專(zhuān)利名稱(chēng):生產(chǎn)雄性不育植物的方法
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發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種通過(guò)基因操作生產(chǎn)雄性不育植物的方法。
現(xiàn)有技術(shù)芽胞桿菌RNA酶是一種從解淀粉芽孢桿菌中得到的RNA酶(參見(jiàn)S.Nishimura和M.Nomura，生化及生物物理學(xué)學(xué)報(bào).30430-431(1958)；R.W.Hartley，分子生物學(xué)雜志.202913-915(1988))。這種酶有110個(gè)氨基酸殘基，可催化RNA的水解。在細(xì)胞中表達(dá)后，由于其有效的RNA酶活性，該酶可抑制細(xì)胞的功能，并因此在多數(shù)情況下導(dǎo)致細(xì)胞死亡。通過(guò)利用這一特征，可以設(shè)想將芽孢桿菌RNA酶基因在植物的某一特定位點(diǎn)表達(dá)，將有可能選擇性調(diào)節(jié)該位點(diǎn)的功能。
PCT WO89/10396公開(kāi)了一種可以獲得雄性不育植物的技術(shù)，該技術(shù)是通過(guò)將上述芽孢桿菌RNA酶基因連接到一種花藥絨氈層細(xì)胞特異性表達(dá)啟動(dòng)子的下游，從而構(gòu)建成雄性不育基因，然后將以這種手段獲得的基因轉(zhuǎn)入植物。這種雄性不育技術(shù)對(duì)于有效地開(kāi)發(fā)F1代雜種是非常有用的。
但是，當(dāng)利用芽孢桿菌RNA酶基因作為雄性不育基因后，發(fā)現(xiàn)據(jù)此獲得的雄性不育轉(zhuǎn)基因植物常常表現(xiàn)出一些不令人滿(mǎn)意的性狀。PCTWO96/26283提到這一問(wèn)題在水稻中的存在。還有報(bào)道在萵苣中觀察到類(lèi)似的現(xiàn)象(科學(xué)園藝.55125-139(1993)；Arlette Reymaerts，Hilde Van de Wiele，Greta De Ssutter，Jan Janssens工程化基因?qū)τ缘目刂萍捌湓陔s交種生產(chǎn)中的應(yīng)用)。根據(jù)這一報(bào)道，將一種雄性不育基因，該基因包括一個(gè)來(lái)源于煙草的花藥特異性啟動(dòng)子(TA29)，和一個(gè)芽孢桿菌RNA酶基因，轉(zhuǎn)入萵苣后，產(chǎn)生了生活力下降的植物。
雖然迄今為止，造成這種現(xiàn)象的原因還不能確定，但已有推測(cè)認(rèn)為基因轉(zhuǎn)移位點(diǎn)的所謂“位置效應(yīng)”可能影響到這種作用機(jī)制(參見(jiàn)PCTWO96/26283)。更具體地，當(dāng)雄性不育基因僅限制在靶位點(diǎn)(即花藥)處表達(dá)時(shí)，可以得到所需雄性不育植物。但有這樣一種可能性，即在存在于基因轉(zhuǎn)移位點(diǎn)鄰近處的表達(dá)調(diào)節(jié)子(例如內(nèi)源增強(qiáng)子)的作用下，芽孢桿菌RNA酶基因就可能在除花藥外的組織中表達(dá)，即使是以極微量的形式。這種情況下，由于有效的酶活性作用，就可能產(chǎn)生上面描述的不令人滿(mǎn)意的性狀。
為了克服這一問(wèn)題，PCT WO96/26283公布了一種方法，該方法使用了可在除花藥外的組織中有效表達(dá)的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(后文稱(chēng)CaMV35S啟動(dòng)子)。換言之，其中使用了芽孢桿菌RNA酶抑制劑，即一種針對(duì)芽孢桿菌RNA酶的抑制性蛋白。將連接至CaMV35S啟動(dòng)子的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因同時(shí)轉(zhuǎn)入植物，然后該芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因在除花藥外的組織中組成型表達(dá)，從而消除這些組織中芽孢桿菌RNA酶的作用。
但是，以這種方法產(chǎn)生的雄性不育植物中，芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因是在植物全身表達(dá)的，包括葉片和胚乳等可食用部分。從公眾接受轉(zhuǎn)基因作物的角度來(lái)看，這種結(jié)果是不理想的，因?yàn)檠挎邨U菌RNA酶抑制劑蛋白表達(dá)在了不需要其表達(dá)的地方。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種可生產(chǎn)雄性不育植物的方法，該法獲得的植物除了是雄性不育以外，具有與未經(jīng)改造的原種相當(dāng)?shù)恼Ｐ螒B(tài)學(xué)特征。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)雄性不育植物的方法，該方法通過(guò)在植物花藥中表達(dá)一種外源的RNA酶，其中該酶在除花藥外的組織的表達(dá)被盡可能多地抑制，從而得到了與出發(fā)(即未經(jīng)改造的)植物相比，表現(xiàn)同樣正常形態(tài)學(xué)的雄性不育植物。
