(shù)效果
(I)利用馬比木帶芽根莖段為外植體，使得外植體取材較容易，一年四季均可取材，而且數(shù)量多，采用根莖芽體做外植體，保證了遺傳穩(wěn)定性，同時克服了組織培養(yǎng)中，愈傷組織在分化培養(yǎng)基上隨著芽的分化而逐漸停止生長，失去增殖能力的弱點，可防止傷組織繼代培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，分化出來的苗出現(xiàn)變異的現(xiàn)象。
(2)本發(fā)明方法利用外植體建立，增殖生根同步化這一技術(shù)路線，僅需30天左右形成完整植株，4-6個月內(nèi)獲得大量完整植株，實現(xiàn)馬比木的大規(guī)模工廠化育苗。
·0019](3)本發(fā)明方法獲得的試管苗在移載時所采用的基質(zhì)利用沙土，方法簡單，而且大大降低了移載成本。本培養(yǎng)方法出芽快，增殖率高，方法簡單，生產(chǎn)成本低，可批量生產(chǎn)，應(yīng)用價值高。
(4)馬比木的生產(chǎn)可以在人為控制條件下進行，不受季節(jié)、氣候條件與土壤等因素的制約，可排除病蟲害的侵襲和農(nóng)藥殘留的影響，嚴格控制馬比木的質(zhì)量。增殖速度快，生產(chǎn)周期短，設(shè)備簡單，占地面積少，能節(jié)省人力、物力等，便于工廠化生產(chǎn)。
(5)使用本發(fā)明提供的組培快繁技術(shù)得到的馬比木幼苗進行人工栽培，可以得到個體差異小，品質(zhì)均一的馬比木成品。
(6)可以保存馬比木的種質(zhì)資源，同時有利于保護馬比木野生資源，減少對自然資源的破壞。
具體實施方式
下面，本發(fā)明將用實施例進行進一步的說明，但是它并不限于這些實施例的任一個或類似實例。
實施例I
取材馬比木帶腋芽莖段為外植體
I、外植體的選取與滅菌采自湖南慈利的馬比木鮮嫩芽莖段等幼嫩組織，作為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗15分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經(jīng)O. I %的升汞消毒12分鐘后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用。
2、芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在Ms+6-BAl. 2mg/L+IBA0. 2mg/L培養(yǎng)基上，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照12小時，光照強度1000LX ;接種后10天芽體的萌發(fā)，30天左右形成帶葉的小苗。
3、叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉(zhuǎn)接于Ms+6-BAl. 2mg/L+IBA0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照15小時，光照強度1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數(shù)為5以上。
4、生根培養(yǎng)選擇Ms+6-BAO. 5mg/L+NAA I. 5mg / L作為生根培養(yǎng)基，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到95%以上，只需要30天左右形成完整植株。
5、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土中，濕度控制在60% ;溫度控制在25°C，移載45天后，移載成活率達到96%以上。
實施例2
取材馬比木帶腋芽莖段為外植體
I、外植體的選取與滅菌采自湖南慈利的馬比木鮮嫩芽莖段等幼嫩組織，作為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經(jīng)O. I %的升汞消毒15分鐘后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用。
2、芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在Ms+6-BAl. 2mg/L+IBA0. 2mg/L培養(yǎng)基 上，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX ;接種后15天芽體的萌發(fā)，30天左右形成帶葉的小苗。
3、叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉(zhuǎn)接于Ms+6-BAl. 2mg/L+IBA0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照15小時，光照強度1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數(shù)為5以上。
4、生根培養(yǎng)選擇Ms+6-BAO. 5mg/L+ NAA1. 5mg / L作為生根培養(yǎng)基，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到95%以上，只需要30天左右形成完整植株。
5、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土中，濕度控制在50% ;溫度控制在28°C，移載45天后，移載成活率達到94%以上。
實施例3
取材馬比木帶腋芽莖段為外植體
I、外植體的選取與滅菌采自湖南桑植的馬比木鮮嫩芽莖段等幼嫩組織，作為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經(jīng)O. I %的升汞消毒13分鐘后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用。
2、芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在Ms+6-BAl. 2mg/L+IBA0. 2mg/L培養(yǎng)基上，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX ;接種后12天芽體的萌發(fā)，30天左右形成帶葉的小苗。
3、叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉(zhuǎn)接于Ms+6-BAl. 2mg/L+IB0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照15小時，光照強度1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數(shù)為5以上。
4、生根培養(yǎng)選擇Ms+6-BAO. 5mg/L +NAA1. 5mg / L作為生根培養(yǎng)基，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到95%以上，只需要30天左右形成完整植株。
5、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土中，濕度控制在70% ;溫度控制在20°C，移載45天，移載成活率達到93%以上。
權(quán)利要求
1.一種馬比木的快速繁殖方法，其具體操作步驟如下 1)外植體的選取與滅菌選用馬比木的嫩莖上芽體作為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經(jīng)0. 1%的升汞消毒后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用； 2)芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在Ms+6-BAl.2mg/L+IBA0. 2mg/L培養(yǎng)基上，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照12小時，光照強度1000LX，接種后10-15天芽體的萌發(fā)，30天左右形成帶葉的小苗； 3)叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉(zhuǎn)接于Ms+6-BAl.2mg/L+IBA0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照15小時，光照強度1000LX，25天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數(shù)為5以上； 4)生根培養(yǎng)選擇Ms+6-BA0.5mg/L+NAA I. 5mg/L作為生根培養(yǎng)基，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度25-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到95%以上，只需要30天左右形成完整植株； 5)試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土或富養(yǎng)土中，注意保水保溫保濕，移載45天，移載成活率達到93%以上。
2.權(quán)利要求
I的方法，步驟I中采用0.I %升汞進行消毒，消毒時間控制優(yōu)選在12-15分鐘。
3.權(quán)利要求
2的方法，步驟5中大田移栽濕度控制在40-70%;溫度控制在20-30°C。
專利摘要
本發(fā)明為一種馬比木的快速繁殖方法，該方法是在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)帶嫩芽段等組織，確切取帶1-2個芽的嫩芽莖段為外植體，消毒后，接種在MS+6-BA1.2mg/L+IBA0.2mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種后10-15天左右芽體的萌發(fā)，30天左右形成帶葉的小苗，將小苗切下轉(zhuǎn)接于MS+6-BA1.2mg/L+IBA0.4mg/L培養(yǎng)基上，以保持高速度遞增，增殖系數(shù)為5以上。選擇MS+6-BA0.5mg/L+NAA1.5mg／L作為生根培養(yǎng)基，生根率達到95%以上，只需要30天左右形成完整植株。試管苗移載到沙土中，注意保水保濕，移載45天后，移載成活率達到93%以上，建立了一套高頻穩(wěn)定再生體系。本發(fā)明方法具有穩(wěn)定好，操作簡便，繁殖速度快，生產(chǎn)成本低，達到產(chǎn)業(yè)化水平等優(yōu)點。
文檔編號A01H4/00GKCN102948370SQ201210535348
公開日2013年3月6日 申請日期2012年12月13日
發(fā)明者向華 申請人:向華導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan