本發(fā)明涉及生物，具體地涉及一種虛損瘀毒型阿爾茨海默病動物模型的構(gòu)建及評價方法。

背景技術(shù)：

1、阿爾茨海默病(ad)作為一種神經(jīng)退行性病變，以進(jìn)行性地記憶力衰退和認(rèn)知功能損害為主要臨床表現(xiàn)，以β淀粉樣蛋白沉積(aβ)和tau蛋白過度磷酸化為主要病理特征。流行病學(xué)數(shù)據(jù)揭示：中國ad的患病人數(shù)呈現(xiàn)出逐年攀升的態(tài)勢，至2030年，我國癡呆患者群體規(guī)?；?qū)⒓眲U(kuò)大至約7800萬，而到2050年，這一數(shù)字更將攀升至1.39億人次，彰顯出ad在中國面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)與持續(xù)增長的趨勢。

2、中醫(yī)認(rèn)為ad的發(fā)病根源在腎。腎為先天之本，藏精生髓，而腦為髓海，腎精虧虛則髓海失于充養(yǎng)。此外，氣虛是ad致病的另一重要病理環(huán)節(jié)，氣不足則推動無力，瘀血內(nèi)停，凝滯不化則腦絡(luò)不通，瘀毒內(nèi)生，進(jìn)一步阻滯氣機(jī)，蒙蔽清竅，損傷腦絡(luò)，最終形成ad的各種臨床表現(xiàn)。ad由多種致病因素交織而成，且臨床ad患者多以老年人為主，普遍表現(xiàn)出腎精虧虛、氣血衰弱的特征，同時伴隨著臟腑功能衰退，以及營血與津液循環(huán)滯緩等表現(xiàn)，呈現(xiàn)出虛、瘀、毒等多種病理因素并存、相互影響的復(fù)雜態(tài)勢。

3、中醫(yī)動物模型作為連接傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的橋梁，通過模擬人類疾病的某些特征或病理過程，為中醫(yī)藥研究提供了實驗依據(jù)，在中藥新藥研發(fā)中發(fā)揮著重要作用。然而，當(dāng)前的ad動物模型主要集中在自然衰老模型、快速老化小鼠模型、膽堿能系統(tǒng)損害模型、轉(zhuǎn)基因動物模型和鋁中毒模型等，與中醫(yī)證候分型相關(guān)的ad動物模型極為稀缺。雖然有研究者利用氫化可的松與腦內(nèi)aβ注射相結(jié)合的方法，構(gòu)建了腎虛型ad大鼠模型，但該模型僅單純模擬了腎虛證候，未能包含瘀等其他重要證候。此外，多因素造模的不確定性和高致死率等問題，對構(gòu)建多因素中醫(yī)ad動物模型帶來了不小的挑戰(zhàn)。

4、多因素中醫(yī)動物模型存在不小的挑戰(zhàn)，一方面當(dāng)前依據(jù)中醫(yī)病因病機(jī)制作動物模型，多結(jié)合西醫(yī)手術(shù)、物理、化學(xué)等方法，不太符合疾病自然發(fā)病的情況，另一方面，有些化學(xué)試劑、手術(shù)操作等造模因素所引起的創(chuàng)傷過大、感染等使造模動物成活率很低，也容易干擾證候特征的純潔性，故盡量不采用手術(shù)造模[趙輝.試論多因素復(fù)合制作病證結(jié)合動物模型思路[j].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2001,(05):57-59.]。此外，實驗分組不夠科學(xué)、單一造模方式的公認(rèn)度不足、可重復(fù)性差以及檢測指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性差等都是目前多因素造模存在的問題。這也突出了構(gòu)建一種能夠全面模擬虛、瘀、毒等中醫(yī)多因素病理特征的中醫(yī)ad動物模型的迫切性和重要性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對中醫(yī)相關(guān)ad動物模型的稀缺、多因素造模下的不確定性和高致死率等現(xiàn)狀，利用多因素結(jié)合的方式構(gòu)建一種虛損瘀毒型ad動物模型。本發(fā)明選定app/ps1小鼠作為實驗對象，該小鼠品種作為ad研究的經(jīng)典動物模型，在4至6月齡時可自然形成腦內(nèi)aβ斑塊，從而避免了腦內(nèi)注射aβ等侵入性操作對小鼠的額外傷害，確保了ad小鼠的高存活率。進(jìn)一步地，為探索app/ps1小鼠多因素聯(lián)合造模的可行性，本發(fā)明首先在app/ps1背景小鼠上探究了角叉菜膠誘導(dǎo)血瘀的條件。最終選擇以睡眠剝奪、氫化可的松灌胃和角叉菜膠腹腔注射等方法分別進(jìn)行氣虛、腎虛及血瘀的誘導(dǎo)，這一策略不僅簡化了實驗流程，減少了繁雜重復(fù)的實驗操作，還確保了多因素聯(lián)合造模下小鼠的高存活率及造模成功率。本發(fā)明提供一種虛損瘀毒型ad動物模型的構(gòu)建及評價方法，采用睡眠剝奪和化學(xué)刺激等多因素聯(lián)合的方法構(gòu)建虛損瘀毒型ad動物模型，構(gòu)建方法簡便，操作性強(qiáng)，能減輕多因素聯(lián)合造模的死亡率，能有效模擬虛損瘀毒型ad患者的證候表征，為臨床虛損瘀毒型ad創(chuàng)新藥物的研發(fā)和作用機(jī)制研究提供可靠的實驗載體。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種虛損瘀毒型ad動物模型的構(gòu)建及評價方法，具體技術(shù)方案如下：

3、一種虛損瘀毒型ad動物模型的構(gòu)建方法，對ad雙轉(zhuǎn)基因小鼠每天同時進(jìn)行持續(xù)性睡眠剝奪和角叉菜膠注射，連續(xù)28天；在第20天開始予氫化可的松灌胃，隔天1次，共灌胃4次。優(yōu)選地，所述的持續(xù)性睡眠剝奪為進(jìn)行氣虛誘導(dǎo)方式，若睡眠剝奪誘導(dǎo)的小鼠與空白對照組的小鼠相比，氣虛指標(biāo)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，則說明氣虛可誘導(dǎo)成功；所述的氫化可的松灌胃為進(jìn)行腎虛誘導(dǎo)方式，若氫化可的松誘導(dǎo)的小鼠與空白對照組小鼠相比，腎虛指標(biāo)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，則說明腎虛可誘導(dǎo)成功；所述的角叉菜膠注射進(jìn)行血瘀誘導(dǎo)，若角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠與空白對照組小鼠相比，血瘀證指標(biāo)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，則說明血瘀可誘導(dǎo)成功；若轉(zhuǎn)基因小鼠和空白對照小鼠相比，毒損指標(biāo)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，則說明毒損可誘導(dǎo)成功；若多因素復(fù)合模型組的在氣虛、腎虛、血瘀、毒損等各項評價指標(biāo)上與空白對照組小鼠均體現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異，則說明虛損瘀毒型ad動物模型構(gòu)建成功。

4、其中，所述的ad雙轉(zhuǎn)基因小鼠為5-12月齡、20-40g的spf級app/ps1小鼠。優(yōu)選地，所述ad雙轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織病理特征為大腦皮層或海馬中出現(xiàn)進(jìn)行性淀粉樣蛋白沉積，進(jìn)一步優(yōu)選地為5月齡。

5、其中，所述的持續(xù)性睡眠剝奪，睡眠剝奪條件為先正轉(zhuǎn)1.5圈、再反轉(zhuǎn)1.5圈，記為轉(zhuǎn)動1次，轉(zhuǎn)速為6-8rpm，每次轉(zhuǎn)動間隔時間1-3min，每天睡眠剝奪時長為8-12小時。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)速為8rpm，每次轉(zhuǎn)動間隔時間為2min，每天睡眠剝奪時長為10小時。

6、其中，所述的注射為腹腔注射，所述的角叉菜膠的注射劑量為4-8mg/kg/天，每天一次。優(yōu)選地，所述的角叉菜膠以角叉菜膠溶液的形式注射，其溶劑為生理鹽水；所述的角叉菜膠的注射濃度為0.6mg/ml，注射劑量為0.1ml/10g。

7、其中，所述的氫化可的松的灌胃劑量為50mg/kg/次。

8、其中，所述的構(gòu)建方法還包括虛損瘀毒型ad的評價指標(biāo)，所述評價包括氣虛指標(biāo)、腎虛指標(biāo)、血瘀指標(biāo)、毒損指標(biāo)和ad模型評價指標(biāo)。

9、其中，所述氣虛指標(biāo)包括體重、抓力指數(shù)和脾臟指數(shù)；

10、所述腎虛指標(biāo)包括體重、腎臟指數(shù)、睪丸指數(shù)和皮質(zhì)醇(cortisol)水平；

11、所述血瘀指標(biāo)包括vacm-1、il-6、il-1β和tnf-α水平；

12、所述毒損指標(biāo)包括海馬組織aβ沉積情況、海馬組織中aβ生成相關(guān)蛋白app、ps1、bace-1的表達(dá)水平。

13、所述ad模型評價指標(biāo)包括學(xué)習(xí)記憶能力評價和腦組織尼氏病理。所述的學(xué)習(xí)記憶能力評價包括水迷宮評價。

14、多因素處理致腎虛瘀毒ad小鼠與空白對照小鼠相比，體重變化，抓力指數(shù)顯著下降，脾臟指數(shù)降低。

15、多因素處理致腎虛瘀毒ad小鼠與空白對照小鼠相比，小鼠體重降低，腎臟指數(shù)顯著降低，睪丸指數(shù)顯著降低，血清皮質(zhì)醇cortisol含量顯著降低。

16、多因素處理致腎虛瘀毒ad小鼠與空白對照小鼠相比，血管細(xì)胞黏附因子vcam-1含量升高，炎癥細(xì)胞因子tnf-α、il-6、il-1β含量升高。

17、多因素處理致腎虛瘀毒ad小鼠與空白對照小鼠相比，腦組織aβ免疫熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，海馬組織中app、ps1、bace-1蛋白表達(dá)顯著升高。

18、多因素處理致腎虛瘀毒ad小鼠與空白對照小鼠相比，腦組織尼氏病理神經(jīng)元損傷顯著，水迷宮中逃避潛伏時間顯著延長，學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低。

19、第二方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的動物模型在篩選治療或改善虛損瘀毒型ad的藥物方面的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述的應(yīng)用包括以下步驟：向動物模型的小鼠給予候選藥物，并對給予藥物的小鼠進(jìn)行藥效檢測和比較；其中，所述動物模型包括：虛損瘀毒型ad動物模型。

20、第三方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的動物模型在虛損瘀毒型ad的發(fā)病機(jī)理研究和藥效評價方面的應(yīng)用。

21、有益效果：

22、本發(fā)明提供了一種虛損瘀毒型ad的動物模型的構(gòu)建和評價方法，該方法構(gòu)建的虛損瘀毒型ad的動物模型，該模型的證候表征均予臨床觀察結(jié)果相一致，能夠為虛損瘀毒型ad的創(chuàng)新藥物研發(fā)、上市品種在評價和作用機(jī)制研究提供可靠的實驗載體，填補了現(xiàn)有技術(shù)中全面模擬虛、瘀、毒等中醫(yī)病理特征的中醫(yī)ad動物模型的空白。