背景技術(shù)：

從谷物生產(chǎn)雜種種子對于種子公司、特別是對于所有類型的小麥、大麥和水稻來說是一個重大挑戰(zhàn)，但是由種子繁殖的任何其他作物(包括作物像黑小麥、燕麥、小米或黑麥)也可以受益于本發(fā)明。

雜種小麥可以通過使用一種用于雜交的化學(xué)試劑(CHA)獲得。雄株和雌株以條帶形式播種，經(jīng)常(但并非總是)雄株比雌株高以便促進更好的花粉傳播。一種CHA用于防止雌株上的花粉形成。商業(yè)上使用的唯一CHA是來自SAATEN-UNION的100。

以條帶或行形式播種的相同生產(chǎn)系統(tǒng)可以用于從使用遺傳性狀獲得的雄性不育(雌性)植株：細胞核雄性不育或細胞質(zhì)雄性不育與一種或多種恢復(fù)基因的使用組合來得到能育雜種種子。這些性狀可以由天然或GMO技術(shù)且由一種或幾種基因產(chǎn)生。

這兩種類型的系統(tǒng)意味著使用雄株和雌株的呈條帶或行形式的播種?？梢允褂貌煌壤⑶壹词剐壑陾l帶或行的面積小于雌株條帶或行，雌株的比例典型地也將不超過總植株的三分之二。此外，花粉傳播可能未進行優(yōu)化，并且收獲必須以防止花粉供體與雜種種子一起收獲的方式來進行。

在大麥中，一種雜種生產(chǎn)系統(tǒng)已由先正達公司(Syngenta)說明，其中播種95％雌性和5％雄性種子的一種簡單共混物。收獲物包含足夠的雜種種子以便符合雜種商業(yè)化的規(guī)定。此外，播種更高百分比的雄株應(yīng)該提高雜種種子的產(chǎn)率，但是這樣做也將增加雄性種子在所收獲的種子中的比例。此外，使用這種混合林系統(tǒng)生長雜種種子(其中95％的這些種子是雌性，如與其中例如僅三分之二為雌性的一種條帶生長系統(tǒng)中對照)應(yīng)該提高每單位面積的雜種種子生產(chǎn)率。

當雌株和雄株被播種到一種混交林時，收獲物包括在由雄性和雌性自花授粉種子進行授粉的不育雌株上生產(chǎn)的種子。從雜種生產(chǎn)中的父本中除去種子可以以幾種方式來實現(xiàn)。一種表型標記可以用于去除雄性自花授粉種子的全部或一小部分。在使用細胞質(zhì)雄性不育的雜種種子的生產(chǎn)中使用一種顏色標記在US 3,842,538中進行了描述。使用一種藍色種子標記在蒲宗君(Zong-Jun Pu)等人(2005)中進行了描述。關(guān)于在普通小麥中培育具有一種藍色種子標記的顯性細胞核矮雄性不育系的研究在小麥信息服務(wù)編號99:46-50中進行了描述。WO2012/038350描述了使用近紅外線來基于表型差異在雜種種子與純合種子之間進行選擇。一種系統(tǒng)如這些種子標記的使用意味著一種或多種相應(yīng)的表型標記基因滲入到所使用的遺傳物質(zhì)中。

矮敗小麥(Dwarf male-sterile wheat)以及它們在小麥輪回選擇中的使用在楊(Yang)等人，(2009)的論文：一種革命性小麥育種方法(Arevolutionary Breeding Approach to wheat)，舒Q.Y.(編輯)，基因組學(xué)時代的誘發(fā)突變(Induced Mutation in the GenomicsEra).聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(Food and agriculture organization of the United Nations)，羅馬，370-372頁中進行了描述。這種方法被命名為“矮敗小麥技術(shù)體系”。在這種方法中，以類似的方法播種的矮雄性不育植株與高大雄性植株的混合物具有更好的授粉在其他論文中給出，曹W.等人，2008年，一種與普通小麥(普通小麥(Triticum aestivum))中的雄性不育Ms2基因密切相關(guān)的分子標記(A molecular marker closely linked to the male sterile Ms2 gene in common wheat(Triticum aestivum))第11屆國際小麥遺傳學(xué)研討會會刊1-3頁，其報道如果將太古(Taigu)雄性不育基因Ms2克隆且與針對除草劑抗性的一種基因密切聯(lián)系，則在一種能育性恢復(fù)基因變得可用時它可以用于生產(chǎn)商業(yè)雜種小麥品種。

發(fā)明目的

仍然需要一種用于有效地生產(chǎn)雜種種子、尤其是谷物(包括小麥和大麥)的雜種種子的方法。

本發(fā)明的一個目的因此是提出一種允許以有效且有成本效益的方式生產(chǎn)雜種種子的新方法。

另一個目的是提出這樣一種方法，該方法允許在雜種性水平的監(jiān)管要求、特別是歐洲認證體系的那些監(jiān)管要求內(nèi)生產(chǎn)雜種種子，對于小麥、大麥、油菜、黑小麥和水稻該雜種性水平當前被設(shè)定在90％。

另一個目的是提出這樣一種方法，該方法允許以所使用的每單位土地良好或提高的產(chǎn)率有效地生產(chǎn)雜種種子。

另一個目的是提出這樣一種方法，該方法允許使用提高的雄性種子比例、具體地關(guān)于總親本種子的雄性不育種子高于5％的比例生產(chǎn)雜種種子。

仍然另一個目的是提出這樣一種方法，該方法允許與條播種子相比在收獲物中回收更少雄性種子，比方說相較于所播種的降低收獲物中雄性種子的比例。

發(fā)明概述

根據(jù)本發(fā)明的方法是基于使用比雌株(雄性不育)更高的雄性能育植株(產(chǎn)生花粉以用于雌性(雄性不育)植株的授粉)，這樣提供在這些雌性植株已經(jīng)被授粉之后通過一種基于機械和/或化學(xué)手段的易于實現(xiàn)的方法大規(guī)模破壞這些更高的能育雄性植株的可能性。此外，該方法影響比雌性植株更高的雄性植株的主分蘗和更高的次生分蘗，但是更矮的或次生分蘗也可以受雄性植株的化學(xué)處理影響，即使這些分蘗尚未與化學(xué)品直接相接觸。

該方法是基于使用能育雄性植株和雌性植株之間的高度差距，通過選擇比相應(yīng)雌性植株更高的雄性植株，包括例如在小麥中使用一種或多種rht基因突變，從而使得雌性植株比雄性植株更矮。雄性植株和雌性植株可以作為一種混合物播種，或以窄行或列條播，并且在開花之后，可以例如通過使用一個雜草抹藥機或一種等效的物理/機械裝置來選擇性地破壞雄性植株，無論是否與使用一種除草劑相關(guān)聯(lián)?？梢赃M行種子的一種另外選擇以便消除所生產(chǎn)的種子儲備中的不想要的雄性種子?！胺N子儲備”在本發(fā)明的背景下意指所收獲的種子的數(shù)量。

本發(fā)明因此涉及一種生產(chǎn)雜種種子、尤其是雜種谷物種子的方法，該方法包括使一片更矮的雌性(雄性不育)植株(比這些能育植株更矮)與一片更高的能育植株(比這些雌性植株更高)雜交。該方法包括限制最終生產(chǎn)的種子儲備中的自花受精的雄性種子的比例。限制自花受精的雄性種子比例包括在開花期(優(yōu)選開花期結(jié)束)與收獲期之間使一種工具至少一次在更矮雌性植株的高度上方、但在更高雄性能育植株的高度水平下方延伸。該工具旨在防止或減少矗立在此高度之上的這些雄性能育植株的正常發(fā)育。該工具接觸矗立在此高度之上的這些雄性能育植株并且造成防止或減少其正常發(fā)育。

本發(fā)明還涉及一種從含有一片更矮雌性(雄性不育)授粉的植株與一片更高雄性能育植株的田地生產(chǎn)雜種谷物種子的方法，該方法包括在開花期(優(yōu)選開花期結(jié)束)與收獲期之間使一種工具在這些更矮雌性植株的高度上方延伸，該工具將一種機械作用和/或一種化學(xué)品施加在這些更高雄性能育植株上，由此防止或減少矗立在該高度之上的這些雄性能育植株的發(fā)育。

該方法將最終生產(chǎn)的種子儲備中的自花受精的雄性種子的這種比例限制在一個閾值以下，優(yōu)選地在符合一種監(jiān)管雜種性水平的一個值以下。

具體地說，該方法限制在這些雌性植株授粉之后雄性植株上的種子發(fā)育以便降低或消除最終生產(chǎn)的種子儲備中自花受精的雄性種子的比例?？赡苌a(chǎn)的這些自花受精的雄性種子可以進一步在收獲期結(jié)束時消除或減少。此外，一部分雄性植株可以在收獲時(例如，在使用一種收割機時)與秸稈一起消除。

本發(fā)明還涉及一種工具(如施加一種化學(xué)品、優(yōu)選一種除草劑的一種雜草抹藥機)和/或一種化學(xué)品(例如除草劑，優(yōu)選為內(nèi)吸性的一種除草劑)用于防止或減少包括更矮雌性(雄性不育)植株和更高能育植株的田地中的這些更高能育植株在開花期(優(yōu)選開花期結(jié)束)與收獲期之間的正常發(fā)育以用于生產(chǎn)雜種種子、尤其雜種谷物種子的用途，其中在開花期與收獲期之間將該化學(xué)品(例如除草劑)至少一次施加到在這些更矮雌性植株的高度上方延伸的這些更高能育植株上。該工具是在授粉之后施加的。

本發(fā)明還涉及一種工具(如施加一種化學(xué)品、優(yōu)選一種除草劑的一種雜草抹藥機)和/或一種化學(xué)品(例如除草劑，優(yōu)選為內(nèi)吸性的一種除草劑)用于防止或減少包括更矮雌性(雄性不育)植株和更高能育植株的田地中在開花期(優(yōu)選開花期結(jié)束)與收獲期之間由能育植株進行的自花受精的種子的生產(chǎn)以用于生產(chǎn)雜種種子、尤其雜種谷物種子的用途，其中在開花期與收獲期之間將該化學(xué)品(例如除草劑)至少一次施加到在這些更矮雌性植株的高度上方延伸的這些更高能育植株上。該工具是在授粉之后施加的。

這些用途旨在將最終生產(chǎn)的種子儲備中的自花受精的雄性種子的這種比例具體地限制在一個閾值以下，優(yōu)選地在符合一種監(jiān)管雜種性水平的一個值以下。

該方法涉及生產(chǎn)雜種小麥，但不限于從兩種近交親本系生產(chǎn)雜種，該方法還應(yīng)該用于生產(chǎn)復(fù)合雜種：三交雜種(three way hybrid)、雙交雜種…

詳細說明

使雌性(雄性不育)植株與雄性能育植株雜交包括將兩種群體的種子緊密鄰近播種以便確保高水平的異花授粉。本發(fā)明的興趣之一是使得一種混合播種或近行播種或另一種播種方法“接近混合播種”成為可能，同時允許限制最終收獲物中的不想要的種子，同時甚至增加在雜交時能育植株與花粉可用性的比率。

在一個第一實施方案中，使雌性(雄性不育)植株與雄性能育植株雜交包括將這些種子作為一種混合物播種在該實施方案中，播種處于適當比例的雌性(雄性不育)植株和雄性能育植株的種子的一種混合物。

在一個第二實施方案中，使雌性(雄性不育)植株與雄性能育植株雜交包括將雌性(雄性不育)種子和雄性能育植株種子條播在單獨的行或列中。優(yōu)選地，將雌性(雄性不育)植株的種子和雄性能育植株的種子平行條播。作為一種替代，將雄性種子和雌性種子相繼播種在同一或“共同”行上。還有可能使用一種類型的若干行或列播種雌株和雄株，然后使用另一類型的若干行或列播種雌株和雄株，以此類推，其中若干被優(yōu)選地維持在一個較低水平下以便確?！熬o密鄰近”，具體地說由同一種子類型的2列或更多列組成。