附圖簡(jiǎn)述
圖1是表示質(zhì)粒pTS346結(jié)構(gòu)的模型視圖，該質(zhì)粒是用來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的，其上包括從5’端向3’端方向依次排列的，一個(gè)受花藥特異性E1啟動(dòng)子控制的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因，以及一個(gè)由花藥特異性啟動(dòng)子E1片段控制的芽孢桿菌RNA酶基因。
發(fā)明詳述本發(fā)明者們獲得了兩個(gè)表現(xiàn)出改良的雄性不育株系，因?yàn)樵谒型ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)入一種遺傳構(gòu)建體而獲得的水稻雄性不育株系中，這兩個(gè)株系分別只表現(xiàn)出較小程度的形態(tài)學(xué)異常，其中所述遺傳構(gòu)建體的制備，是通過(guò)將一個(gè)芽孢桿菌RNA酶基因與一個(gè)來(lái)自水稻的花藥特異性E1啟動(dòng)子連接而成的。通過(guò)對(duì)這些株系的分析發(fā)現(xiàn)，E1啟動(dòng)子被一個(gè)大約10kb大小的轉(zhuǎn)座子分成了兩部分，該轉(zhuǎn)座子來(lái)自于在水稻轉(zhuǎn)化過(guò)程中使用的根癌農(nóng)桿菌LBA4404。根據(jù)這一情況推測(cè)，由于插入了這一10kb或更大的轉(zhuǎn)座子，E1啟動(dòng)子前部對(duì)芽孢桿菌RNA酶基因表達(dá)的作用將被減弱，因此，芽孢桿菌RNA酶基因的表達(dá)也將降低，從而使轉(zhuǎn)基因雄性不育植物的形態(tài)異常狀況得到緩解。
這一發(fā)現(xiàn)表明，在常規(guī)技術(shù)中面臨的RNA酶在花藥外組織中表達(dá)的問(wèn)題是可能解決的，其方法是先將RNA酶基因(例如芽孢桿菌RNA酶基因)連接在比全長(zhǎng)縮短了的花藥特異性啟動(dòng)子(即啟動(dòng)子片段)下游，然后將這一構(gòu)建體轉(zhuǎn)入植物基因組中。從這一角度出發(fā)，本發(fā)明者們進(jìn)行了更加深入細(xì)致的研究，先將一個(gè)芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因連接在水稻花藥特異性E1啟動(dòng)子的下游，將一個(gè)RNA酶基因連接在一個(gè)從花藥特異性啟動(dòng)子得來(lái)的片段的下游，然后用它們同時(shí)轉(zhuǎn)化植物；由此獲得一種轉(zhuǎn)基因水稻植物，其在雄性不育水稻株系的形態(tài)學(xué)上達(dá)到進(jìn)一步的改良。
因此，本發(fā)明提供了一種可生產(chǎn)雄性不育植物的方法，其特征包括將第一個(gè)啟動(dòng)子片段連接在一個(gè)RNA酶基因的上游，還包括將第二個(gè)啟動(dòng)子連接在一個(gè)RNA酶抑制劑蛋白基因的上游，該第二啟動(dòng)子與第一啟動(dòng)子相同或不同；然后將這些基因轉(zhuǎn)入植物基因組中，從而生產(chǎn)出基本上雄性不育的植物。
本發(fā)明中，RNA酶基因優(yōu)選使用芽胞桿菌RNA酶基因。芽胞桿菌RNA酶基因可以直接用于本發(fā)明中。另一方面，也可以將芽胞桿菌RNA酶基因進(jìn)行自然或人為突變，以便由此改造該基因所編碼酶的活性或其組織特異性。就本發(fā)明而言，可以使用任何一種酶基因，只要該酶在植物細(xì)胞(尤其是花藥)中能夠發(fā)揮RNA酶作用，并因此抑制這些細(xì)胞中蛋白質(zhì)的生物合成。這些酶的例子包括胰RNA酶A，米曲霉RNA酶T1，生金色鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens)的鏈霉菌RNA酶(Sarnase)(參見(jiàn)歐洲專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)053799)。
