本發(fā)明屬于植物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種紅錐嫩枝組培繁殖方法。

背景技術(shù)：

紅錐( Castanopsis hystrix A .DC )隸屬殼斗科( Fagaceae )栲屬( Castanopsis )，成年樹高可達30m，胸徑1m以上，是我國南亞熱帶和亞熱帶植被常綠闊葉林的優(yōu)勢組成樹種，屬華南地區(qū)重要的鄉(xiāng)土闊葉珍貴用材和高效多用途生態(tài)公益林樹種。紅錐天然分布于東經(jīng)95°20′～118°00′，北緯18°30′～25°00′，主產(chǎn)地集中于廣東、廣西、福建南部，其周邊分布在海南、云南南部、貴州東南部以及湖南、江西等省南部。

紅錐具有生長快、材質(zhì)優(yōu)、適應(yīng)廣、效益高等優(yōu)良特性。其主干通直，材質(zhì)堅硬，呈紅色，色澤和紋理美觀，耐腐蝕性強，不開裂、不變形、易加工，是優(yōu)質(zhì)珍貴用材，可供建筑、造船、高檔家具、木制地板、軍工用品、體育器材等用。種子富含淀粉，可用于炒食、飼料和釀酒，種實、殼斗均富含單寧，可提制栲膠。紅錐林萌芽力強，萌條生長迅速，一次造林可采伐10次以上，合理經(jīng)營可獲利上百年。紅錐枝葉濃密，較耐蔭蔽，混生性能好，可作為用材和水源涵養(yǎng)林進行純林種植，亦可為殘次林改造，生態(tài)公益林改造的混交造林。目前我國多個省如廣東、廣西、福建等將紅錐推選為當(dāng)?shù)貐^(qū)經(jīng)濟價值高、發(fā)展前途大的優(yōu)良樹種進行推廣，造林面積大，推廣應(yīng)用前景廣。

目前紅錐人工林栽培所用苗木多采用混采種子育苗，導(dǎo)致苗木及其造林后的林分個體分化大，參差不齊，進而影響到人工林的造林質(zhì)量、產(chǎn)量及經(jīng)濟效益。通過科技工作者近十幾年的研究，已選育出一批紅錐優(yōu)良單株，但由于所選優(yōu)株數(shù)量有限，加之樹齡年輕，結(jié)實率低，所收獲種子遠不能滿足造林需求。前期研究表明，紅錐優(yōu)樹無論采用嫁接還是扦插進行繁殖，繁殖率低，同時存在程度不同的偏冠現(xiàn)象，所繁育苗木難以用于生產(chǎn)。以紅錐優(yōu)樹萌枝進行組培研究雖有報道，但仍存在出芽慢，無菌系建立困難等問題，難以用于生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對紅錐組織培養(yǎng)過程中芽增殖系數(shù)低，生長緩慢等問題,提供一種生長效果好、擴繁快的紅錐嫩枝組培繁殖方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種紅錐嫩枝組培繁殖方法，包括外植體選擇、外植體處理、初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯芽培養(yǎng)和生根培養(yǎng)工序，采集半木質(zhì)化、生長健壯的當(dāng)年生紅錐嫩枝作為外植體，對外植體進行修剪、滅菌消毒處理后接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中獲取初始芽，再將初始芽接種于增殖培養(yǎng)基中經(jīng)過3-4個周期增殖培養(yǎng)，形成叢生芽，將叢生芽接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，具體操作步驟如下：

（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長健壯的當(dāng)年生紅錐嫩枝作為外植體；

（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗10-15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間15-20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；

（3）初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；

（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)3-4個周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；

（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；

（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)步驟（5），循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽。

以上所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 4.0-6.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+KT 1.0-2.0 mg/L+ZT 1.5-2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB₂ 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+蔗糖25 g/L。

以上所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 6.0-8.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+ZT 0.5-1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。

以上所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 3.0-4.0 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 25 g/L。

以上所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5-2.5 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 30 g/L。

以上所述的改良WPM培養(yǎng)基的配方為：以上所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 390 mg/L，CaCl₂·2H₂O 82 mg/L，MgSO₄·7H₂0 265 mg/L，KH₂PO₄ 170 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 165 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L，Na₂·EDTA 33.4 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇200 mg/L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

以上步驟（3）所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的培育控制條件為：光培養(yǎng)、光照500-1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃；步驟（4）所述的增殖培養(yǎng)、步驟（5）所述的壯芽培養(yǎng)、步驟（6）所述的生根培養(yǎng)的培育控制條件均為：光培養(yǎng)，光照2500-4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果如下：

1、本發(fā)明以紅錐當(dāng)年生嫩枝作為外植體，經(jīng)過初始芽培養(yǎng)基培養(yǎng)，初始芽萌動率90%以上；經(jīng)過3-4個周期增殖培養(yǎng)，形成叢生芽，芽增殖系數(shù)5/30d-7/30d，再將叢生芽接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，從而縮短了紅錐的育苗周期，節(jié)省育苗材料，克服了傳統(tǒng)育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期長等問題，大大降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。

2、本發(fā)明將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，余下小芽叢繼續(xù)增殖培養(yǎng)，使得材料能夠多次繼代，實現(xiàn)大量增殖，規(guī)?；a(chǎn)壯芽，實現(xiàn)黃樟油素型樟樹的擴繁。

3、本發(fā)明對WPM基本培養(yǎng)基進行了改良，同時重點調(diào)整了與紅錐出芽壯芽相關(guān)元素，使得培養(yǎng)基更科學(xué)，更有針對性，更易促使紅錐芽誘導(dǎo)的發(fā)生、增殖和壯芽，效果顯著。

4、本發(fā)明操作過程簡便，培養(yǎng)周期短，繼代芽產(chǎn)量大,并且質(zhì)量優(yōu)，增殖系數(shù)達到5以上的組培苗產(chǎn)業(yè)化技術(shù)要求，具有很好的經(jīng)濟效益、生態(tài)效益和社會效益。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。

實施例1：

（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長健壯的當(dāng)年生紅錐嫩枝作為外植體；

（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗10 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間15 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；

（3）初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照500 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 4.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB₂ 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+蔗糖25 g/L；

（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)3-4個周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 6.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L；

（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 25 g/L；

（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)步驟（5），循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導(dǎo)生根，生根率為94%；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 30 g/L。

以上所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 390 mg/L，CaCl₂·2H₂O 82 mg/L，MgSO₄·7H₂0 265 mg/L，KH₂PO₄ 170 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 165 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L，Na₂·EDTA 33.4 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇200 mg/L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

實施例2：

（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長健壯的當(dāng)年生紅錐嫩枝作為外植體；

（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；

（3）初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 5.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+KT 1.5 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB₂ 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+蔗糖25 g/L；

（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)3-4個周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 7.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L；

（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 3.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 25 g/L；

（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)步驟（5），循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導(dǎo)生根，生根率為92%；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 30 g/L。

以上所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 390 mg/L，CaCl₂·2H₂O 82 mg/L，MgSO₄·7H₂0 265 mg/L，KH₂PO₄ 170 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 165 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L，Na₂·EDTA 33.4 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇200 mg/L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

實施例3：

（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長健壯的當(dāng)年生紅錐嫩枝作為外植體；

（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；

（3）初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 6.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+KT 2.0 mg/L+ZT 2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB₂ 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+蔗糖25 g/L；

（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)3-4個周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 8.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L；

（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 4.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 25 g/L；

（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)步驟（5），循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導(dǎo)生根，生根率為95%；；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 2.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+蔗糖 30 g/L。

以上所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 390 mg/L，CaCl₂·2H₂O 82 mg/L，MgSO₄·7H₂0 265 mg/L，KH₂PO₄ 170 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 165 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L，Na₂·EDTA 33.4 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇200 mg/L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。