本發(fā)明涉及一種辣木的組織培養(yǎng)快繁方法，屬于苗木培育技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前，國內(nèi)關(guān)于辣木快速繁殖的文獻(xiàn)還很少。黎國運(yùn)等以當(dāng)年生辣木實生苗頂芽、幼嫩側(cè)芽為繁殖材料，采用芽器官離體培養(yǎng)快速繁殖，不經(jīng)過愈傷組織獲得大量叢生芽，壯苗生根，大田移栽獲得成功，首次對辣木的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了探索。2007年是對辣木組織培養(yǎng)技術(shù)研究較多的一年，馬崇堅等采用實生種子萌發(fā)誘導(dǎo)無菌苗，通過愈傷組織發(fā)生途徑，對辣木愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽的誘導(dǎo)及增殖、生根培養(yǎng)基的配方和移栽等問題進(jìn)行了探討。羅云霞等利用辣木種子產(chǎn)生不定芽的微繁殖，對辣木的種子消毒方法，以及不定芽誘導(dǎo)、增殖、生根培養(yǎng)基的配方和移栽基質(zhì)進(jìn)行了探討。向素瓊等對m.oleiferalam.（辣木、印度傳統(tǒng)辣木）和m.stenopetala(bakerf.)cufod.（非洲辣木）兩種基因型的不同外植體材料進(jìn)行了離體培養(yǎng)，篩選了最適外植體材料，并對愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的培養(yǎng)基條件進(jìn)行了選擇。向素瓊等、張潔等還對秋水仙素對離體培養(yǎng)辣木多倍體的誘導(dǎo)進(jìn)行了研究，獲得了四倍體再生植株。此后，又有王洪峰等選用印度改良辣木的幼苗莖段、朱尾銀選用選優(yōu)樹新長出的嫩芽經(jīng)外植體消毒后，進(jìn)行了不定芽初代誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、生根誘導(dǎo)和生根苗移植試驗，并對微繁體系建立過程中繼代苗的玻璃化、生根苗黃化及愈傷頭過大、移栽過程中的管理等問題進(jìn)行了討論。對辣木組織培養(yǎng)較為系統(tǒng)的研究是2012年趙翠翠通過器官發(fā)生途徑建立和優(yōu)化了辣木組織培養(yǎng)再生體系，對辣木的組培快繁體系的建立和相關(guān)機(jī)理進(jìn)行的研究。她所采用的原材料包括新鮮和儲藏一年的種子、1-2年生的嫩枝，研究的內(nèi)容包括：原材料的消毒；愈傷組織的誘導(dǎo)、形態(tài)、活力、生理生化；探討不同外植體器官直接發(fā)生途徑的培養(yǎng)條件；煉苗移栽等。

利用組培技術(shù)對原材料的需求量較小，可以周年生產(chǎn)，不受季節(jié)限制，所獲得的再生植株以幾何倍數(shù)大量繁殖，后代遺傳性狀穩(wěn)定、無病毒，能夠保持親本的優(yōu)良性狀，具有其他繁殖方式不可比擬的優(yōu)越性。但對組培操作技術(shù)要求嚴(yán)格，隨著繼代周期增加，畸形苗發(fā)生率、玻璃化情況、褐變情況增加，且成本投入較大等等成為制約組培技術(shù)發(fā)展的瓶頸。

利用組織培養(yǎng)技術(shù)對辣木進(jìn)行快速繁殖，可節(jié)約繁殖材料，縮短繁殖周期，大量提供無性系幼苗，并且保持母本的優(yōu)良性狀，提高經(jīng)濟(jì)效益。以前有些學(xué)者對辣木組培技術(shù)進(jìn)行了研究，但研究成果在辣木苗木生產(chǎn)上的應(yīng)用尚不普遍，究其原因，現(xiàn)有組培研究中技術(shù)要求過于復(fù)雜、不具有普遍適用性、組培過程中遇到的問題還沒有有效解決辦法、再生植株成活率低等是主要的因素，辣木組培技術(shù)還有很大發(fā)展空間。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種辣木的組織培養(yǎng)快繁方法，利用生物技術(shù)結(jié)合常規(guī)育種方式來實現(xiàn)對優(yōu)質(zhì)辣木的種質(zhì)資源進(jìn)行保存，研究出辣木的組織培養(yǎng)生根配方，以解決現(xiàn)有技術(shù)的不足和難題。

為實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下所示：一種辣木的組織培養(yǎng)快繁方法，經(jīng)過下列各步驟：