用來(lái)連接在RNA酶基因上游的啟動(dòng)子(即第一啟動(dòng)子)可以是任何一種啟動(dòng)子，只要它能夠誘導(dǎo)將在植物細(xì)胞中使用的RNA酶基因的表達(dá)。如煙草TA29啟動(dòng)子(參見(jiàn)J.Seurinck等，核酸研究.183403(1990))和擬南芥A9啟動(dòng)子(參見(jiàn)Wyatt Paul等，植物分子生物學(xué)雜志.19611-622(1992))等。優(yōu)選地，當(dāng)要生產(chǎn)某一植物的雄性不育植物時(shí)，第一啟動(dòng)子應(yīng)是一種針對(duì)該植物花藥的特異性啟動(dòng)子。就水稻而言，有一些已知的花藥特異性啟動(dòng)子，如E1啟動(dòng)子、T72啟動(dòng)子、T42啟動(dòng)子(如PCT WO92/13956所述)，Osg6B啟動(dòng)子、Osg4B啟動(dòng)子(均由T.Tsuchiya等報(bào)道，見(jiàn)植物分子生物學(xué).261737-1746(1994))等等。E1啟動(dòng)子的序列由SEQ ID NO6所示。
僅把第一啟動(dòng)子用作一個(gè)片段是十分重要的。本文中與第一啟動(dòng)子連用的術(shù)語(yǔ)“片段”指與自然存在的啟動(dòng)子序列至少有部分不同的一段序列。例如，這種片段可以是一個(gè)在3’區(qū)、內(nèi)部區(qū)域和/或5’區(qū)發(fā)生了缺失、替換或插入的啟動(dòng)子，其中包括被間插序列分為上游和下游兩個(gè)區(qū)的情況。優(yōu)選經(jīng)過(guò)缺失、替換或插入后，這一片段與自然狀態(tài)的啟動(dòng)子序列仍有最高約50％的同源性；更優(yōu)選同源性達(dá)到約70％；特別優(yōu)選同源性高達(dá)90％。所述第一啟動(dòng)子片段優(yōu)選SEQ IN NO7所示的E1啟動(dòng)子的片段。還優(yōu)選在上述序列基礎(chǔ)上通過(guò)替換、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸等改造后獲得的一段序列，只要獲得的這種序列具有與SEQ ID NO7所示片段同樣的啟動(dòng)子活性。“通過(guò)替換、缺失或插入核苷酸來(lái)改造”是指可以通過(guò)選取不超過(guò)10個(gè)核苷酸(優(yōu)選為不超過(guò)5個(gè))進(jìn)行諸如定點(diǎn)誘變等人工操作手段來(lái)完成的改造。
第一啟動(dòng)子片段以一種有功能的方式連接在RNA酶基因的上游，這里的術(shù)語(yǔ)“有功能的”，意指將該啟動(dòng)子片段連接在一個(gè)允許其誘導(dǎo)RNA酶基因表達(dá)的位置。
本發(fā)明必需使用RNA酶抑制劑蛋白基因。這種基因可以根據(jù)所使用的RNA酶基因進(jìn)行恰當(dāng)?shù)倪x擇。例如，當(dāng)RNA酶基因用的是芽胞桿菌RNA酶基因時(shí)，優(yōu)選使用芽胞桿菌RNA酶抑制劑基因作為RNA酶抑制劑蛋白基因。第二啟動(dòng)子以有功能的方式連接在RNA酶抑制劑蛋白基因的上游。第二啟動(dòng)子的作用是，誘導(dǎo)植物細(xì)胞中所用的RNA酶抑制劑蛋白基因的表達(dá)，該啟動(dòng)子既可以與第一啟動(dòng)子相同，也可以與之不同。當(dāng)?shù)诙?dòng)子與第一啟動(dòng)子相同時(shí)，也并不是總有必要以一個(gè)片段的形式使用第二啟動(dòng)子。
RNA酶基因和RNA酶抑制劑蛋白基因分別以有功能的方式與第一啟動(dòng)子片段和第二啟動(dòng)子相連接，其中RNA酶基因既可以定位于RNA酶抑制劑蛋白基因的下游，也可以定位于其上游。另外，對(duì)這些基因的間隔距離也沒(méi)有特別的限定。
至于哪些植物可按照本發(fā)明中的方法生產(chǎn)雄性不育植物，也沒(méi)有特別的限制。實(shí)例有水稻、玉米、煙草、萵苣和油菜。其中特別優(yōu)選水稻和玉米。
為了按本發(fā)明的方法將基因轉(zhuǎn)入植物基因組中以生產(chǎn)雄性不育植物，可使用農(nóng)桿菌方法、電穿孔法和粒子槍法等。農(nóng)桿菌法是優(yōu)選的。該方法的細(xì)節(jié)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員參照如在PCT WO92/13957中描述的方法適當(dāng)確定。舉例來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)下面的步驟將基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞基因組(1)準(zhǔn)備好第一啟動(dòng)子片段；(2)準(zhǔn)備好RNA酶基因；(3)將RNA酶基因以有功能的方式連接在第一啟動(dòng)子片段的下游；(4)準(zhǔn)備好第二啟動(dòng)子；(5)準(zhǔn)備好RNA酶抑制劑蛋白基因；(6)將RNA酶抑制劑蛋白基因以有功能的方式連接在第二啟動(dòng)子的下游；(7)利用限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，將已連接在第一啟動(dòng)子片段下游的RNA酶基