本發(fā)明屬于組培方法領域，具體的說是一種何魯牽牛組織培養(yǎng)的方法。

背景技術：

何魯牽牛(Ipomoea holubii)為旋花科番薯屬植物，原產(chǎn)于博茨瓦納和納米比亞。何魯牽牛具有大型的球狀塊根，且表面石化呈黃褐色，其葉細長如柳葉，開深粉色喇叭型花，觀賞價值很高，是一種珍貴的多肉植物。然而在自然條件下，何魯牽牛生長緩慢，繁殖率低，數(shù)量較少。為了保護野生何魯牽牛植物免遭掠奪性采集甚至滅絕的威脅，國際多肉植物研究組織(The International Organization for Succulent Plant Study)已將何魯牽牛列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES公約)附錄內，屬于瀕危野生植物。這使得其市售價格居高不下，極大地限制了何魯牽牛的引種、推廣和應用。然而，利用植物組織培養(yǎng)技術進行何魯牽牛的快速繁殖可以在短期內獲得大量與母株遺傳背景一致的優(yōu)質種苗，這對于滿足國內外對于何魯牽牛的市場需求、保護珍稀的何魯牽牛野生資源具有重要的意義。但是，在此之前還沒有關于何魯牽牛組織培養(yǎng)研究的報道，更沒有成功的實例。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的不足，而提供一種何魯牽牛組織培養(yǎng)的方法。

本發(fā)明的目的是通過如下技術方案來完成的。這種何魯牽牛組織培養(yǎng)的方法，該方法包括如下步驟：

1)、培養(yǎng)基的配制：

(1)基本培養(yǎng)基：WPM培養(yǎng)基，其中蔗糖20～30g/L，瓊脂6～9g/L，pH＝5.8；

(2)啟動培養(yǎng)基：WPM+6-BA 0.2～0.5mg/L+NAA 0～0.02mg/L+0.1％～0.3％活性炭；

(3)增殖培養(yǎng)基：WPM+6-BA 0.1～0.5mg/L+0.1％～0.3％活性炭；

(4)生根培養(yǎng)基：WPM+IBA 0.1～0.3mg/L+0.1％～0.3％活性炭；

2)、外植體的選取及消毒：

選取何魯牽牛的莖段作為外植體，清洗并消毒后備用；

3)、腋芽的誘導：

將步驟2)消毒處理后的莖段在無菌條件下接種于啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)4周后從葉腋處誘導出腋芽；

4)、不定芽的增殖：

將步驟3)誘導出的腋芽切下轉至增殖培養(yǎng)基上進行不定芽的增殖，培養(yǎng)4～6周后有不定芽叢形成；

5)、生根及移栽：

將步驟4)增殖獲得的不定芽叢在無菌條件下分割成單株后轉接到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3～5周后生根，將生根植株從培養(yǎng)基中取出并清洗后移栽至基質中。

作為優(yōu)選，在所述步驟1)中，所述的培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的組分具體為：

(1)基本培養(yǎng)基：WPM培養(yǎng)基，其中蔗糖30g/L，瓊脂8g/L，pH＝5.8；

(2)啟動培養(yǎng)基：WPM+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.01mg/L+0.1％活性炭；

(3)增殖培養(yǎng)基：WPM+6-BA 0.2mg/L+0.1％活性炭；

(4)生根培養(yǎng)基：WPM+IBA 0.2mg/L+0.1％活性炭。

作為優(yōu)選，在所述步驟2)中，所述的消毒處理是將何魯牽牛的莖段先用飽和洗衣粉溶液浸泡30min后，再用自來水沖洗干凈，然后依次在體積比為70％的酒精溶液和有效氯飽和度為1％的次氯酸鈉溶液中分別浸泡40s和7min，期間搖晃幾次，最后用無菌水沖洗3～5遍，每遍1min。

作為優(yōu)選，在所述步驟3)中，所述的腋芽的誘導培養(yǎng)是將消毒處理后的莖段在無菌條件下接種于啟動培養(yǎng)基上進行腋芽的誘導。

本發(fā)明的有益效果為：利用植物組織培養(yǎng)技術對何魯牽牛進行了離體培養(yǎng)和組培快繁，能夠在較短時間內獲得大量遺傳性狀一致的優(yōu)質壯苗，克服了何魯牽牛母本稀缺及常規(guī)繁殖方法慢的缺點，對保護其野生種質資源和促進其種苗的規(guī)?；a(chǎn)都具有積極意義。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發(fā)明做詳細的介紹：

實施例1

本發(fā)明提供了一種何魯牽牛組織培養(yǎng)的方法，其步驟為：

1)、培養(yǎng)基的配制

(1)基本培養(yǎng)基：WPM培養(yǎng)基，其中蔗糖20～30g/L，瓊脂6～9g/L，pH＝5.8；

(2)啟動培養(yǎng)基：WPM+6-BA 0.2～0.5mg/L+NAA 0～0.02mg/L+0.1～0.3％活性炭；

(3)增殖培養(yǎng)基：WPM+6-BA 0.1～0.5mg/L+0.1～0.3％活性炭；

(4)生根培養(yǎng)基：WPM+IBA 0.1～0.3mg/L+0.1～0.3％活性炭；

2)、外植體的選取及消毒

選取何魯牽牛的莖段作為外植體材料，先用飽和洗衣粉溶液浸泡30min后再用自來水沖洗干凈，然后依次在體積比為70％的酒精溶液和有效氯飽和度為1％的次氯酸鈉溶液中分別浸泡40s和7min，期間搖晃幾次，最后用無菌水沖洗3～5遍，每遍1min。

3)、腋芽的誘導

將消毒處理后的莖段在無菌條件下接種于啟動培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4周左右后可從葉腋處直接誘導出腋芽；

4)、不定芽的增殖

待腋芽具有3～5片葉子時將其切下轉至增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)4～6周后可形成不定芽叢；培養(yǎng)溫度為23±2℃、光照強度為30～80μmol·m-2·s-1、光照時間為8～10小時/天；

5)、生根及移栽

將不定芽叢分割成單株后轉接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3～5周后可形成具有1cm左右幼根的完整植株；培養(yǎng)溫度為23±2℃、光照強度為30～60μmol·m-2·s-1、光照時間為8～10小時/天；

將生根植株從培養(yǎng)基中取出并清洗后移栽至基質中栽培，先在幼苗上覆蓋薄膜并遮蔭，在煉苗2～4天后逐漸揭開薄膜使幼苗適應外界環(huán)境，移栽成活率為90％左右。

實施例2

本發(fā)明提供了一種何魯牽牛組織培養(yǎng)的方法，其步驟為：

1)、培養(yǎng)基的配制

(1)基本培養(yǎng)基：WPM培養(yǎng)基，其中蔗糖30g/L，瓊脂8g/L，pH＝5.8；

(2)啟動培養(yǎng)基：WPM+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.01mg/L+0.1％活性炭；

(3)增殖培養(yǎng)基：WPM+6-BA 0.2mg/L+0.1％活性炭；

(4)生根培養(yǎng)基：WPM+IBA 0.2mg/L+0.1％活性炭；

2)、外植體的選取及消毒

選取何魯牽牛的莖段作為外植體材料，先用飽和洗衣粉溶液浸泡30min后再用自來水沖洗干凈，然后依次在體積比為70％的酒精溶液和有效氯飽和度為1％的次氯酸鈉溶液中分別浸泡40s和7min，期間搖晃幾次，最后用無菌水沖洗4遍，每遍1min；

3)、腋芽的誘導

將消毒處理后的莖段在無菌條件下接種于啟動培養(yǎng)基上。培養(yǎng)4周左右后可從葉腋處直接誘導誘導出腋芽；

4)、不定芽的增殖

待腋芽具有4片葉子時將其切下轉至增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)4～6周后可形成不定芽叢；培養(yǎng)溫度為23±2℃、光照強度為60μmol·m-2·s-1、光照時間為10小時/天；

5)、生根及移栽

將不定芽叢分割成單株后轉接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3～5周后可形成具有1cm左右幼根的完整植株；培養(yǎng)溫度為23±2℃、光照強度為50μmol·m-2·s-1、光照時間為8小時/天；

將生根植株從培養(yǎng)瓶中取出并清洗后移栽至基質中栽培，先在幼苗上覆蓋薄膜并遮蔭，在煉苗2～4天后逐漸揭開薄膜使幼苗適應外界環(huán)境，移栽成活率可達90％。

最后需要說明的是，除本實施例外，本發(fā)明還可以有其它實施方式和變形，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。凡本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。