本發(fā)明涉及植物線蟲標本制作技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種植物線蟲永久玻片的制作方法。

背景技術(shù)：

植物線蟲屬于無脊椎動物中的線蟲門，能寄生于植物根、莖、葉、果實、種子等部位，其種類繁多、危害嚴重。據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界每年因植物線蟲造成的農(nóng)林作物經(jīng)濟損失在數(shù)千億元以上。我國2007年公布的對外植物檢疫性有害生物名錄中，有20種(屬)的線蟲為檢疫性線蟲，其實際種數(shù)多達200種以上。

在植物線蟲檢測鑒定研究工作中，一般首先必須制作臨時玻片，對線蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行初步觀察和攝影，并對各種數(shù)據(jù)進行測計。隨后，需進一步將樣品制成永久玻片，作為實驗室的實物標本，可作為檢疫實驗室的截獲證據(jù)，也可供教學或科研需要，尤其對鑒定的新種，必須要求有模式標本。

一般線蟲永久玻片制作過程較為復雜，制作步驟多，涉及標本的殺死、固定、脫水、制片等步驟。而且需耗時較長，一般需要5～6周。公開號為CN102640742A的中國專利公開了一種對傳統(tǒng)的永久玻片制作方法改進的技術(shù)方案，但該方案仍需用2種脫水液，且用時需20天左右。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供簡易的線蟲永久玻片制作方法，其方法便捷、可操作性強、效果好。

具體的技術(shù)方案如下：

一種植物線蟲永久玻片的制作方法，包括以下步驟：

a、將含有線蟲的水溶液在55-60℃溫浴2-3min后離心，分離水層得到線蟲液，將所述線蟲液在固定液中浸泡24h以上；

b、將含有線蟲的固定液離心，分離上層固定液得到固定后的線蟲，將固定后的線蟲與1.5～2.5ml甘油水溶液混合置于24孔細胞培養(yǎng)皿中，再將所述24孔細胞培養(yǎng)皿在35℃～40℃條件下恒溫放置40h～50h，得到完全脫水浸泡于甘油中的線蟲；其中，所述甘油水溶液包括體積比為1:15～25的甘油與水；

c、在載玻片上滴加甘油，將所述完全脫水浸泡于甘油中的線蟲移至載玻片的甘油滴中，在甘油滴兩邊放蠟塊，加蓋玻片，加熱至蠟塊融化后冷卻。

本發(fā)明中，所述線蟲固定液包括體積比為5～15:1～5:65～94的40wt％甲醛、甘油和水。

本發(fā)明步驟a或步驟b中，所述離心的轉(zhuǎn)速獨立地為2000～4000r/min，離心時間獨立地為1～5min。

本發(fā)明步驟c中，移至甘油滴中央的線蟲為已完全脫水的雌、雄線蟲各若干條，排列均勻。

步驟c中，所述加熱步驟具體為，將含有蠟塊的玻片置于50～70℃的加熱板上加熱，所述加熱的時間為20～40s。

步驟c中，玻片冷卻后，在所述玻片上貼上標簽，所述標簽上包括樣品號、寄主、產(chǎn)地、制作日期。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

本發(fā)明簡化了永久玻片制作的復雜程序，在脫水過程中只需要使用一種脫水液，其操作過程和所需材料比常規(guī)線蟲永久玻片制片方法簡化了許多，降低了制作難度。本發(fā)明植物線蟲永久玻片簡易制作方法，從殺死、固定、脫水和制片的全過程僅需約3d，操作簡單、快捷，對各種常見植物線蟲都能獲得較好的永久玻片。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明中的實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

一種植物線蟲永久玻片的制作方法，包括以下步驟：

線蟲的殺死與固定：將含有線蟲的水溶液溫浴后離心，分離水層得到微量線蟲液，在線蟲液中加入固定液浸泡，殺死和固定線蟲。

本發(fā)明中目標線蟲需是活的，最好是剛從土壤或植物組織中分離出的，若分離出的目標線蟲放置過久而沒有固定或固定時間短，會使線蟲變形。將含有線蟲的水溶液溫浴以殺死線蟲。溫浴溫度優(yōu)選為55-60℃，進一步為56-58℃，溫浴時間優(yōu)選為2-3min。將溫浴后的含有線蟲的水溶液離心，使線蟲和水分離。所述離心的轉(zhuǎn)速為2000～4000r/min，優(yōu)選為2500～3500r/min，進一步為3000r/min；離心時間為1～5min，優(yōu)選為2～4min，更優(yōu)選為3min。