因和已連接在第二啟動(dòng)子下游的RNA酶抑制劑蛋白基因，整合至T-DNA中；(8)將步驟(7)得到的T-DNA插入Ti質(zhì)粒；(9)如果有必要，將步驟(8)得來(lái)的Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增；(10)利用步驟(9)得到的農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，以便將已連在第一啟動(dòng)子片段下游的RNA酶基因和已連接在第二啟動(dòng)子下游的RNA酶抑制劑蛋白基因，轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的基因組中。
如此獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，可由愈傷組織培養(yǎng)開(kāi)始，再生成為完整的植物個(gè)體，具體方法參見(jiàn)如Y.Hiei等，植物學(xué)雜志6271-282(1994)。
在上述過(guò)程中，第一啟動(dòng)子片段可以通過(guò)用合適的限制性?xún)?nèi)切酶切割第一啟動(dòng)子而得到。或者，該片段也可以通過(guò)擴(kuò)增特定序列來(lái)制備，具體方法是先用合適的引物，對(duì)一個(gè)包括該第一啟動(dòng)子和RNA酶基因的質(zhì)粒進(jìn)行PCR，去掉不必要的區(qū)域，從而獲得所需序列的擴(kuò)增，見(jiàn)后文實(shí)施例。還應(yīng)當(dāng)理解的是，任何關(guān)于上述步驟(尤其是步驟(1)～(7))次序的改變或其中使用材料的變化，均屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。另外，也有可能利用含有不同T-DNA的Ti質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中一個(gè)T-DNA攜帶有已連在第一啟動(dòng)子片段下游的RNA酶基因，而另一個(gè)T-DNA攜帶有已連接在第二啟動(dòng)子下游的RNA酶抑制劑蛋白基因。再有，如果在步驟(7)的T-DNA中先提供一個(gè)選擇性標(biāo)記，就可以輕松地把帶有轉(zhuǎn)化基因的愈傷組織篩選出來(lái)。這類(lèi)標(biāo)記的實(shí)例包括將在后面實(shí)施例中使用的Bar基因，以及一種抗潮霉素(HPT)基因。不過(guò)，并不是總有必要使用選擇性標(biāo)記。轉(zhuǎn)化的成功可以根據(jù)如下事實(shí)來(lái)判定，即從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的愈傷組織再生得到的植物已表現(xiàn)為雄性不育。
本發(fā)明還提供了一種載體，該載體可以通過(guò)前面描述的農(nóng)桿菌方法，將上述基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞基因組中。該載體含有一個(gè)T-DNA，使得載體存在于被農(nóng)桿菌侵染的植物細(xì)胞中時(shí)，可將T-DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞基因組；其T-DNA上包括有i)一個(gè)啟動(dòng)子片段和一個(gè)在該啟動(dòng)子控制下表達(dá)的RNA酶基因；ii)一個(gè)與上述啟動(dòng)子相同或不同的啟動(dòng)子，以及在該第二啟動(dòng)子控制下表達(dá)的一個(gè)RNA酶抑制劑蛋白基因。優(yōu)選將包括上述遺傳元件i)和ii)的T-DNA整合到供植物轉(zhuǎn)化的Ti質(zhì)粒中，從而構(gòu)建成本發(fā)明中的載體。目前已有多種可用于植物轉(zhuǎn)化的Ti質(zhì)粒；例如，根癌農(nóng)桿菌LBA4404中攜帶的pAL4404。如果必要，本發(fā)明載體上可包括一個(gè)或多個(gè)從以下序列中挑選出的元件，這些可供選擇的元件包括在農(nóng)桿菌中擴(kuò)增所需的復(fù)制起始，分別定位于RNA酶基因和RNA酶抑制劑蛋白基因下游的終止子，和/或適合于篩選轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的標(biāo)記基因。
本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其包括i)一個(gè)啟動(dòng)子片段和一個(gè)在該啟動(dòng)子控制下表達(dá)的RNA酶基因，ii)一個(gè)與上述啟動(dòng)子相同或不同的啟動(dòng)子，以及在該啟動(dòng)子控制下表達(dá)的一個(gè)RNA酶抑制劑蛋白基因，且i)和ii)均已轉(zhuǎn)入基因組中，本發(fā)明還提供了一種由該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生得來(lái)的雄性不育植物。