限制來自雄性植株的種子儲備包括使一種工具在更矮雌性植株的高度上方、但在更高雄性能育植株的高度水平下方延伸。

在一個優(yōu)選的實施方案中，該工具將一種化學(xué)品(優(yōu)選除草劑)施加到這些更高雄性植株上或具有將一種化學(xué)品(優(yōu)選除草劑)施加到這些更高雄性植株上的一種裝置，優(yōu)選地通過與在這些更矮雌性植株的高度上方延伸的這些植株相接觸。在另一個實施方案中，該工具切割在這些更矮雌性植株的高度以上的這些更高雄性植株。作為舉例，利用一種“雜草抹藥機”，其是包括一個可移動的水平桿或支撐件的一種裝置，其優(yōu)選地是電動機驅(qū)動的或通過一個電動機驅(qū)動的車輛支撐的。放置該桿的高度優(yōu)選地是可調(diào)整的以便用于使用者將它的高度調(diào)整至這些植株的高度，優(yōu)選地能夠在行進通過一種作物時被改變。該桿或支撐件優(yōu)選地被設(shè)計成將一種化學(xué)品(優(yōu)選一種除草劑)遞送到與該桿或支撐件相接觸的這些植物上。例如，該桿或裝置包括一個輥子或刷子或一個繩子或一個海綿或一個葉片和/或類似物，并且一種化學(xué)品(優(yōu)選一種除草劑)被滴或浸漬到其上。適用于本發(fā)明或適于本發(fā)明的雜草抹藥機描述于文獻中，例如：CA 2 313 068、GB 2 305 590、US 4 485 588、WO 95/21524、WO 83/00601、EP 058 612、US 4 332 107、US 4 208 835、AU 2006203431。

一種替代可以是使用一種切割工具，例如具有非常高的切割水平的一種收割機以便特別地除去這些更高雄性植株，或例如使用一種玉米去雄機。該工具是可移動的，優(yōu)選地是電動機驅(qū)動的或通過一個電動機驅(qū)動的車輛支撐的。放置該切割工具的高度優(yōu)選地是可調(diào)整的以便用于使用者將它的高度調(diào)整至這些植株的高度，優(yōu)選地能夠在行進通過一種作物時被改變。

在一個實施方案中，該工具如該雜草抹藥機或該切割工具是電動機驅(qū)動的并且具有裝置來在行進通過一種作物時將該工具的高度自動地調(diào)整至這些植株的高度。這些裝置包括用于檢測這些雌性植株和/或雄性植株的高度的傳感器并且根據(jù)由這些傳感器恢復(fù)的數(shù)據(jù)來調(diào)整這些裝置的高度。

本發(fā)明中的種子可以作為具有5％或更多雄性種子、優(yōu)選約50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％雄性種子的一種混合物來播種。它們還可以條播于行或列中，同時遵循該比例。

在播種或雜交時雄性能育種子或植株對雌性(雄性不育)種子或植株的比例可以從約5％/約95％至約50％/約50％變化。通過使用精密農(nóng)業(yè)工具，該比例和其他參數(shù)如播種密度可以不斷適應(yīng)雜種生產(chǎn)田地以便根據(jù)土壤和其他環(huán)境數(shù)據(jù)確保最佳雜種種子產(chǎn)率。

本發(fā)明可以具體地應(yīng)用于谷物，具體地說燕麥、小麥、大麥、水稻、斯佩爾特小麥(spelt)、黑小麥、小米、黑麥、或油菜。本發(fā)明涉及自花受精的雜種谷物：燕麥(oat)(燕麥(Avena sativa)，包括拜占庭(byzantine)；裸燕麥(Avena nuda)；粗燕麥(Avena strigosa))、大麥(barley)(大麥(Hordeum vulgare))、水稻(稻(Oryza sativa))、小麥(wheat)(小麥(Triticum aestivum))、硬粒小麥(Triticum durum)(硬粒小麥(Triticum durum))、斯佩爾特小麥(spelt)(斯佩爾特小麥(Triticum spelta))、以及黑小麥(triticale)(黑小麥(Triticosecale))。本發(fā)明還可以涉及部分自花受精的植物，例如油菜(蕓苔屬)。

一旦這些雌性植株已足夠授粉或一旦這些雌性植株開花結(jié)束就可以使用該工具。該工具因此可以在這些雄性不育植株的開花期開始之后且優(yōu)選在開花期結(jié)束時或開花期后使用。它可以在這些種子的開花期與收獲期之間的任何時間使用。可以例如使用一種切割工具來進行一種機械消除并且該切割工具的作用是即時的，可以在開花期與收獲期之間的任何時間進行消除，然而，為了優(yōu)化該作物中的這些雌性(雄性不育)植株的發(fā)育，優(yōu)選在開花期之后盡可能早地進行該消除。一種化學(xué)品(例如除草劑)處理需要一些時間來影響植株，這樣使得施加時間在收獲之前取決于該化學(xué)品(例如除草劑)的作用速度、化學(xué)品(例如除草劑施加)的數(shù)量、天氣條件等被確定為有效的，并且再次，為了優(yōu)化該作物中的這些雄性不育植株的發(fā)育，優(yōu)選在開花期之后盡可能早地進行該化學(xué)品處理。一般來說，該消除(機械和/或化學(xué))將優(yōu)選地在開花期與開花期之后達30、20或10天之間施加。

所使用的除草劑是任何除草劑或在開花期開始之后或在開花期后且在上述條件下能夠通過所進行的施加或有效損害或終止植株生長和谷物的種子發(fā)育的任何其他化學(xué)品。優(yōu)選地，該除草劑是通過與植株的接觸作用進入植株的一種內(nèi)吸性除草劑。優(yōu)選地，該除草劑能夠在此發(fā)育階段殺死植株。作為一個實例，該除草劑是草甘膦或草銨膦，優(yōu)選地該除草劑是草甘膦。該除草劑可以施加一次或以若干施加(至少兩個，例如2或3)來施加。一種佐劑可以添加至該除草劑以便改進其效率，例如改進除草劑與植株的接觸，并且可以是有益的。因此，可以添加一種組分以用于改進除草劑到植株中的滲透性和擴散以使內(nèi)吸作用更有效地發(fā)生。