去除分離的水層，向存留的少量線蟲液中加入線蟲固定液。所述線蟲固定液加入的體積以能沒過所述線蟲液為基礎(chǔ)，優(yōu)選所述線蟲液與所述固定液的體積比為1：10～30，進一步優(yōu)選為1：15～25，具體為1:20。其中，線蟲固定液可以采用本領(lǐng)域中常用的固定液對線蟲進行固定。在本發(fā)明中優(yōu)選采用40wt％甲醛、甘油和水混合形成的固定液。其中，40wt％甲醛、甘油和水的體積比為5～15:1～5:65～94，優(yōu)選為8～12:2～4:80～90，進一步優(yōu)選為10:2:88。本發(fā)明中對固定液的溫度沒有特殊的限定，采用室溫下的線蟲固定液即可。線蟲液與固定液混合后，在室溫下浸泡24小時以上，優(yōu)選為36小時以上，進一步為久于48小時進行固定。

固定之后，將含有線蟲的固定液離心。所述離心的轉(zhuǎn)速為2000～4000r/min，優(yōu)選為2500～3500r/min，進一步為3000r/min；離心時間為1～5min，優(yōu)選為2～4min，更優(yōu)選為3min。

離心后，固定液位于上層。分離上層固定液得到固定后的線蟲，將固定后的線蟲與甘油水溶液混合。具體為吸出上層固定液，將線蟲轉(zhuǎn)移至容器中，并在所述容器中加入甘油水溶液脫水浸泡。所述容器優(yōu)選用24孔細胞培養(yǎng)皿。所述甘油水溶液為含有甘油與水的混合溶液，甘油與水的體積比為1:10～30，優(yōu)選為1:15～25，具體為1:20。本發(fā)明甘油水溶液的體積為1.5～2.5mL，進一步為2mL。

將含有線蟲-甘油水溶液的容器在35℃～40℃條件下恒溫放置40h～50h。具體為，將含有甘油水溶液和線蟲的24孔細胞培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中放置，待甘油水溶液中的水完全蒸發(fā)，線蟲浸泡于甘油中，得到完全脫水的線蟲，用于制作線蟲永久玻片。其中，恒溫培養(yǎng)箱的溫度設置為35℃～40℃，進一步為37℃～38℃；線蟲在恒溫培養(yǎng)箱中放置的時間為40h～50h，進一步優(yōu)選為43～47小時。此時容器中蒸餾水已全部蒸發(fā)，線蟲浸泡于甘油中，用于制作線蟲永久玻片。

制作線蟲永久玻片：在載玻片上滴加甘油，將上述浸泡于甘油中的線蟲移至載玻片的甘油滴中?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的經(jīng)驗選擇滴加甘油的量，在本發(fā)明中，優(yōu)選在載玻片上滴加2～4微升甘油。每個玻片中可放置雌、雄線蟲各若干條，均勻排列在載破片上。在甘油滴兩邊放蠟塊，加蓋玻片，加熱至蠟塊融化后自然冷卻，貼上標簽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用常規(guī)的加熱方式，如酒精燈加熱，也可以采用加熱板加熱。在本發(fā)明實施例中，加熱具體為將含有蠟塊的玻片置于加熱板上加熱。加熱溫度為50～70℃，優(yōu)選為55～65℃，具體為64℃。待蠟塊融化后，停止加熱。優(yōu)選加熱時間為20～40s，進一步為30s。自然冷卻后貼上標簽。標簽上包括樣品號、寄主、產(chǎn)地、制作日期等信息，完成線蟲永久玻片的制作。將制作好的線蟲標本放入標本盒中保存。保存時注意保持玻片水平，以防線蟲滑動。

實施例1：

松材線蟲簡易永久玻片制作步驟：

a、清洗載玻片和蓋玻片；

b、松材線蟲的殺死與固定：在解剖鏡下，用移液器反復從培養(yǎng)皿中吸取線蟲，轉(zhuǎn)移到500μL塑料管中，將塑料管在57℃下溫浴2min后取出，以2500r/min離心3min，使線蟲沉降到塑料管底部。用移液器慢慢將塑料管上層的水吸出，使管中僅留少量的線蟲液(約10μL)，然后向管中加入線蟲固定液(40％甲醛：甘油：蒸餾水＝10:2:88)，使線蟲在固定液中浸泡24h以上，同時殺死和固定線蟲。

c、將塑料管2000r/min離心3min，使線蟲沉于管底。吸去上層線蟲固定液后，用移液器將線蟲移至24孔細胞培養(yǎng)皿中(為防止線蟲粘附于管壁，可用移液器吸取甘油水溶液反復吸取)，加入甘油水溶液(甘油：蒸餾水＝1:20)2mL，再將皿置于38℃恒溫培養(yǎng)箱中放置45h。此時皿中蒸餾水已全部蒸發(fā)，線蟲已浸泡于甘油中，可用于制作線蟲永久玻片。

d、取一干凈載玻片，在中間滴加2微升甘油，在解剖鏡下用挑針將已完全脫水的雌、雄線蟲各數(shù)條移至甘油滴的中央，排列均勻。

e、在甘油滴兩邊對稱放兩塊小蠟塊，加蓋玻片，置于64℃的加熱板上加熱，30s后待蠟塊融化后自然冷卻。

f、加貼標簽，寫明樣品號、寄主、產(chǎn)地、制作日期等，線蟲永久玻片制作完成。

實施例2：

花生根結(jié)線蟲簡易永久玻片制作步驟：

a、清洗載玻片和蓋玻片；

b、花生根結(jié)線蟲的殺死與固定：在解剖鏡下，用移液器反復從培養(yǎng)皿中吸取線蟲，轉(zhuǎn)移到500μL塑料管中，將塑料管在60℃下溫浴2min后取出，以3000r/min離心1min，使線蟲沉降到塑料管底部。用移液器慢慢將塑料管上層的水吸出，使管中僅留少量的線蟲液(約10μL)，然后向管中加入線蟲固定液(40％甲醛：甘油：蒸餾水＝15:5:94)，使線蟲在固定液中浸泡36h以上，同時殺死和固定線蟲。

c、將塑料管2500r/min離心4min，使線蟲沉于管底。吸去上層線蟲固定液后，用移液器將線蟲移至24孔細胞培養(yǎng)皿中(為防止線蟲粘附于管壁，可用移液器吸取甘油水溶液反復吸取)，加入甘油水溶液(甘油：蒸餾水＝1:30)1.5mL，再將皿置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中放置40h。此時皿中蒸餾水已全部蒸發(fā)，線蟲已浸泡于甘油中，可用于制作線蟲永久玻片。

d、取一干凈載玻片，在中間滴加3微升甘油，在解剖鏡下用挑針將已完全脫水的雌、雄線蟲各數(shù)條移至甘油滴的中央，排列均勻。

e、在甘油滴兩邊對稱放兩塊小蠟塊，加蓋玻片，置于54℃的加熱板上加熱，38s后待蠟塊融化后自然冷卻。

f、加貼標簽，寫明樣品號、寄主、產(chǎn)地、制作日期等，線蟲永久玻片制作完成。

實施例3：

燕麥真滑刃線蟲簡易永久玻片制作步驟：

a、清洗載玻片和蓋玻片；

b、燕麥真滑刃線蟲的殺死與固定：在解剖鏡下，用移液器反復從培養(yǎng)皿中吸取線蟲，轉(zhuǎn)移到500μL塑料管中，將塑料管在55℃下溫浴3min后取出，以2000r/min離心5min，使線蟲沉降到塑料管底部。用移液器慢慢將塑料管上層的水吸出，使管中僅留少量的線蟲液(約10μL)，然后向管中加入線蟲固定液(40％甲醛：甘油：蒸餾水＝7:1:75)，同時殺死和固定線蟲。使線蟲在固定液中浸泡48h以上；

c、將塑料管3500r/min離心4min，使線蟲沉于管底。吸去上層線蟲固定液后，用移液器將線蟲移至24孔細胞培養(yǎng)皿中(為防止線蟲粘附于管壁，可用移液器吸取甘油水溶液反復吸取)，加入甘油水溶液(甘油：蒸餾水＝1:10)2.5mL，再將皿置于40℃恒溫培養(yǎng)箱中放置40h。此時皿中蒸餾水已全部蒸發(fā)，線蟲已浸泡于甘油中，可用于制作線蟲永久玻片。

d、取一干凈載玻片，在中間滴加4微升甘油，在解剖鏡下用挑針將已完全脫水的雌、雄線蟲各數(shù)條移至甘油滴的中央，排列均勻。

e、在甘油滴兩邊對稱放兩塊小蠟塊，加蓋玻片，置于70℃的加熱板上加熱，24s后待蠟塊融化后自然冷卻。

f、加貼標簽，寫明樣品號、寄主、產(chǎn)地、制作日期等，線蟲永久玻片制作完成。

其它線蟲種類都同該實施例，也能取得本發(fā)明所述的效果。

上述植物線蟲永久玻片簡易制作方法，從殺死、固定、脫水和制片的全過程僅需約3d，操作簡單、快捷，對各種常見植物線蟲都能獲得較好的永久玻片。

上述實施方式旨在舉例說明本發(fā)明可為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員實現(xiàn)或使用，對上述實施方式進行修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，故本發(fā)明包括但不限于上述實施方式，任何符合本權(quán)利要求書或說明書描述，符合與本文所公開的原理和新穎性、創(chuàng)造性特點的方法、工藝、產(chǎn)品，均落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。