本發(fā)明的效應(yīng)本發(fā)明可生產(chǎn)一種雄性不育植物，與傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的雄性不育植物相比，該植物在形態(tài)學(xué)或開(kāi)花特征上沒(méi)有表現(xiàn)或僅表現(xiàn)出較低程度的異常；其具體產(chǎn)生方法是，通過(guò)將一個(gè)芽胞桿菌RNA酶基因連接在由于缺失上游區(qū)域而降低活性的啟動(dòng)子下游，另將一個(gè)芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因連接在水稻花藥特異性啟動(dòng)子的下游，然后使這些基因一起轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞基因組中。
現(xiàn)在，參考下面的實(shí)施例詳述本發(fā)明。但不應(yīng)理解為本發(fā)明僅限于此。
實(shí)施例用質(zhì)粒pTS172(參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)Hei 10-220060)作為模版，用來(lái)擴(kuò)增已經(jīng)連接在E1啟動(dòng)子片段下游的芽胞桿菌RNA酶基因。PCR使用的引物是172del-F(參見(jiàn)SEQID NO1)和172del-R(參見(jiàn)SEQ ID NO2)，每條引物中均含有一個(gè)PstI酶切識(shí)別位點(diǎn)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將所獲得的產(chǎn)物用PstI進(jìn)行酶切。由此，得到了一段來(lái)自于pTS172的E1啟動(dòng)子片段。該片段兩端均為粘性末端，其中僅包括一段約360bp的序列，其上含有E1啟動(dòng)子的起點(diǎn)及其上游序列。按常規(guī)方法，用T4DNA連接酶將這一片段的兩個(gè)末端連接在一起，使之重新環(huán)化，得到一個(gè)新的質(zhì)粒pTS172A(參見(jiàn)SEQ ID NO3)。也就是說(shuō)，在質(zhì)粒pTS172A中，原質(zhì)粒pTS172中的約1.7kb的E1啟動(dòng)子區(qū)域已被SEQ ID NO7所示的356bp的片段所替換。
接下來(lái)，一個(gè)包括E1啟動(dòng)子(參見(jiàn)PCT WO92/13956)及與其相連的一個(gè)芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因(參見(jiàn)R.W.Hartley，分子生物學(xué)雜志.202913-915(1988))在內(nèi)的片段(參見(jiàn)SEQ ID NO4)，經(jīng)末端補(bǔ)平后整合入pTS172Δ質(zhì)粒中的PstI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pTS346(參見(jiàn)SEQ ID NO5)，圖1表示了pTS346的結(jié)構(gòu)。
用EcoRI從pTS346中切出一段5.5kb的片段，隨后將該片段插入pSB11BS(其結(jié)構(gòu)將在后文描述)的EcoRI位點(diǎn)。進(jìn)而，通過(guò)同源重組的方法把T-DNA區(qū)域整合入受體載體pSBI(參見(jiàn)T.Komari等，植物學(xué)雜志.10165-174(1996))。將由此得到的重組質(zhì)粒(pSB1346)轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，該菌被用于水稻(品種為Asanohikari)的轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒pSB11BS的構(gòu)建是通過(guò)把芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因(參見(jiàn)R.W.Hartley，分子生物學(xué)雜志.202913-915(1988))整合入中間載體pSB11(參見(jiàn)T.Komari，植物學(xué)雜志.10165-174(1996))的StuI位點(diǎn)而完成的。
利用含有上述重組質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌LBA4404，完成了對(duì)水稻(品種為Asanohikari)的轉(zhuǎn)化。雖然轉(zhuǎn)化方法基本上與Hiei等(植物學(xué)雜志.6271-282(1994))的方法相一致，但使用了膦絲菌素(濃度為10mg/L)來(lái)篩選轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)樵撔坌圆挥驑?gòu)建體中包括一個(gè)作為選擇標(biāo)記的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。
與pSB1172(參見(jiàn)于1999年8月3日提交的PCT/JP99/04167)構(gòu)建體進(jìn)行了對(duì)比，該構(gòu)建體包括一個(gè)正常長(zhǎng)度的E1啟動(dòng)子，但沒(méi)有芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因，比較結(jié)果表明，本文的轉(zhuǎn)化效率及所得轉(zhuǎn)基因植物中形態(tài)正常植物的比率都有顯著提高。結(jié)果見(jiàn)下表。
表1轉(zhuǎn)化效率
*檢測(cè)了45個(gè)株系中的38個(gè)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)雄性不育植物的方法，其包括將第一啟動(dòng)子片段連接在RNA酶基因的上游，將一個(gè)與該第一啟動(dòng)子相同或不同的第二啟動(dòng)子連接在一個(gè)RNA酶抑制劑蛋白基因的上游，然后將這些基因轉(zhuǎn)入植物基因組，并因此得到所述基本上雄性不育的植物。
2.權(quán)利要求
1的生產(chǎn)雄性不育植物的方法，其中所述RNA酶基因是芽孢桿菌RNA酶基因。
3.權(quán)利要求
1或2的生產(chǎn)雄性不育植物的方法，其中所述RNA酶抑制劑蛋白基因是芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因。
4.權(quán)利要求
1～3中任一項(xiàng)的生產(chǎn)雄性不育植物的方法，其中所述第一啟動(dòng)子和第二啟動(dòng)子均為可引起花藥特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。
5.權(quán)利要求
1～4中任一項(xiàng)的生產(chǎn)雄性不育植物的方法，其中所述第一啟動(dòng)子是SEQ ID NO6所示啟動(dòng)子的一部分。
6.權(quán)利要求
1～5中任一項(xiàng)的生產(chǎn)雄性不育植物的方法，其中所述第一啟動(dòng)子是SEQ ID NO7所示的啟動(dòng)子。
7.一種啟動(dòng)子，其包括SEQ ID NO6所示序列的一部分。
8.一種啟動(dòng)子，其包括SEQ ID NO7所示的序列，或者是由該序列經(jīng)替換、缺失或加入一個(gè)或多個(gè)核苷酸等手段改造而得到的一種序列。
9.一種包含有T-DNA的質(zhì)粒載體，該T-DNA包括i)第一啟動(dòng)子片段及一種在該啟動(dòng)子誘導(dǎo)下表達(dá)的RNA酶基因，ii)與第一啟動(dòng)子相同或不同的第二啟動(dòng)子，以及在該啟動(dòng)子誘導(dǎo)下表達(dá)的RNA酶抑制劑蛋白基因，當(dāng)該質(zhì)粒載體處于農(nóng)桿菌侵染的植物細(xì)胞中時(shí)，應(yīng)能夠?qū)⑺鯰-DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞基因組。
10.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中包括已轉(zhuǎn)入其基因組中的i)第一啟動(dòng)子片段及一種在該第一啟動(dòng)子誘導(dǎo)下表達(dá)的RNA酶基因，ii)與第一啟動(dòng)子相同或不同的第二啟動(dòng)子，以及在該第二啟動(dòng)子誘導(dǎo)下表達(dá)的RNA酶抑制劑蛋白基因；以及一種從該細(xì)胞再生得來(lái)的雄性不育植物。
專(zhuān)利摘要
一種可生產(chǎn)雄性不育植物的方法,所得雄性不育植物與原植物相比,表現(xiàn)出相似的正常形態(tài)但為雄性不育。更明確地說(shuō),本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)雄性不育植物的方法,其特征包括,將一個(gè)第一啟動(dòng)子片段連在一種RNA酶基因上游,將一種與該第一啟動(dòng)子相同或不同的第二啟動(dòng)子連在一種RNA酶抑制劑蛋白基因的上游,并將這些基因轉(zhuǎn)入植物基因組從而得到所述基本上雄性不育的植物。
文檔編號(hào)C12N5/10GKCN1336796SQ00802835
公開(kāi)日2002年2月20日 申請(qǐng)日期2000年9月12日
發(fā)明者浜田和行, 中木戶(hù)文夫 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan