本發(fā)明屬于植物保護(hù)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種含有枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、哈茨木霉菌(trichodermaharzianum)與惡霉靈的殺菌組合物可濕性粉劑、制備方法及其在防治水稻立枯病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，對植物病蟲害具有較好的防治作用，目前運用枯草芽孢桿菌可有效防治草莓白粉病、黃瓜菌核病、番茄枯萎病等。由于微生物發(fā)酵易大規(guī)模生產(chǎn)，解決了實際生產(chǎn)中對于原料提取的依賴性，降低了防治成本。因此，枯草芽孢桿菌在植物生防領(lǐng)域的應(yīng)用具有廣闊前景。哈茨木霉菌(trichodermaharzianum)近年來在植物生防中受到研究者的重視。哈茨木霉菌是木霉菌的一種，是具有重要的生防價值的真菌。哈茨木霉菌對番茄灰霉病、葉霉病以及枯萎病、褐霉病的抑制作用明顯。而對芽孢桿菌、土壤桿菌、芽單胞菌有明顯促進(jìn)生長作用。在歐洲和北美占有很大的市場份額，前景廣闊。惡霉靈為淺黃色晶體，是內(nèi)吸性土壤殺菌劑，對土壤中真菌類的腐霉菌、鐮刀菌、絲核菌、根殼菌等病原菌殺菌效果較好。也是水稻立枯病防治的常用主要藥劑之一。水稻是我國重要的糧食作物，但是生產(chǎn)中水稻立枯病發(fā)生十分嚴(yán)重，成為水稻育苗生產(chǎn)的重大問題。所以現(xiàn)代育苗中使用了大量的化學(xué)殺菌劑來防治水稻立枯病，在使用過程中發(fā)現(xiàn)抗藥性逐年升高，并且由于殺菌劑的大量使用造成了不可逆的環(huán)境污染。生物農(nóng)藥的出現(xiàn)能夠解決當(dāng)前環(huán)境污染以及防效降低的問題。利用生防菌防治水稻立枯病具有很好防治效果。但生物菌防治效果受環(huán)境影響較大。所以為保證防治效果，本發(fā)明利用兩種生防菌枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌與化學(xué)殺菌劑惡霉靈組合防治水稻立枯病。該組合物化學(xué)農(nóng)藥使用量減少能夠有效減緩水稻立枯病產(chǎn)生的抗藥性，減少環(huán)境污染，做到綠色安全高效。并且能夠減少殺菌劑對土壤中有益菌群的不良影響，保證土壤菌群建立良性循環(huán)，為植物根系生長提供有利環(huán)境。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種含有枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌與惡霉靈的殺菌組合物可濕性粉劑及其制備方法。一種含有枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌與惡霉靈的殺菌組合物可濕性粉劑，按質(zhì)量百分和100％計算，各組份組成如下：所述的殺菌組合物可濕性粉劑中，有效成分枯草芽孢桿菌的含量為20～23億cfu/g、哈茨木霉菌的含量為35～40億cfu/g、惡霉靈≥25mg/g。所述助劑種類以及質(zhì)量百分比：載體硅藻土15％～20％、潤濕劑和分散劑萘磺酸鹽甲醛縮合物(d245)12％～15％、穩(wěn)定劑羧甲基纖維素鈉(cmc-na)1％～2％、保護(hù)劑l-抗壞血酸(vc)0.1％～0.5％作為優(yōu)選，所述枯草芽孢桿菌干粉與哈茨木霉菌孢子粉以1：1質(zhì)量比例混合制成復(fù)合生物菌母藥。作為優(yōu)選，所制備藥劑原料所占質(zhì)量百分比為：枯草芽孢桿菌干粉30％、哈茨木霉菌孢子粉30％、惡霉靈原藥3％、載體硅藻土19.9％、潤濕劑和分散劑萘磺酸鹽甲醛縮合物(d245)15％、穩(wěn)定劑羧甲基纖維素鈉(cmc-na)2％、保護(hù)劑l-抗壞血酸(vc)0.1％。本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌干粉的制備，其步驟如下：(1)枯草芽孢桿菌菌株的篩選及純化，一級平板lb固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，二級液體培養(yǎng)基馴化，三級液體培養(yǎng)基發(fā)酵。一級平板lb固體培養(yǎng)基配方：稱取胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g、瓊脂粉15g，加入到蒸餾水中，用蒸餾水定容至1l，再用naoh調(diào)節(jié)ph值到7.0～7.5；然后在121℃條件下高壓滅菌20min，待冷卻至50～60℃時，倒在培養(yǎng)皿中，得到一級平板lb固體培養(yǎng)基。二級液體培養(yǎng)基配方：稱取胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g，加入到蒸餾水中，用蒸餾水定容至1l，再用naoh調(diào)節(jié)ph值到7.0～7.5，然后在121℃條件下高壓滅菌20min，冷卻至室溫得到二級液體培養(yǎng)基。三級液體培養(yǎng)基配方：稱取胰化蛋白胨10g、牛肉膏3g、nacl5g，加入到蒸餾水中，然后用蒸餾水定容至1l，用naoh調(diào)節(jié)ph值到7.0～7.5；然后在120℃條件下高壓滅菌20min，冷卻至室溫后得到三級液體培養(yǎng)基。接種枯草芽孢桿菌菌株于一級平板lb固體培養(yǎng)基上，接種量為固體培養(yǎng)基體積的1～3％，28℃～30℃條件下培養(yǎng)48～72h，然后將枯草芽孢桿菌菌落接入二級液體培養(yǎng)基，于28℃～30℃、150～200r/min條件下震蕩培養(yǎng)48～72h，測定濃度大于20億cfu/ml接入三級液體培養(yǎng)基，于28℃～30℃、150～200r/min條件下震蕩發(fā)酵培養(yǎng)48～72h，將離心產(chǎn)物用無菌蒸餾水制得菌懸液，濃度為100～120億cfu/ml，4℃保存；(2)將枯草芽孢桿菌菌懸液與質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1％的海藻酸鈉水溶液等體積混合，恒溫攪拌混合均勻；(3)稱取步驟(2)溶液2倍體積的大豆油，向大豆油中加入吐溫80，配置成吐溫80質(zhì)量百分含量為0.2％的溶液；然后于150～200r/min條件下震蕩10～20min；(4)將步驟(2)所得的溶液滴加到步驟(3)所得的溶液中，100～300r/min條件下震蕩10～20min；再向其中滴加質(zhì)量百分含量為4％～5％的氯化鈣水溶液至無沉淀物析出為止，固化靜置30～60min；然后過濾出沉淀物，真空干燥后粉碎得到枯草芽孢桿菌干粉，其中枯草芽孢桿菌活菌≥70億cfu/g。本發(fā)明所述的哈茨木霉菌孢子粉的制備方法，其步驟如下：哈茨木霉菌菌株篩選、一級斜面培養(yǎng)、二級平板培養(yǎng)、三級固體堆積發(fā)酵。哈茨木霉菌三級培養(yǎng)全部采用pda固體培養(yǎng)基。pda培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15～20g、無菌水1000ml。將上述pda培養(yǎng)基120℃條件下高溫滅菌20分鐘后冷卻，倒入試管制備成一級斜面培養(yǎng)基。將菌株哈茨木霉菌轉(zhuǎn)入一級斜面培養(yǎng)基，30～35℃、暗環(huán)境下培養(yǎng)120h～170h，然后轉(zhuǎn)接到二級平板培養(yǎng)；再于30～35℃、暗環(huán)境下培養(yǎng)120h～170h，至哈茨木霉菌孢子以及菌絲全部覆蓋培養(yǎng)基為止，然后轉(zhuǎn)入三級培養(yǎng)瓶中進(jìn)行固體堆積培養(yǎng)，即在250ml培養(yǎng)瓶中加入100mlpda培養(yǎng)基凝固后使用接菌環(huán)接入哈茨木霉孢子進(jìn)行劃線，30～35℃、光照條件下培養(yǎng)至覆蓋培養(yǎng)基表面后使用玻璃棒將生長的哈茨木霉菌菌絲及孢子堆積到中心位置，重復(fù)3次堆積操作，測得菌種濃度達(dá)到140～160億cfu/g后升溫至60℃維持5h，從而制得哈茨木霉孢子粉濃度大于120億cfu/g，4℃保存。本發(fā)明所述的殺菌組合物可濕性粉劑的制備方法，其步驟如下：(1)將哈茨木霉孢子粉和枯草芽孢桿菌干粉混合恒溫均勻，制備得到菌劑母藥；(2)按質(zhì)量和100％計算，依次稱取菌劑母藥60％～68％、惡霉靈2.5％～3％、硅藻土15％～19.9％、萘磺酸鹽甲醛縮合物(d245)12％～15％、羧甲基纖維素鈉(cmc-na)1％～2％、l-抗壞血酸(vc)0.1％～0.5％，混合均勻；(3)將步驟(2)得到的混合物過標(biāo)準(zhǔn)400目篩后得到本發(fā)明所述的含有枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、哈茨木霉菌(trichodermaharzianum)與惡霉靈的殺菌組合物可濕性粉劑，裝棕色瓶保存。本發(fā)明組分合理，殺菌效果好，增效作用顯著，不僅可以減緩抗性的產(chǎn)生，而且對作物安全性好，符合農(nóng)藥制劑的安全性要求。本發(fā)明對水稻立枯病具有較好的防治效果具體實施方式本發(fā)明的核心是提供一種防治水稻立枯病的新型殺菌劑組合的制備方法及應(yīng)用技術(shù)。下面將結(jié)合實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。實施例1：枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌和惡霉靈的室內(nèi)毒力測定本實施例的目的是根據(jù)室內(nèi)毒力回歸方程計算出ec50值，根據(jù)ec50值確定藥劑施用濃度。具體步驟如下：采用菌絲生長抑制率法，對枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌、惡霉靈進(jìn)行室內(nèi)毒力測定。首先，制備枯草芽孢桿菌干粉：(1)枯草芽孢桿菌菌株的篩選及純化，一級平板lb固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，二級液體培養(yǎng)基馴化，三級液體培養(yǎng)基發(fā)酵。一級平板lb固體培養(yǎng)基配方：稱取胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g、瓊脂粉15g，加入到蒸餾水中，用蒸餾水定容至1l，再用naoh調(diào)節(jié)ph值到7.0；然后在121℃條件下高壓滅菌20min，待冷卻至50℃時，倒在培養(yǎng)皿中，得到一級平板lb固體培養(yǎng)基。二級液體培養(yǎng)基配方：稱取胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g，加入到蒸餾水中，用蒸餾水定容至1l，再用naoh調(diào)節(jié)ph值到7.0，然后在121℃條件下高壓滅菌20min，冷卻至室溫得到二級液體培養(yǎng)基。三級液體培養(yǎng)基配方：稱取胰化蛋白胨10g、牛肉膏3g、nacl5g，加入到蒸餾水中，然后用蒸餾水定容至1l，用naoh調(diào)節(jié)ph值到7.0；然后在120℃條件下高壓滅菌20min，冷卻至室溫后得到三級液體培養(yǎng)基。接種枯草芽孢桿菌菌株(上海魯微科技有限公司，菌種編號：atcc6633)于一級平板lb固體培養(yǎng)基上，接種量為固體培養(yǎng)基體積的1％，28℃條件下培養(yǎng)48h，然后將枯草芽孢桿菌菌落接入二級液體培養(yǎng)基，于28℃、150r/min條件下震蕩培養(yǎng)48h，測定濃度大于20億cfu/ml接入三級液體培養(yǎng)基，于28℃、150r/min條件下震蕩發(fā)酵培養(yǎng)48h，將離心產(chǎn)物用無菌蒸餾水制得菌懸液，濃度為100億cfu/ml，4℃保存。(2)將枯草芽孢桿菌菌懸液與質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1％的海藻酸鈉水溶液等體積混合，恒溫攪拌混合均勻；(3)稱取步驟(2)溶液2倍體積的大豆油，向大豆油中加入吐溫80，配置成吐溫80質(zhì)量百分含量為0.2％的溶液；然后于150r/min條件下震蕩10min；(4)將步驟(2)所得的溶液滴加到步驟(3)所得的溶液中，100r/min條件下震蕩10min；再向其中滴加質(zhì)量百分含量為4％的氯化鈣水溶液至無沉淀物析出為止，固化靜置30min；然后過濾出沉淀物，真空干燥后粉碎得到枯草芽孢桿菌干粉，枯草芽孢桿菌干粉活菌濃度為70億cfu/g。其次，制備哈茨木霉菌孢子粉：哈茨木霉菌菌株篩選、一級斜面培養(yǎng)、二級平板培養(yǎng)、三級固體堆積發(fā)酵。哈茨木霉菌三級培養(yǎng)全部采用pda固體培養(yǎng)基。pda培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15g、無菌水1000ml。將上述pda培養(yǎng)基120℃條件下高溫滅菌20分鐘后冷卻，倒入試管制備成一級斜面培養(yǎng)基。將哈茨木霉菌菌株轉(zhuǎn)入一級斜面培養(yǎng)基，30℃、暗環(huán)境下培養(yǎng)170h，然后轉(zhuǎn)接到二級平板培養(yǎng)；再于30℃、暗環(huán)境下培養(yǎng)170h，至哈茨木霉菌孢子以及菌絲全部覆蓋培養(yǎng)基為止，然后轉(zhuǎn)入三級培養(yǎng)瓶中進(jìn)行固體堆積培養(yǎng)，即在250ml培養(yǎng)瓶中加入100mlpda培養(yǎng)基凝固后使用接菌環(huán)接入哈茨木霉孢子進(jìn)行劃線，30℃、光照條件下培養(yǎng)至覆蓋培養(yǎng)基表面后使用玻璃棒將生長的哈茨木霉菌菌絲及孢子堆積到中心位置，重復(fù)3次堆積操作，測得哈茨木霉菌孢子粉濃度大于140億cfu/g后升溫至60℃維持5h，從而制得哈茨木霉孢子粉濃度大于120億cfu/g，4℃保存。利用發(fā)酵培養(yǎng)和制備的枯草芽孢桿菌干粉、哈茨木霉菌孢子粉及惡霉靈原藥使用無菌蒸餾水配置出五個濃度的藥液，分別為枯草芽孢桿菌藥液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0cfu/ml，哈茨木霉菌藥液0.1、0.3、0.5、1.0、1.2cfu/ml，惡霉靈藥液10、50、100、150、200μg/ml，重復(fù)3次試驗。實驗結(jié)果見表1。表1：枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌和惡霉靈的室內(nèi)毒力測定名稱毒力回歸方程r值ec50枯草芽孢桿菌y＝0.1819x+5.3010.96270.02億cfu/ml哈茨木霉菌y＝-1.1294x+3.360.99940.035億cfu/ml惡霉靈y＝1.5485x+2.87650.974625μg/ml從表1可以看出，枯草芽孢桿菌ec50為0.02億個cfu/ml，哈茨木霉菌ec50為0.035億cfu/ml，惡霉靈ec50為25μg/ml。為生物菌混配比例以及與惡霉靈的組合使用提供了理論基礎(chǔ)。實施例2：枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌與惡霉靈殺菌組合物可濕性粉劑的制備枯草芽孢桿菌干粉、哈茨木霉菌孢子粉的制備如實施例1，枯草芽孢桿菌干粉濃度為70億cfu/ml，哈茨木霉菌孢子粉濃度120億cfu/g、惡霉靈原藥濃度為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為99％。1、將制得的枯草芽孢桿菌干粉與哈茨木霉孢子粉，按照質(zhì)量比例為1：1使用恒溫攪拌機(jī)混勻，制備為菌劑母藥備用。2、按質(zhì)量和100％計算，依次稱取菌劑母藥60％、惡霉靈3％、硅藻土19.9％、萘磺酸鹽甲醛縮合物(d245)15％、羧甲基纖維素鈉(cmc-na)2％、l-抗壞血酸(vc)0.1％，混合均勻；3、殺菌組合物混勻后過標(biāo)準(zhǔn)400目篩后裝棕色瓶保存，從而制得復(fù)合微生物菌劑和惡霉靈的組合可濕性粉劑。經(jīng)平板菌落計數(shù)法測定所述的殺菌組合物可濕性粉劑中，有效成分枯草芽孢桿菌的含量為20億cfu/g、哈茨木霉菌的含量為35億cfu/g、惡霉靈≥25mg/g。實施例3：枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌與惡霉靈殺菌組合物的田間應(yīng)用試驗設(shè)計見表2。分別設(shè)計了三種不同的施用方式：葉面噴霧、土壤灌根、葉面噴霧和土壤灌根同時施用。施藥時期及施藥方式設(shè)定如下：土壤灌根是在水稻播種后，種子露白時進(jìn)行灌根1次。葉面噴霧是在水稻兩葉期時進(jìn)行葉面噴霧1次。施藥方式分為：灌根1次、噴霧1次、灌根與噴霧共2次施藥含量及濃度設(shè)定如下：單劑枯草芽孢桿菌的藥劑含量為40億cfu/g(本發(fā)明制備的枯草芽孢桿菌干粉加入載體硅藻土加工制成)，施用稀釋1000倍水溶液；單劑哈茨木霉菌的藥劑含量為70億cfu/g(本發(fā)明制備的哈茨木霉孢子粉加入載體硅藻土加工制成)，施用稀釋1000倍水溶液；單劑惡霉靈的藥劑含量為50mg/g(惡霉靈直接用水稀釋為需要濃度并加入藥液體積比為1％的吐溫80)，施用稀釋1000倍水溶液；殺菌組合物有效成分含量：枯草芽孢桿菌20億cfu/g、哈茨木霉菌35億cfu/g、惡霉靈25mg/g，施用稀釋1000倍水溶液；表2：殺菌組合物對立枯病田間試驗設(shè)計根據(jù)發(fā)病率以及相對防效計算公式如下：得出表3：田間試驗防效統(tǒng)計表表3：殺菌組合物對立枯病田間防效枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌與惡霉靈殺菌組合物的田間實驗結(jié)果見表3。從表3可以看出枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌與惡霉靈殺菌組合物以灌根和噴霧兩種方法相結(jié)合，防效均達(dá)到79％以上，而且最高可以達(dá)到83.23％；殺菌組合物可濕性粉劑中有效成分枯草芽孢桿菌含量為20億cfu/g、哈茨木霉菌含量為35億cfu/g、惡霉靈≥25mg/g。本發(fā)明在水稻育苗期間防治水稻立枯病期間防效最高達(dá)到了83.23％，稀釋1000倍液。其最佳的使用方法是兩次用藥，第一次在播種后，種子露白時使用藥劑灌溉。第二次在水稻2葉期時噴霧防治。實施例中其殺菌藥劑惡霉靈、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌的使用量減少了50％，為水稻育苗期間施藥方法提供了高效施用方法。以上所述僅為本發(fā)明示意性的具體實施方式，并非用以限定本發(fā)明的范圍。任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和原則的前提下所作出的等同變化與修改，均應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁12