本發(fā)明屬于在哺乳動物中臨床應(yīng)用的皮膚病制劑領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明提供了一種用于保護(hù)皮膚，預(yù)防或者治療皮膚感染的廣譜殺菌組合物或制劑，它結(jié)合了作為活性殺菌化合物的五水合銅鹽和七水合鋅鹽以。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述制劑包括塑化劑和潤膚劑以增強(qiáng)制劑對皮膚的附著作用。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，由于制劑在擠奶動物乳腺炎的預(yù)防和/或治療中的應(yīng)用，所述制劑在牛奶生產(chǎn)行業(yè)是有用的。
背景技術(shù)：
：牛乳腺炎是乳腺的炎性疾病，并且成為了全球擠奶行業(yè)所面臨的主要經(jīng)濟(jì)和生產(chǎn)問題之一。與此疾病相關(guān)的高成本源于它在動物健康和福利方面的影響以及由于在牛奶的生產(chǎn)和質(zhì)量上的影響而產(chǎn)生的在銷售盈利能力方面的影響。年度虧損包括抗生素治療、獸醫(yī)護(hù)理、銷毀和在牛奶生產(chǎn)方面的損失的費(fèi)用。牛乳腺炎是一種起始于微生物通過乳頭管孔入侵和定植的疾病，造成乳腺變得腫脹，導(dǎo)致牛奶的物理和化學(xué)性質(zhì)改變。細(xì)菌是牛乳腺炎所涉及的主要微生物，尤其是其中的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和乳腺鏈球菌。乳房內(nèi)感染造成兩種牛乳腺炎：臨床型和亞臨床型。對于乳腺和/或牛奶的臨床改變的臨床表現(xiàn)特征表現(xiàn)為感官改變(凝塊和黃色的形成)。在亞臨床型乳腺炎中，視覺癥狀是沒有的，但是牛奶樣本呈現(xiàn)出高的體細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此，根據(jù)Schukken，當(dāng)體細(xì)胞計(jì)數(shù)高于200,000細(xì)胞每毫升時(shí)，確定為牛乳腺炎，降低了牛奶的商業(yè)價(jià)值?？刂迫橄傺椎慕?jīng)典技術(shù)包括不同的策略，諸如在母乳喂養(yǎng)期結(jié)束后治療奶牛、擠奶技術(shù)、用外用抗菌物質(zhì)給乳頭消毒(預(yù)浸泡或浸泡)以及采用抗生素治療臨床型乳腺炎。眾所周知，奶牛乳頭皮膚永久暴露于環(huán)境污染；首先，這是由于對產(chǎn)奶奶牛的操作，即奶牛是在與受尿液和排泄物污染的牲口棚相同的牲口棚中放牧和睡眠。另一種形式的污染為實(shí)際的擠奶地點(diǎn)(擠奶房)；在這里，存在通過擠奶設(shè)備的高污染暴露，尤其是是與乳頭皮膚直接接觸的擠奶杯；在擠奶之前使用毛巾處理準(zhǔn)備奶牛，即在放置擠奶機(jī)之前干燥乳頭；以及擠奶工的手，所有這些因素都是動物間交叉污染的載體。因此，在完成擠奶過程之后有必要保護(hù)乳頭，通過應(yīng)用消毒產(chǎn)品持續(xù)大約5到6分鐘。在現(xiàn)有技術(shù)中，存在許多消毒產(chǎn)品，尤其是為乳頭和乳房定制的，并被稱為“乳頭藥浸”。這些產(chǎn)品中的許多為基于碘的化合物，即它們使用溶液中有7000到10000ppm碘的碘消毒劑。盡管采用此種碘溶液作為消毒劑，奶牛仍舊被污染和感染，當(dāng)由于通過擠奶杯提取牛奶造成的吮吸效果產(chǎn)生的乳頭括約肌仍處于開放狀態(tài)時(shí)，在擠奶之后，這樣的事情發(fā)生。對于牛奶產(chǎn)業(yè)，牛乳腺炎仍舊是一個(gè)世界性的問題。在乳頭管中形成的空間使得污染很常見，尤其是當(dāng)所使用的消毒劑在有機(jī)物的存在下變得失活而喪失有效性時(shí)，如在碘化合物的情況下。因此，有必要提高所使用的消毒劑溶液的質(zhì)量以便保護(hù)乳頭免受感染，所述溶液應(yīng)當(dāng)具有強(qiáng)殺菌力以便消除存在于乳頭皮膚的所有細(xì)菌和微生物，不被存在的有機(jī)物失活，并且以便在乳頭皮膚上持續(xù)具有活性直到下次擠奶。應(yīng)當(dāng)通過依附于皮膚和通過活性化合物的活性給予有效性。不好的依附會造成產(chǎn)品脫離皮膚，在這種情況下，由于機(jī)械缺陷，喪失了產(chǎn)品的所有有效性。本發(fā)明是在尋求解決此特定技術(shù)問題的方案的背景下提出的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：如以上所指出的，市場上有許多應(yīng)用到乳頭的基于碘和氯己定的產(chǎn)品。但是，這些產(chǎn)品存在許多限制，這使得有必要尋找新的方案以解決此問題。例如，基于碘的產(chǎn)品盡管沒有感染，但是它們刺激和干燥皮膚，并且它們的持續(xù)使用會造成乳頭損傷和流血。另一方面，碘和氯己定兩者在有機(jī)物存在時(shí)均會失活，并喪失它們的有效性。發(fā)明人已經(jīng)對這個(gè)問題研究了很長一段時(shí)間，這引導(dǎo)他們開發(fā)了一種用于保護(hù)皮膚的基于銅鹽的第一個(gè)殺菌產(chǎn)品。所述產(chǎn)品受申請CL1774-2012保護(hù)。此產(chǎn)品具有不因存在有機(jī)物而失活的優(yōu)點(diǎn)，并且它不刺激皮膚，雖然它的殺菌力并不是非常高，并且存在一些對采用此產(chǎn)品治療具有耐藥性的疾病。在現(xiàn)有技術(shù)中，我們還可找到治療皮膚問題的基于氧化銅和氧化鋅的混合物，申請CL3434-2012描述了該化合物。在所述混合物中使用的氧化物并不是水溶性的，并且不能預(yù)期的是，用作粒子分散體，非水溶性化合物的特性可以預(yù)期獲得有相同元素的水溶性鹽的結(jié)果。對于應(yīng)用在動物的乳頭上，制劑必須為液體，以便乳頭可以淹沒在其中并且進(jìn)而干燥形成覆蓋膜。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)，化合物必須為水溶性的，這在CL3434-2012中所描述的制劑中是沒有發(fā)生的，在CL3434-2012中所獲得的產(chǎn)品是膏狀的，而不是液體制劑。2004年3月25日的文件US2004058011(PETERSSONLENNARTG)涉及一種在擠奶間隔用于乳頭治療的制劑，所述制劑包括結(jié)合有非水溶性鋅化合物的氯己定；參見第11段：“鋅以下述材料形式存在：含鋅的、粒子的、精細(xì)分割的以及選自由以下形式組成的組的形式，包括硬脂酸鋅、氯化鋅、硝酸鋅、油酸鋅、氧化鋅、磷酸鋅、過氧化鋅、碘化鋅、鋅元素以及它們的組合”。附圖說明圖1.分離自牛奶樣品的細(xì)菌種類的分布。鑒定自臨床和亞臨床型乳腺炎的分離菌53和43分別從中央?yún)^(qū)域顯示。在南部區(qū)域，臨床和亞臨床型乳腺炎的分離菌174和93被分別鑒定。包括經(jīng)常被分離出來的其它微生物部分≦2％。圖2.用于分離自具有：A)牛亞臨床型乳腺炎(N＝227)和B)臨床型乳腺炎(N＝136)的牛奶樣品的微生物的根據(jù)本發(fā)明的組合物的MIC值的頻率。每個(gè)測定做了一式三份。圖3.根據(jù)本發(fā)明的組合物對臨床型牛乳腺炎中被鑒定的最高頻率的分離菌的MIC值的頻率。細(xì)分條塊代表對于牛乳腺炎的不同分離菌的MIC值(從0.25至0.5mg/L)的頻率的分布。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及一種殺菌制劑，所述殺菌制劑用于保護(hù)皮膚免受細(xì)菌感染，并且包括兩種活性殺菌化合物(五水合銅鹽和水合七鋅鹽)的組合。銅的抗菌效果是作為對預(yù)防乳腺炎的一個(gè)有利選擇，在其它皮膚病中，通過聯(lián)合使用鋅進(jìn)行強(qiáng)化。為了提升殺菌力和對有機(jī)物不會變得失活以及保持對皮膚無刺激，發(fā)明人研發(fā)本發(fā)明的組合物包括0.01％到10％的五水合銅鹽和0.01％到10％的七水合鋅鹽。如本說明書的實(shí)施例3中所示，新組合物通過完全控制細(xì)菌感染并消除所有在乳房中存在的細(xì)菌實(shí)現(xiàn)了預(yù)料不到的技術(shù)效果，使得在牛奶產(chǎn)品中沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌。根據(jù)上述內(nèi)容，顯示出本發(fā)明沒有在先前的現(xiàn)有技術(shù)中被預(yù)期。此外，毫無疑問本發(fā)明的優(yōu)選應(yīng)用是在擠奶動物的乳頭上面以預(yù)防或者治療皮膚感染。盡管如此，如實(shí)際上所示，本發(fā)明的制劑具有重要的殺菌特性；因此這在任何動物中，甚至是人類，預(yù)防或者治療任何種類的皮膚感染都是有用的。由于活性化合物的殺菌特征，本發(fā)明的制劑對預(yù)防或者治療任何種類的皮膚感染(無論是細(xì)菌、病毒還是真菌)都是有用的。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)這些水溶性銅和鋅鹽的組合物可以持久控制皮膚病原體感染。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑作為用于擠奶動物的乳房、擠奶間的洗浴，在乳房感染的治療和預(yù)防中是有效的。盡管有這種優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的制劑還可以應(yīng)用在任何類型的皮膚上來保護(hù)皮膚免受感染，如細(xì)菌、真菌或者病毒感染。可以應(yīng)用本發(fā)明的制劑以預(yù)防或治療任何皮膚感染。優(yōu)選地，五水合銅鹽對應(yīng)于五水硫酸銅，以及七水合鋅鹽對應(yīng)于七水硫酸鋅?？紤]到本發(fā)明化合物組合物的高殺菌特性，有可能以非常低的濃度的五水合銅鹽和七水合鋅鹽兩者化合物獲得有效的殺菌制劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的制劑具有0.01％至2％的五水合銅鹽和0.01％至2％的七水合鋅鹽。盡管有以上的內(nèi)容，有可能獲得兩種鹽的更加濃縮的制劑以便于制劑運(yùn)輸或者用于難治性感染的準(zhǔn)時(shí)應(yīng)用，其中這些濃縮制劑也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。濃縮的制劑能夠含有2％至10％或更多的每一種化合物；因此，本發(fā)明的范圍為0.01％至10％之間的五水合銅鹽和0.01％至10％之間的七水合鋅鹽。在準(zhǔn)備應(yīng)用到皮膚的優(yōu)選的本發(fā)明的制劑中，包括0.05％至1％的五水合銅鹽和0.05％至1％的七水合鋅鹽。并且，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，容易應(yīng)用到皮膚的本發(fā)明的制劑包括0.2％至0.4％的五水合銅鹽和0.05％至3％的七水合鋅鹽?？紤]到活性化合物的水溶性情況，本發(fā)明的制劑是水性的。這樣，制劑溶劑優(yōu)選為水，但是任何適于皮膚的親水溶劑都可以被使用。而且，本發(fā)明的制劑包括制劑輔料，所述制劑輔料選自粘度調(diào)節(jié)劑、保濕劑、潤膚劑、塑化劑和著色劑。這些輔料應(yīng)選自在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明時(shí)的現(xiàn)有狀態(tài)中任何可以獲得的那些輔料。盡管有以上內(nèi)容，以下為優(yōu)選的輔料。作為粘度調(diào)節(jié)劑或者稠化劑，優(yōu)選黃原膠，占組合物的0.2％至2％。作為潤膚劑和保濕劑，優(yōu)選甘油、山梨醇、丙二醇、聚乙二醇、蘆薈、羊毛脂和它們的混合物，其中潤膚劑和保濕劑占化合物的5％至30％。尤其地，組合物含有占化合物5％-12％的甘油。此外，在優(yōu)選的方式中，化合物包括占化合物3％至10％的山梨醇。如果制劑為用于在擠奶之間的乳房治療的化合物，重要的是所述制劑應(yīng)當(dāng)含有化合物附著到乳頭皮膚的塑化劑。聚乙烯醇特別優(yōu)選作為塑化劑，并且它占化合物的3％至10％，優(yōu)選化合物的5％至8％。著色劑的目的僅僅在于視覺識別化合物的應(yīng)用。著色劑占化合物的0.01％至0.5％。任何適于皮膚的著色劑都是合適的；但是，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可接受水平的著色劑優(yōu)選為食品添加劑，諸如Allura著色劑。本發(fā)明的制劑對制備適于預(yù)防或者治療皮膚感染的藥物是有用的。感染的治療或預(yù)防是通過在將要被保護(hù)的皮膚區(qū)域直接應(yīng)用含有本發(fā)明制劑的藥物，重復(fù)并間隔數(shù)小時(shí)或者數(shù)天實(shí)現(xiàn)的，這在皮膚將要被保護(hù)期間和/或直到感染消失。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑用于在擠奶之間覆蓋被擠奶的動物的乳頭皮膚。在對動物擠奶之后，乳頭淹沒在本發(fā)明的制劑中并且讓其干燥，在乳頭上形成保護(hù)膜。在這種情況下，制劑包括在皮膚上形成聚合物層的聚乙烯醇或者其它塑化劑，在皮膚上給予更好的保護(hù)盒殺菌活性組分的持久性。制劑的粘度同樣重要，因?yàn)槿绻苿┨后w的，它會在形成聚合物層之前脫落，而不能適當(dāng)?shù)馗街虼?，?dāng)制劑用于治療擠奶動物的乳頭時(shí)，采用黃原膠或者其它粘度調(diào)節(jié)劑稠化。當(dāng)采用本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案時(shí)，在乳頭皮膚上形成膜需要1至2分鐘以便充分密封乳頭皮膚。這種密封保持超過12小時(shí)，這為擠奶之間通常的時(shí)間段。在下一次擠奶之前，操作人員從乳頭上清洗掉化合物，以便使得化合物不會進(jìn)入牛奶中。這樣，擠奶動物的乳房的乳腺炎被預(yù)防或者治療。令人驚訝的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的制劑通常可治療持續(xù)的乳房感染，諸如那些非常普遍和難以控制的由金黃色葡萄球菌、鏈球菌和諾卡氏菌引起的乳房感染。自然地，本發(fā)明的制劑在預(yù)防和治療由任何其它現(xiàn)存的病原體(諸如無乳鏈球菌、牛鏈球菌、無乳鏈球菌性、鏈球菌屬、凝固酶陰性葡萄球菌、大腸桿菌或其它菌)引起的感染也是有用的。根據(jù)所做的敏感性測試，濃度低至0.5mg/L的根據(jù)本發(fā)明的組合物或者制劑能夠抑制不同細(xì)菌種類的生長，包括那些分離自臨床型和亞臨床型乳房炎的細(xì)菌種類。在這種情況下，制劑顯示出更高的頻率，甚至對抗生素耐藥性的菌株也是如此，例如新霉素、慶大霉素和頭孢噻肟。以下是一些本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案的示意性實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1：根據(jù)本發(fā)明的制劑制備為了制備一種本發(fā)明的制劑，操作在具有以1.5rpm永磁攪拌的食品級不銹鋼反應(yīng)器上，在50℃至60℃溫度的熱調(diào)節(jié)浴中進(jìn)行。在這種情況下，在60℃操作。針對所獲得的溶液或者制劑，所有濃度表示為重量體積百分比。處理是在兩個(gè)階段進(jìn)行。在第一階段中，如所指示的，以100升60℃軟化水起始所述處理。緩慢加入0.35％的五水硫酸銅鹽、0.15％的七水硫酸鋅、0.03％的Allura著色劑和0.4％的黃原膠，確保沒有團(tuán)塊形成?；旌衔镆?.5rpm攪拌保持30分鐘。在第二階段，溫度保持在60℃并以1.5rpm攪拌；首先將6％的聚乙烯醇緩慢加入到先前的混合物中，不要形成團(tuán)塊，然后加入8％的usp甘油，并最終加入5％的山梨醇。一旦所有制劑組分被混合，在2.5小時(shí)期間通過在相同溫度和轉(zhuǎn)速攪拌保持下使其均質(zhì)化。這賦予了準(zhǔn)備包裝的制劑穩(wěn)定性。在此實(shí)施例中獲得的本發(fā)明的制劑組分總結(jié)在了如下表1中。表1：根據(jù)本發(fā)明的制劑組合物的實(shí)施例組分重量/體積％五水硫酸銅0.35％七水硫酸鋅0.15％黃原膠0.4％Usp甘油8％山梨醇5％聚乙烯醇6％Allura著色劑0.03％Csp軟化水100％實(shí)施例2：本發(fā)明的化合物組分間的協(xié)同作用為了證實(shí)本發(fā)明化合物的優(yōu)點(diǎn)之一，在平板或抗菌譜上采用擠奶動物的乳房皮膚上最常見的細(xì)菌感染進(jìn)行細(xì)菌生長抑制測試。對此，金黃色葡萄球菌、乳腺鏈球菌和諾卡氏菌的克隆分別采用PCA培養(yǎng)法即非選擇性方法種植在瓊脂平板上，以便讓細(xì)菌在整個(gè)培養(yǎng)皿表面板上生長。每個(gè)細(xì)菌種植三塊板。稍后，在每塊板的中央，放置浸漬有將要分析的殺菌化合物的紙圈。然后，所有平板在37℃下孵育24小時(shí)。在每種情況下，測量抑制暈。結(jié)果顯示在表2中。表2：對每個(gè)活性殺菌組分的抑制暈正如在結(jié)果中可以清楚地看出的，本發(fā)明的化合物清楚地顯示出超出評估的替代化合物的優(yōu)點(diǎn)，銅和鋅的混合物要好于僅僅采用銅，并且更加好于目前最長使用的殺菌化合物碘。實(shí)施例3：實(shí)地測試將在實(shí)施例1中獲得的本發(fā)明的制劑作為乳房保護(hù)劑在擠奶間隔應(yīng)用到一組100只的奶牛，其中所述的一組100只的奶牛已經(jīng)預(yù)先接受了兩種不同的治療。該獸群已經(jīng)采用基于碘的商售化合物治療了數(shù)年，該獸群應(yīng)當(dāng)被視為初始情況，因?yàn)楸M管采用了基于基于碘的商售化合物治療治療，在牛奶中仍存在大量細(xì)菌并且乳房感染的程度高。稍后，該獸群采用本申請發(fā)明人的混合物進(jìn)行治療，所述混合物受申請CL1774-2012保護(hù)，僅含有五水硫酸銅作為活性化合物，其配方總結(jié)在表3中。表3：制劑組合物實(shí)施例組分重量/體積％五水硫酸銅0.5％羊毛脂2％黃原膠0.3％Usp甘油6％著色劑1％軟化水90.2％在大約一個(gè)月的期間內(nèi)，獸群采用表3中的化合物進(jìn)行治療，并且在牛奶罐里發(fā)現(xiàn)了一種重要病原體和體細(xì)胞減少。但是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一些感染是難以治愈的，因?yàn)樵谝粋€(gè)月(31天)的每日應(yīng)用之后他們?nèi)耘f持續(xù)存在。由于這種原因，研發(fā)了新的本發(fā)明的化合物，在25天期間內(nèi)所述新的本發(fā)明的化合物被應(yīng)用到同樣的獸群，用于在擠奶間隔的乳房保護(hù)。在經(jīng)過25天治療之后，分析罐中的獸群牛奶，并且實(shí)際上不存在可檢測的病原體。除此之外，發(fā)現(xiàn)奶牛的乳房是健康的。這些治療結(jié)果顯示在下表4中。表4：對每種類型的治療的細(xì)菌學(xué)分析正如可以看到的，本發(fā)明的組合物消除了牛奶中的細(xì)菌感染和環(huán)境病原體，并且因此所述牛奶中的體細(xì)胞也顯著地降低。有必要強(qiáng)調(diào)在0時(shí)刻(初始條件)，該獸群并不是沒有接受過任何治療的獸群，但是我們已經(jīng)說明了商售的基于碘的化合物被應(yīng)用以覆蓋乳房，如分析中所示，乳房上的許多感染和病原體轉(zhuǎn)移到了牛奶。首先，31天采用基于銅的化合物的治療能夠降低牛奶中總細(xì)菌到41.8％，雖然非常好，但是還不夠，然而本發(fā)明的基于銅和鋅的組合物將總細(xì)菌降低到了檢測線以下。實(shí)施例4：細(xì)菌菌株的流行程度的測定分析來自智利兩個(gè)地域的總共386份具有乳腺炎的牛的牛奶樣品。根據(jù)樣品的起源和牛乳腺炎的嚴(yán)重分級(亞臨床型的或者臨床型)，分離了總共363株具有不同流行程度的菌株。金黃色葡萄球菌(30％)在以草為基礎(chǔ)的生產(chǎn)的南部最多。用碘作為密封劑先對被分析的動物進(jìn)行了消毒。用于細(xì)菌菌群分離和鑒定的樣品以3,000rpm離心5分鐘，并在有氧或者無氧條件下播種到有選擇性和富集作用的培養(yǎng)基的板上，所述培養(yǎng)基如5％的McConkey瓊脂和羊血瓊脂，以便支持大多數(shù)兼性厭氧、需氧和維需氧細(xì)菌的良好生長。孵育之后，在革蘭氏染色后可疑的克隆在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行再培養(yǎng)。根據(jù)這些結(jié)果，對所述細(xì)菌進(jìn)行生化分析，如API20CAUX(Biomerieux),API20E(Biomerieux),APICoryne(Biomerieux)andCrystalBundesliga(BBL)以確認(rèn)初步微生物診斷。所有分離和鑒定的微生物儲存在-80℃直到稍后使用。相比中央?yún)^(qū)域，來自南部區(qū)域具有臨床型乳腺炎信號的牛奶樣品占總數(shù)的27％，在中央?yún)^(qū)域臨床型乳腺炎的樣品達(dá)到所接收的樣品的56％。根據(jù)微生物分析，出現(xiàn)了101(26％)個(gè)陰性培養(yǎng)物并且來自剩余樣品的總共363個(gè)微生物被分離(表5)。鑒定了微生物的高度多樣性，主要是在亞臨床型乳腺炎的牛中(圖1)。表5：牛奶樣品和分離的微生物的數(shù)量在中部區(qū)域的動物中，亞臨床型乳腺炎的樣品檢測以中樞神經(jīng)系統(tǒng)和乳腺鏈球菌為最常見的情況，分別在15(28％)和9(17％)。在臨床型乳腺炎的動物中，大腸桿菌(13,31％)被檢出頻率最高并且CNS被檢出頻率是第二最高。在此區(qū)域中無乳鏈球菌性僅在的臨床型乳腺炎的樣品中被鑒定。對于取自南部區(qū)域中的樣品，金黃色葡萄球菌、CNS和乳腺鏈球菌為流行的細(xì)菌，在臨床型和亞臨床型乳腺炎中均是(圖1)。當(dāng)將兩個(gè)地理區(qū)域中的分離自臨床型乳腺炎的細(xì)菌微生物叢進(jìn)行比較時(shí)，結(jié)果顯示大腸桿菌僅在中央?yún)^(qū)域被確定，而金黃色葡萄球菌僅在南部區(qū)域被確定。乳腺鏈球菌的分離頻率在南方區(qū)域相比于中央?yún)^(qū)域要大(分別為23％比5％)。此外，在亞臨床型和臨床型乳腺炎的樣品中確定的棒狀桿菌屬的分離菌在兩個(gè)區(qū)域具有類似的頻率。在中央?yún)^(qū)域，大腸桿菌為流行細(xì)菌(在臨床型乳腺炎中為31％)，這大概與該區(qū)域的牛約束系統(tǒng)相關(guān)。實(shí)施例5：本發(fā)明的組合物的最小抑菌濃度的測定在選擇性培養(yǎng)基中孵育386個(gè)具有乳腺炎的牛的牛奶樣品并通過生化分析鑒定菌群之后，通過采用瓊脂糖稀釋法測定最小抑菌濃度來評估所有分離菌對根據(jù)本發(fā)明的組合物的易感性。對抗生素的易感性也通過瓊脂糖稀釋法進(jìn)行測定。最小抑菌濃度(MIC)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)方法(CLSI2012a)通過瓊脂糖稀釋法測定。這樣，MuellerHinton(MH)瓊脂板補(bǔ)充有從0.03mg/L至1mg/L不同濃度的根據(jù)本發(fā)明的組合物。一夜培養(yǎng)物稀釋到1×106細(xì)胞/ml的濃度，且它們中的5μl采用微孔板復(fù)制器以斑點(diǎn)形式接種。每項(xiàng)試驗(yàn)執(zhí)行三次。根據(jù)本發(fā)明的組合物的MIC被限定為制劑的最低濃度，在所述濃度37℃的條件下微生物孵育一夜之后沒有出現(xiàn)生長。結(jié)果顯示出大多數(shù)分離的微生物在濃度為0,13mg/L(146/363)和0,25mg/L(92/363)時(shí)被抑制。其余的微生物在根據(jù)本發(fā)明的組合物的濃度在更大的范圍0,37mg/L-0,5mg/L之間時(shí)被抑制。細(xì)菌物種的行為顯然與牛奶樣品的起源沒有關(guān)系：注意到在臨床型和亞臨床型乳腺炎分離菌間的MIC值的頻率存在輕微的不同(圖2)?？偣?7(57％)個(gè)具有臨床型乳腺炎的分離菌顯示根據(jù)本發(fā)明的組合物的MIC值在0.25至0.5mg/L之間。相反，只有47個(gè)(21％)亞臨床型乳腺炎的分離菌需要所述范圍的組合物濃度來被消除。在臨床型乳腺炎的樣品中鑒定的最高頻率的分離菌的MIC值的頻率分布顯示在圖3。分離自臨床型乳腺炎的不同菌株的MIC值在0.37mg/L至0.5mg/L的范圍內(nèi)變化。其中11(39％)個(gè)金黃色葡萄球菌顯示更高的MIC(0.5mg/L)。超過一半的CNS和乳腺鏈球菌分離菌采用0.12mg/L或更少的根據(jù)本發(fā)明制備的組合物來抑制。實(shí)施例6：抗菌藥物敏感性測試評定以下抗菌藥物(OxoidLtd.Hampshire,英國)：·阿莫西林/克拉維酸(AMC)，·Trimethropin/磺胺甲惡唑(SXT)，·頭孢噻肟(CTX)，·慶大霉素(GN)以及·新霉素(NE)。依照由臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所指南(CLSI2012b)和BSAC標(biāo)準(zhǔn)((AndrewsandTrial2008)提供的建議，根據(jù)Kirby-Bauer盤法分析細(xì)菌標(biāo)本。在有氧環(huán)境中以35℃在MuellerHinton瓊脂糖板中孵育微生物18-24小時(shí)。作為質(zhì)量控制，采用了大腸桿菌(ATCC25922)和金黃色葡萄球菌(25923)。CLSI臨界點(diǎn)用于解釋所有微生物試劑的敏感性。為了確定新霉素(NE)的臨界點(diǎn)值，應(yīng)用了BSAC標(biāo)準(zhǔn)。抵抗抗生素的耐藥模式顯示245/363(67.5％)的分離菌同時(shí)對試驗(yàn)中的所有抗生素都敏感。在這些分離菌中，81/425(33％)為具有臨床型乳腺炎的牛奶樣品。亞臨床型的乳腺炎的分離菌與具有臨床型乳腺炎的人相比顯示出更低的耐藥性頻率。在中央?yún)^(qū)域，注意到CTX,AMC,Tet和NE抗生素在臨床型乳腺炎的分離菌中顯示超過10％的耐藥性頻率。在南部區(qū)域，只有AMC和NE滿足此條件。分離自臨床型乳腺炎的具有最高的抗抗生素耐藥性頻率的菌株顯示在表6中。分離自中央?yún)^(qū)域的大腸桿菌對測試的不同抗生素具有不同的耐藥頻率。特別地，7/13(54％)的分離菌對Ne耐藥，分離自在南部區(qū)域中的具有臨床型乳腺炎的牛奶樣品的乳腺鏈球菌顯示對氨基糖苷類GN和Ne高頻率耐藥性(43和52％)。一些乳腺鏈球菌的分離菌還對CTK耐藥(24％)。分離自中央和南部區(qū)域的金黃色葡萄球菌和CNS顯示出對幾乎所有測試的抗生素的低耐藥性。表6.具有較高頻率的臨床型牛乳腺炎的分離菌對抗菌藥物的耐藥性包括在本申請中的實(shí)施例為說明性特征，并且它們不限制如下權(quán)利要求所保護(hù)的本發(fā)明的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3