可以使用能夠破壞更高植株的其他組分，例如干燥劑。當已經(jīng)使用該工具一次或更多次時，可以進行這些存活雄性植株的一種另外的人工去除。

根據(jù)一種特征，限制來自自花受精的雄性植株的種子的比例進一步包括在收獲這些種子之后對這些種子的一種選擇以便除去自花受精的雄性種子，例如使用一種形態(tài)標準或特征如種子(具體地說早熟干燥的或皺縮的種子)的大小或密度或形狀或組成和/或一些其他方面和/或使用一種表型特征例如顏色進行選擇。這些早熟的或皺縮的種子可以來自除草劑的作用，具體地說但不限于由受除草劑影響但未完全破壞的分蘗產(chǎn)生的穗。來自雄株的次生分蘗也應(yīng)該獲得種子，如果它們的成熟期關(guān)于主分蘗足夠延遲，但這些種子應(yīng)該在收獲時未成熟：更小和/或更綠。雄性種子的這種消除可以使用任何已知的方法來進行。最容易的方式可以是在存在大小或其他方面的顯著差異的任何時候通過大小或密度分類并且這樣可以允許消除較小種子或皺縮的種子。

因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，在收獲之后，根據(jù)這些種子的大小或密度進行這些種子的一種選擇以便選擇根據(jù)它們的大小最大的種子或根據(jù)它們的密度更密的種子。這樣允許相較于該作物中的結(jié)實，提高所收獲的種子中雜種種子的比例。

根據(jù)一種特征，限制自花受精的雄性種子還包括使用與植株的雄性組和/或與植株的雌性組相關(guān)的一種表型標記，并且該標記分別單獨地使用抑或與大小或其他方面一起使用以便丟棄或保留由來自在雄性不育植株組上產(chǎn)生的雜種種子的植株的雄性組的自花受精產(chǎn)生的種子。

一種表型標記優(yōu)選地與植株的雄性不育組締合，并且該標記用于進一步丟棄由來自這些雜種種子的植株的自花受精授粉的雄性組產(chǎn)生的種子。

根據(jù)本發(fā)明的一個具體特征，雜交是用一種雄性植株進行的，該雄性植株是針對更好異花受精能力選擇的一種雜種植株。

雜種種子的認證要求至少給定百分比的收獲的種子來自異花受精而不是來自自花受精。因此對于小麥、大麥、油菜、黑小麥和水稻，歐洲認證的雜種商業(yè)化的雜種性限制當前是90％。如果假定，在一種經(jīng)典混合林木生產(chǎn)系統(tǒng)中，雄株的自花受精的頻率是雌株的異花授粉的兩倍，則這些雄性種子不應(yīng)超過所播種的總親本種子的一些5％以使所收獲的種子保持高于90％雜種性閾值。播種的雄性種子關(guān)于雌性種子的這種比例可以由于在開花期之后和收獲之前這些雄性植株的消除以及由植株的雄性組的自花受精授粉產(chǎn)生的種子的可能消除而增加。本發(fā)明的方法是通用的并且允許獲得具有希望百分比的不想要的雄性種子的一種收獲物，并且該值可以是例如在根據(jù)本發(fā)明處理收獲的種子之后關(guān)于總計收獲的種子約15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。

本發(fā)明的方法提供主要優(yōu)點來優(yōu)化在一種特定作物中、在一個特定區(qū)域或更一般地在關(guān)于受精和雜種種子生產(chǎn)和產(chǎn)率的預(yù)期結(jié)果情況下針對雄性和雌性近交系的一種特定組合中的這種雜種生產(chǎn)播種的雄性/雌性植株的比例。該方法允許具有一種更好的結(jié)實，這是由于雄株與雌株之間的緊密相鄰以及由于雄性植株與雌性植株之間的更有利的比例所致的良好花粉傳播。任何作物上的花粉密度應(yīng)該被改進為對防止來自外來花粉的外來授粉以及關(guān)于所收獲的種子儲備的純度的結(jié)果具有積極作用。另一種移除應(yīng)該是得到一種更容易的播種方案，因為使得播種雄性種子和雌性種子的一種混合物稱為可能并且這是比條播條帶更容易且最具成本效益的。另一個優(yōu)點是所產(chǎn)生的雜種將產(chǎn)生更多，因為它們包含更多的雜種種子，這些雜種種子比這些雄性種子進行更多。

用于本發(fā)明的方法的谷物系可以有利地是矮生植物、半矮生植物或雙矮生植物或另外并且在降低的或增強的高度的任何遺傳控制下。

兩組植株之間的高度差異允許優(yōu)化花粉從更高植株傳播至更矮組植株，雌株可以是更矮的；然而，也可以使用標準雌株和更高雄性植株，也可使用更矮雄株和甚至更矮雌株或產(chǎn)生一種高度差異和一種所希望的雜種產(chǎn)物的任何其他組合。此外，作為一種混合物播種防止更高雄性植株的負載。

一般來說，該高度差異應(yīng)該符合施加本身的技術(shù)要求并且可以被估計為潛在包括1米與10或20厘米或甚至更少之間。這些植株或一種作物的高度越均勻，所要求的高度差異可能就越小。這是5至20cm或甚至更小的一個高度差異也應(yīng)該符合本發(fā)明的原因。另一方面，可能不利的是產(chǎn)生了較大高度差異，以及使用過高的雄性植株，這是由于存在倒伏的風(fēng)險。因此，平均高度差異可以在從約5cm至約1m，具體地說從約10cm至約60cm，優(yōu)選地從約20cm至約50cm的范圍內(nèi)。

雄株與雌株之間的高度差異的產(chǎn)生和使用可以通過許多不同的方式來獲得，這些方式是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。在小麥中許多矮生和半矮生基因是已知的，例如：

○來自日本“農(nóng)林(Norin)10號”品種的Rht1(現(xiàn)在命名為Rht-B1b(4BS))和Rht2現(xiàn)在命名為RHT-D1b(4DS))，Rht1皮爾斯斯蒂芬(Pearce Stephen)(2011)，六倍體小麥中的Rht-1矮生基因的分子表征(Molecular Characterization of Rht-1 Dwarfing Genes in Hexaploid Wheat).植物生理學(xué)(Plant Physiol)，第157卷，第1820-1831頁。

○Rht1s(Rht-B1d)，來自埼玉(Saitama)27沃蘭德AJ(Worland AJ)和彼得羅維奇S(Petrovic S)(1988)，來自品種埼玉27的赤霉酸不敏感的矮生基因(The gibberellic acid insensitive dwarfing gene from the varietySaitama 27).荷蘭植物育種雜志(Euphytica)38:55-63.(Rht1的等位基因)。

○來自大拇指湯姆(Tom Thumb)的稱為Rht-B1c(4BS–Rht-B1b的等位基因)的Rht3，(參見克萊爾(Kleijer)等人(1984)，荷蘭植物育種雜志33 107-112)。

○來自品種“赤小麥(Akakomugi)”的Rht8(2DS)，加斯佩里尼(Gasperini)等人(2012)，面包小麥中Rht8的遺傳和生理學(xué)分析——具有對油菜素類固醇的降低的靈敏度的半矮稈的一種替代來源(Genetic and physiological analysis of Rht8 in bread wheat an alternative source of semi-dwarfism with a reduced sensitivity to brassinosteroids).實驗植物學(xué)雜志(Journal of Experimental Botany).第63卷12期第4419-4436頁。

○Rht9(7BS)，來自品種“赤小麥”，埃利斯M.H.(Ellis M.H.)等人，(2005)面包小麥中赤霉素應(yīng)答性矮生基因的分子作圖(Molecular mapping of gibberellin-responsive dwarfing genes in bread wheat).理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(Theoretical and Applied Genetics)，111:423–430。

○來自品種“太古”的稱為Rht-D1c(4DS)的Rht10，和泉N(Izumi N)等人，普通小麥中的矮生性的遺傳分析(Genetic analysis of dwarfness in Triticum aestivumm L).Ai_Bian 1，31，38-48(1983)。

○以及其他RHT4(2BL)、RHT5、RHT7(2A)、RHT12(5AL)、RHT13(7BS)、RHT14、Rht12。

但是矮生植株也可以通過經(jīng)由在植株育種群體中或從高度QTL(數(shù)量性狀基因座)或GMO(遺傳修飾的生物體)策略的一種聚合選擇較矮植株進行的簡單選擇來獲得。

在大麥中，影響植株高度的許多突變也是已知的，參見弗蘭克韋亞克(Franckowiak)等人，(1987)，關(guān)于半矮生大麥收集的協(xié)調(diào)人報告(Coordinator’s report on the semi-dwarf barley collection)，大麥遺傳新聞(Barley Genet News)17:114-115。最頻繁使用的矮稈基因是：

Ari-e GP；Uzu、Sdw1、Sdw3(2HS)哥特瓦爾德(Gottwald)等人，(2004)大麥的赤霉酸不敏感的矮生基因sdw3位于顯示與水稻染色體7L的高共線性的區(qū)域中的染色體2HS上(The gibberellic-acid insensitive dwarfing gene sdw3 of barley is located on chromosome 2HS in a region that shows high colinearity with rice chromosome 7L)，分子遺傳學(xué)和基因組學(xué)(Mol Gen Genomics)第4期，271:426-436，

矮生大麥也可以通過經(jīng)由在植株育種群體中或從高度QTL(數(shù)量性狀基因座)或GMO(遺傳修飾的生物體)策略的一種聚合選擇較矮植株進行的簡單選擇來獲得。

用于這種方案的系可以是無論怎樣產(chǎn)生的較矮植株或較高植株或矮生植株或半矮生植株或雙矮生植株并且在任何模式的遺傳控制下。本發(fā)明可以以一種不育矮系的產(chǎn)生開始。

基本上，該方法要求一種雌性(雄性不育)植株。用于產(chǎn)生這類植株的若干方法已經(jīng)進行了描述并且是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。

在小麥中使用細胞質(zhì)雄性不育(CMS)的一些方案描述于馬安(Maan)和盧肯(Lucken)(1972)，用于雜種小麥研究的相互作用雄性不育恢復(fù)系統(tǒng)(Interacting male sterility restoration Systems for hybrid wheat Research)，作物科學(xué)(Crop Science)第12卷，弗蘭克韋亞克等人，(1976)，關(guān)于利用粗山羊草細胞質(zhì)的雜種小麥的提議(A proposal for Hybrid Wheat Utilizing Aegilops squarrosa L.Cytoplasm)，作物科學(xué)，第16卷，第725-728頁。關(guān)于綜述，參見惠特福德(Whitford)等人，(2013)，小麥中的雜種育種：用于提高雜種小麥種子生產(chǎn)的技術(shù)(Hybrid breeding in wheat:technologies to improve hybrid wheat seed production)，實驗植物學(xué)雜志，在線2013年10月31日。

CMS的使用已經(jīng)用于在大麥中產(chǎn)生雜種：阿霍卡斯H.(Ahokas H.)(1998)，大麥，雜種栽培品種演化(Barley,Hybrid Cultivar development)：邦高(BANGA)，S.S.–邦高S.K.(編輯)，Narosa新德里，印度，第316-331頁。該系統(tǒng)使用兩種CMS細胞質(zhì)，已知的msm1和msm2。對于兩種不育基因Rfm1a(6H)的育性恢復(fù)是已知的。分別參見阿霍拉斯H.(Ahoras H.)(1979)大麥中的細胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility in barley).msm1細胞質(zhì)中不育的III維持和育性的恢復(fù)(III maintenance of sterility and restoration of fertility in the msm1cytoplasm)，荷蘭植物育種雜志(Euphytica)28，409-419；阿霍拉斯H.(1982)，大麥中的細胞質(zhì)雄性不育XI-msm2細胞質(zhì)(Cytoplasmic male sterility in barley XI the msm2cytoplasm)，遺傳學(xué)(Genetics)102:285-295；松井K.(Matsui K.)(2001)大麥(Hordeum vulgare L.)中細胞質(zhì)雄性不育的育性恢復(fù)基因座(Rfm1)的分子作圖(Molecular mapping of a fertility restoration locus(Rfm1)forcytoplasmic male sterility in barley(Hordeum vulgare L.))，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(Theor Appl Genet)，102:477-482。

雜種谷物的生產(chǎn)可以是基于遺傳雄性不育(GMS)并且要求在同一基因處對一種隱性gms等位基因為純合的一種雄性不育植株與對一種顯性GMS(即，野生型、正常、能育)等位基因為純合的一種雄性能育系的雜交。

使用GMS系統(tǒng)生產(chǎn)雄性不育植株的其他方式在谷物中存在。這些策略中的大多數(shù)是基于使用所謂的保持系(maintainer line)，該保持系在自花授粉時得到一定百分比的用于雜種生產(chǎn)的雌性(雄性不育)植株和一定百分比的保持植株，這些保持植株可以用于進一步生產(chǎn)不育植株。

在小麥中使用GMS可涉及：

○隱性ms1(4BS)

○來自帕格斯利(Pugsley)品種的ms1a，蘇內(nèi)索恩(Suneson)等人，在雜交育種中使用帕格斯利的不育小麥(Use of Pugsley’s Sterile wheat in Cross breeding)，作物科學(xué)2(6):534-535.，

○來自普羅布斯(Probus)突變體(電離輻射突變體)的ms1b，德里斯科爾CJ(Driscoll CJ)(1975)六倍體小麥中的兩種染色體雄性不育突變體的細胞遺傳學(xué)分析(Cytogenetic analysis of two chromosomal male-sterility mutants in hexaploid wheat).澳大利亞生物科學(xué)雜志(澳大利亞生物科學(xué)雜志)28:413-416，

○來自基石(電離輻射突變體)的ms1c，巴羅KK(Barlow KK)和德里斯科爾CJ(1981)涉及六倍體小麥中的兩種染色體雄性不育突變體的連鎖研究(Linkage studies involving two chromosomal male-sterility mutants in hexaploid wheat).遺傳學(xué)98:791-799，

○ms1d(FS2，EMS突變體)、ms1e(FS3)、ms1f(FS24)EMS突變體，來自克林德沃特(Klindworth)等人，六倍體小麥的四種突變體中遺傳雄性不育基因的染色體定位(Chromosomal location of genetic male sterility genes in four mutants of hexaploid wheat)，作物科學(xué)，2002，42(5):1447-1450，

○來自蘭州(Lanzhou)的ms1g(周KJ等人，(2008)，小麥(triticum aestivum L.)中的一種新的雄性不育突變體LZ(A new male sterile mutant LZ in wheat(triticum aestivum L).荷蘭植物育種雜志159(3):403-410)。

補償對雄性能育性的ms1作用可以涉及：

-來自黑麥屬谷物(Secale cereal L.)的5r(使用一種顯性可視標記(毛花梗(hairy pedoncule)，hp)，

-2RS，通過黑麥進行的小麥的基石雄性不育的育性補償(fertility compensation of Cornerstone male sterility of wheat by rye).候塞因MA(Hossain MA)和德里斯科爾CJ遺傳學(xué)1983年5月；104(1):181–189.，

-4E，參見周KJ(2006)的公開，生產(chǎn)雜種小麥的4E-ms系統(tǒng)(The 4E-ms system of producing hybrid wheat).作物科學(xué)46，250-255。

○顯性Ms2(4DS)Ta1，鄧(Deng)和高(Gao)，在小麥育種中使用一種顯性雄性不育基因(The use of a dominant male sterile gene in wheat breeding).中央研究院農(nóng)業(yè)氣象學(xué)學(xué)報(Acta Agrom Sinica)6:85-98(1980)；劉B.(Liu B.)等人，針對小麥中的雄性不育的一種顯性基因(A dominant gene for male sterility in wheat).植物育種(Plant Breed)97:204-209(1986).顯性Ms3(5AS)(雄性不育EMS突變體KS87UP9)馬安SS等人，針對小麥中的雄性不育的一種顯性基因的染色體臂定位和基因著絲點距離(chromosome arm location and gene centromere distance of a dominant gene for male sterility in wheat).作物科學(xué)27 494-500(1987)；

○顯性Ms4(4DS)，普通小麥中的第三顯性雄性不育基因(third dominant male sterility gene in common wheat)，馬安SS，吉安尼SF(Kianian SF)，小麥情報服務(wù)社(Wheat Information Service)，93:27-31；

○隱性ms5(3AL)(FS20，EMS突變體)，來自克林德沃特(Klindworth)等人，(六倍體小麥的四種突變體中遺傳雄性不育基因的染色體定位(Chromosomal location of genetic male sterility genes in four mutants of hexaploid wheat)，作物科學(xué)(CROP SCIENCE)，2002，42(5):1447-1450。

存在其他雄性不育系統(tǒng)，但不育是基于外部條件：來自郭(Guo)等人，2006(理論與應(yīng)用遺傳學(xué)112:1271-1276)的wptms1(5B)和wptms2(5B)以及來自陳(Chen)等人，(生物醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)(Biomed&Biotechnol))的Wptms3(1BS)是溫光敏感性的。

已經(jīng)在大麥中鑒別了許多基因或遺傳雄性不育基因，參見阿霍卡斯H.(1998)，大麥，雜種栽培品種演化(Barley,Hybrid Cultivar development)：邦高，S.S.–邦高S.K.(編輯)，Narosa新德里，印度，第316-331頁。

遺傳DNA標記可供用于這些突變中的大多數(shù)(如果不是全部)，但表型(即可視)標記也可用于追蹤例如補償一種gms基因的存在的等位基因。與藍色果皮或紅色相關(guān)的一些標記存在并且可以用于例如促進不育或能育種子的回收。

a-使用染色體附加系來補償基因雄性不育：

用于產(chǎn)生雜種的這種方法是最初在大麥中發(fā)展的，拉梅奇R.T.(Ramage R.T.)(1965，1991)，用于在雜種種子生產(chǎn)中使用的平衡三級三體(Balanced tertiary trisomics for use in hybrid seed production)，作物科學(xué)5:177-178。大麥育種中的染色體操作(Chromosome manipulation in barley breeding)，第18章，植物中的人色體工程：遺傳學(xué)、育種、進化(Chromosome Engineering in Plants:Genetics,Breeding,Evolution)，帕爾P.K.古普塔(par P.K.Gupta)，T.土屋(T.Tsuchiya)出版，第385-400頁。

在小麥中，使用附加系的第一實例描述于迪斯克羅爾(Discroll)(1972，1985，1986)的XYZ系統(tǒng)中，生產(chǎn)雜種小麥的XYZ系統(tǒng)(XYZ system of producing hybrid wheat)，作物科學(xué)12:516-517(1972)；產(chǎn)生雜種小麥的改良的XYZ系統(tǒng)(Modified XYZ system of producing hybrid wheat)，作物科學(xué)第25卷第1115-1116頁(1985)；雜種品種的種子生產(chǎn)中的細胞核雄性不育系統(tǒng)(Nuclear male sterility systems in seed production of hybrid varieties)，植物科學(xué)的CRC銳評(CRC Critical Reviews in Plant Sciences)，第3卷，第3期，第227-256頁；以及德里斯科爾(1986)。該系統(tǒng)是基于使用雄性不育的一種同源隱性突變和使用一種“恢復(fù)”系，該恢復(fù)系在根據(jù)XYZ系統(tǒng)的型式的一個或兩個拷貝中含有攜帶“恢復(fù)”基因的一個附加染色體。

補償染色體也可以包含一種表型標記，例如來自黑麥屬谷物的染色體5R的毛頸標記(hairy neck marker of the chromosome 5R from Secale cereal L).迪斯克羅爾(1972)，候塞因和迪斯克羅爾(1983)，通過黑麥進行的小麥的基石雄性不育的育性補償.遺傳學(xué)104:181-189。育性恢復(fù)基因的其他起源已經(jīng)在德里斯科爾(1985)中進行了測試，一種修飾的大麥染色體的烏拉爾圖小麥(Triticum urartu)Jakubz的α臂等臂染色體、染色體4或長臂等臂染色體(The alpha-arm isochromosome of Triticum urartu,Jakubz,Chromosome 4or the long arm isochromosome of a modified barley chromosome 4HmL)。

一種表型顏色遺傳標記可以被添加至先前描述的系統(tǒng)以便追蹤子代中的補償基因；該標記可以允許分離子代中的種子，如WO 92/01366中所描述。表型顏色標記可以是來自長穗偃麥草(gropyron elongatum)的染色體4的藍色糊粉(4g)，參見澤勒(Zeller)等人，(1991)，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)81(4):551-8；以及澤文A.C.(Zeven A.C.)，(1991)，具有紫色和藍色谷粒的小麥：綜述(Wheats with purple and blue grains:a review)，荷蘭植物育種雜志56:243-258。這種藍色標記被易位到4-顯性等位基因-來自沙達小麥(Triticum thaoudar)、單粒小麥(Triticum monococcum)或烏拉爾圖小麥的染色體上。該易位的染色體進一步用作XYZ系統(tǒng)中的一個附加染色體。

描述于周KJ等人(2006)，生產(chǎn)雜種小麥的4E-ms系統(tǒng)(The 4E-ms system of producing hybrid wheat).作物科學(xué)，250-255中的4E/MS系統(tǒng)使用具有“基因劑量效應(yīng)”和顯性野生型類似物MS1的一種附加系：攜帶來自冰草屬的基因Ba的藍色糊粉顏色的4E(長穗偃麥草)(博爾頓EF(Bolton EF)(1968)六倍體小麥中藍色糊粉和紫色果皮的遺傳(Inheritance of blue aleurone and purple pericarp in hexaploid wheat).博士論文(PhD diss.)科羅拉多州立大學(xué)(Colorado Stat Univ.)福特柯林斯(Fort Colins CO)，其補償雄性不育等位基因ms1的存在。

一種類似的系統(tǒng)已經(jīng)由黃S.S.等人(1991)開發(fā)，面包小麥中的一種藍色標記的細胞核雄性不育系及其保持系的演化(The development of a blue marked nucleus male sterile line and its maintainer in bread wheat)，中央研究院農(nóng)業(yè)氣象學(xué)學(xué)報17:81-87。

與不育相關(guān)的表型標記還可以被連接至植株大小基因，如一種rht突變。例如，藍色種子標記可以被添加至含有雄性不育的顯性Ms2基因和Rht-D1c(矮稈)的一個染色體。田(Tian)和劉(Liu)(2001).硬粒小麥和普通小麥中具有一種藍色種子標記的顯性細胞核雄性不育系的演化(Development of dominant nuclear male-sterile lines with a blue seed marker in durum and common wheat)，植物育種120，79-81。這種附加系的潛在用途在以下中進行了論述：蒲宗君等人，(2005).關(guān)于在普通小麥中培育具有一種藍色種子標記的顯性細胞核矮雄性不育系的研究，小麥信息服務(wù)編號99:46-50。

b-附加代換系的使用。

用于獲得雜種谷物的另一種方式在WO 92/01366中進行了描述。對于含有針對不育的隱性突變的4B以及含有藍色標記和恢復(fù)基因的附加易位的4染色體為純合的恢復(fù)系自花授粉以便獲得對于含有攜帶該隱性突變且無顏色標記的4B和含有該易位的染色體為純合的一種代換系2n。

一種衍生方案由以下描述：金(King)等人，(1991)，誘導(dǎo)優(yōu)先傳遞的沙融山羊草(Aegilops sharonensis)染色體4S的雄性不育基因中的一種突變及其用于雜種小麥生產(chǎn)的應(yīng)用(Induction of a mutation in the male fertility gene of the preferentially transmitted Aegilops sharonensis chromosome 4S and its application for hybrid wheat production)，荷蘭植物育種雜志54:33-39。

在WO 93/13649中，描述了在兩種4S染色體之間的交換之后由先前系產(chǎn)生的另一種育性恢復(fù)系。這種易位應(yīng)當在使用具有同源染色體的改變的配對的一種小麥突變體的情況下獲得,例如(ph1或ph2)，薩頓T.(Sutton T.)(2003)，植物雜志(The Plant Journal)36，443-456；埃布爾J.(Able J.)(2006).植物科學(xué)趨勢(Trends in Plant Science)，第11卷第6期；以及紹翁-林珍(Choon-Lin Tiang)等人(2012)，植物生理學(xué)(Plant Physiol)，第158卷，第26-34頁。