（1）辣木種子的消毒和萌發(fā)：去除外殼后立即在超凈工作臺上對已剝殼的種胚進(jìn)行消毒處理，消毒處理的方法為先用75%酒精溶液振蕩清洗30s，再在0.1%升汞溶液中振蕩浸泡20min，最后用無菌水清洗6次；辣木種子的發(fā)芽溫度為25~28℃；當(dāng)種子萌發(fā)后大部分無菌苗長至3~4cm時，切去根及子葉，將上胚軸作為不定芽誘導(dǎo)的材料；

（2）不定芽誘導(dǎo)：將步驟（1）所得上胚軸接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：ms+0.1~0.5mg/l6-ba+0.01~0.05mg/lnaa+20.0g/l蔗糖+2.75g/l瓊脂，ph為5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)以誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，當(dāng)誘導(dǎo)的叢芽或單芽生長到3~5cm時，切取生長較為一致、健康且不帶或帶少量愈傷的單芽；

（3）繼代增殖：將步驟（2）的單芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基：ms+0.1~0.5mg/l6-ba+0.01~0.05mg/lnaa+20.0g/l蔗糖+2.75g/l瓊脂，ph為5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

（4）生根培養(yǎng)：將步驟（3）所得繼代過1代，苗高2~5cm的培養(yǎng)物接種于生根培養(yǎng)基中：1/2ms+0.5mg/liba+0.1mg/lnaa+20.0g/l蔗糖+2.75g/l瓊脂，ph為5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照條件進(jìn)行生根培養(yǎng)，即完成辣木的組織培養(yǎng)快繁。

本發(fā)明總結(jié)了國內(nèi)外辣木研究進(jìn)展情況，并在國內(nèi)辣木組培技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，采用傳統(tǒng)辣木改良種pkm-1的種子為材料，誘導(dǎo)萌發(fā)無菌苗，用其上胚軸作為不定芽誘導(dǎo)的外植體，并繼代增殖，進(jìn)行生根培養(yǎng)，對辣木組織培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了探討。本發(fā)明的優(yōu)點和創(chuàng)新性在于，利用辣木種子作為組織培養(yǎng)的原始材料，保持了種子的優(yōu)良特性，對于辣木優(yōu)良品種的選育具有重要意義。而通過器官繁殖方式進(jìn)行辣木的快速增殖，可以不經(jīng)過脫分化過程，避免了脫分化過程中引起的染色體變異，遺傳穩(wěn)定性高，且以芽繁芽的方式繁殖系數(shù)高，繁殖速度快，可以滿足市場對于辣木苗的較高需求。本發(fā)明是在前人試驗的基礎(chǔ)上的開拓與創(chuàng)新，所采用的培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)條件更加有利于辣木不定芽的誘導(dǎo)及增殖，也更加有利于進(jìn)行工廠化操作。

本發(fā)明與其他組培試驗相比，在試驗設(shè)置上更加具體、深入。在外植體的處理環(huán)節(jié)，本發(fā)明論證了去殼后立即消毒可以縮短消毒時間，減輕消毒劑對外植體的損害，提高無菌苗成活率，使試驗操作更加簡單快捷。在種胚發(fā)芽階段特別設(shè)置了溫度與培養(yǎng)基水分含量對種胚發(fā)芽影響的試驗，是受種子發(fā)芽需要適宜的溫度及充足的水分條件的概念的啟發(fā)，并因此也找出了辣木種胚發(fā)芽所需要的溫度及水分條件。在不定芽誘導(dǎo)階段，本發(fā)明突出了細(xì)胞分裂素種類和濃度的選擇以及細(xì)胞分裂素與生長素比例和濃度的配置這兩個方面，在不定芽增殖階段，本發(fā)明突出了無機(jī)鹽濃度、細(xì)胞分裂素種類和濃度的選擇、細(xì)胞分裂素與生長素比例和濃度及種類等幾個方面，步步深入，最后尋找出了辣木不定芽誘導(dǎo)和增殖的最適培養(yǎng)基類型，并且論證了辣木不定芽誘導(dǎo)及增殖可以在同一種培養(yǎng)基上進(jìn)行，簡化了實驗操作步驟，節(jié)約了實驗材料。在不定芽生根階段，本發(fā)明不僅記錄了每組處理不定芽生根的數(shù)量，也對其起始生根所需要的時間及生根速度等也做出了比較，更加全面、更加具體地對辣木不定芽生根情況進(jìn)行了分析。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實施例1

（1）辣木種子的消毒和萌發(fā)：去除外殼后立即在超凈工作臺上對已剝殼的種胚進(jìn)行消毒處理，消毒處理的方法為先用75%酒精溶液振蕩清洗30s，再在0.1%升汞溶液中振蕩浸泡20min，最后用無菌水清洗6次；辣木種子的發(fā)芽溫度為25~28℃；當(dāng)種子萌發(fā)后大部分無菌苗長至3~4cm時，切去根及子葉，將上胚軸作為不定芽誘導(dǎo)的材料；

（2）不定芽誘導(dǎo)：將步驟（1）所得上胚軸接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：ms+0.3mg/l6-ba+0.04mg/lnaa+20.0g/l蔗糖+2.75g/l瓊脂，ph為5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)以誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，當(dāng)誘導(dǎo)的叢芽或單芽生長到3~5cm時，切取生長較為一致、健康且不帶或帶少量愈傷的單芽；

（3）繼代增殖：將步驟（2）的單芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基：ms+0.4mg/l6-ba+0.03mg/lnaa+20.0g/l蔗糖+2.75g/l瓊脂，ph為5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

（4）生根培養(yǎng)：將步驟（3）所得繼代過1代，苗高2~5cm的培養(yǎng)物接種于生根培養(yǎng)基中：1/2ms+0.5mg/liba+0.1mg/lnaa+20.0g/l蔗糖+2.75g/l瓊脂，ph為5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照條件進(jìn)行生根培養(yǎng)，即完成辣木的組織培養(yǎng)快繁。

實施例2

（1）辣木種子的消毒和萌發(fā)：去除外殼后立即在超凈工作臺上對已剝殼的種胚進(jìn)行消毒處理，消毒處理的方法為先用75%酒精溶液振蕩清洗30s，再在0.1%升汞溶液中振蕩浸泡20min，最后用無菌水清洗6次；辣木種子的發(fā)芽溫度為25~28℃；當(dāng)種子萌發(fā)后大部分無菌苗長至3~4cm時，切去根及子葉，將上胚軸作為不定芽誘導(dǎo)的材料；

（2）不定芽誘導(dǎo)：將步驟（1）所得上胚軸接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：ms+0.1mg/l6-ba+0.01mg/lnaa+20.0g/l蔗糖+2.75g/l瓊脂，ph為5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)以誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，當(dāng)誘導(dǎo)的叢芽或單芽生長到3~5cm時，切取生長較為一致、健康且不帶或帶少量愈傷的單芽；

（3）繼代增殖：將步驟（2）的單芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基：ms+0.1mg/l6-ba+0.01mg/lnaa+20.0g/l蔗糖+2.75g/l瓊脂，ph為5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

（4）生根培養(yǎng)：將步驟（3）所得繼代過1代，苗高2~5cm的培養(yǎng)物接種于生根培養(yǎng)基中：1/2ms+0.5mg/liba+0.1mg/lnaa+20.0g/l蔗糖+2.75g/l瓊脂，ph為5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照條件進(jìn)行生根培養(yǎng)，即完成辣木的組織培養(yǎng)快繁。

實施例3

（1）辣木種子的消毒和萌發(fā)：去除外殼后立即在超凈工作臺上對已剝殼的種胚進(jìn)行消毒處理，消毒處理的方法為先用75%酒精溶液振蕩清洗30s，再在0.1%升汞溶液中振蕩浸泡20min，最后用無菌水清洗6次；辣木種子的發(fā)芽溫度為25~28℃；當(dāng)種子萌發(fā)后大部分無菌苗長至3~4cm時，切去根及子葉，將上胚軸作為不定芽誘導(dǎo)的材料；

（2）不定芽誘導(dǎo)：將步驟（1）所得上胚軸接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：ms+0.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+20.0g/l蔗糖+2.75g/l瓊脂，ph為5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)以誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，當(dāng)誘導(dǎo)的叢芽或單芽生長到3~5cm時，切取生長較為一致、健康且不帶或帶少量愈傷的單芽；

（3）繼代增殖：將步驟（2）的單芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基：ms+0.5mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+20.0g/l蔗糖+2.75g/l瓊脂，ph為5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)；

（4）生根培養(yǎng)：將步驟（3）所得繼代過1代，苗高2~5cm的培養(yǎng)物接種于生根培養(yǎng)基中：1/2ms+0.5mg/liba+0.1mg/lnaa+20.0g/l蔗糖+2.75g/l瓊脂，ph為5.8~5.9，并于25±2℃、自然光照條件進(jìn)行生根培養(yǎng)，即完成辣木的組織培養(yǎng)快繁。