用于產(chǎn)生小麥雜種的其他不同的方式在WO 03/057848中進行了描述。

用于產(chǎn)生雄性不育植株或雌性植株的一些GMO策略描述于WO 2005/005641中(還參見惠特福德等人，(2013)小麥中的雜種育種：用于提高雜種小麥種子生產(chǎn)的技術(shù)，實驗植物學(xué)雜志，10月31日公開的預(yù)先訪問)。

本發(fā)明還可以使用更茁壯的一種雄性植株來實施，這樣使得雜種可以得到更好的授粉。該雜種雄株必須是不育雌株的完全恢復(fù)者。例如，如果該雌株不育是基于純合隱性ms(如在4E-ms中)，則該雄株需要是純合野生型。

如之前所解釋，雄性植株可能在收獲時仍然存在，并且所收獲的種子儲備可能仍然包括自花受精的雄性種子。表型標記或種子加工可以用于在收獲之后幫助除去那些不想要的種子并且提高商業(yè)產(chǎn)品中的雜種種子的水平。

例如，可以使用一種種子清選設(shè)備、種子篩選、一種種子分選機、一種重力分選臺、抽吸、一種齒槽分選機、一種光學(xué)種子分選機。例如，可以使用具有TGW(千粒重)的可感知差異的親本系，并且選擇可以在一種“佩特庫斯”分離器裝置上進行(US 8,502,019)。

另一個實例是使用紅色/白色谷粒顏色基因(謝爾曼J.D.(Sherman J.D.)等人(2008)：小麥中用于麥粒顏色基因的微衛(wèi)星標記(Microsatellite markers for kernel colour genes in wheat).作物科學(xué)，48:1419–1424)：小麥種子的紅色顏色通過在三種基因即R-A1b(在染色體3AL上)、R-B1b(在3BL上)以及R-D1b(在3DL上)中的一個或多個處的顯性等位基因控制(謝爾曼等人，2008)。存在這些紅色等位基因的一種“劑量效應(yīng)”：由一種種子攜帶的紅色等位基因越多，紅色顏色的強度就越高。白色顏色可以在3個基因座(r-a1b、r-b1b和r-d1b)處不存在紅色等位基因的情況下獲得。

紅色顏色是使用二倍體果皮組織的染色母系表達的。它意味著無論雜交是什么，這些F1種子都將具有與母本相同的顏色。取決于種子顏色和谷粒硬度，所產(chǎn)生的小麥籽粒以及從其碾磨的隨后面粉可以被定向到不同的市場類別中：紅色和白色籽粒的小麥是特定市場優(yōu)選的。

因此有可能通過使用這些雄性種子與雜種種子之間的種子顏色差異來將(如果不是全部)大多數(shù)這些雄性種子從一個雜種種子批中分選出來，例如：

·使用一種白色種子的雄性系(純合的r-a1b、r-b1b和r-d1b)和一種紅色種子的雌性系(純合的R-A1b、r-b1b和r-d1b/r-a1b、R-B1b和r-d1b/r-a1b、r-b1b和R-D1b/R-A1b、R-B1b和r-d1b/R-A1b、r-b1b和R-D1b/r-a1b、R-B1b和R-D1b或R-A1b、R-B1b和R-D1b)，這些雜種種子將是紅色的并且來自自花授粉的雄性種子將是白色的。

·使用一種紅色種子的雄性系(純合的R-A1b、r-b1b和r-d1b/r-a1b、R-B1b和r-d1b/r-a1b、r-b1b和R-D1b/R-A1b、R-B1b和r-d1b/R-A1b、r-b1b和R-D1b/r-a1b、R-B1b和R-D1b或R-A1b、R-B1b和R-D1b)和一種白色種子的雌性系(純合的r-a1b、r-b1b和r-d1b)，這些雜種種子將是白色的并且來自自花授粉的雄性種子將是紅色的。

·使用一種淡紅色種子的雄性系(純合的R-A1b、r-b1b和r-d1b/r-a1b、R-B1b和r-d1b/r-a1b、r-b1b和R-D1b)和一種暗紅色種子的雌性系(純合的R-A1b、R-B1b和R-D1b)，這些雜種種子將是暗紅色的并且這些自花授粉的雄性種子將是淡紅色的。

·使用一種暗紅色種子的雄性系(純合的R-A1b、R-B1b和R-D1b)和一種淡紅色種子的雌性系(純合的R-A1b、r-b1b和r-d1b/r-a1b、R-B1b和r-d1b/r-a1b、r-b1b和R-D1b)，這些雜種種子將是淡紅色的并且這些自花授粉的雄性種子將是暗紅色的。

第一雜種的下一代(F2)種子在任何情況下將是紅色的，因為這些雜種植株對于三種紅色基因中的一種將是純合的。

該種子分選可以使用能夠使白色種子與紅色種子分離或使淡紅色種子與暗紅色種子分離的任何常規(guī)光學(xué)分選機來實現(xiàn)。使用NIR針對這些顏色分選種子描述于王(Wang)等人，(1999)，通過使用近紅外反射光譜谷物化學(xué)進行的單粒小麥顏色分類(Single Wheat Kernel Colour Classification by Using Near-Infrared reflectance Spectra Cereal Chemistry)，第76卷，第1期。

種子還可以在一個特定篩網(wǎng)(例如2.8mm)上根據(jù)其大小進行分選以便除去最小的或皺縮的種子，這些最小或皺縮的種子通常具有比這些雜種更短的大小。

本發(fā)明現(xiàn)在將使用非限制性實例進行描述。

圖1是一個田間實驗的圖解。

實例1：小麥

為了產(chǎn)生所希望的高度差異，使用可供用于小麥中的矮生基因。使用一種雙矮生雌株Rht-B1b/Rht-B1、Rht-D1b/Rht-D1b(具有加性效應(yīng)的等位基因)與一種野生型雄株Rht-B1a/Rht-B1a、Rht-D1a/Rht-D1a的組合。優(yōu)選地，該野生型雄株不易于倒伏。優(yōu)先地，該Rht-B1b/Rht-B1a、Rht-D1b/Rht-D1a雜種被選擇為具有接近于一種商業(yè)品系(主要是Rht-B1b/Rht-B1b、Rht-D1a/Rht-D1a抑或Rht-B1a/Rht-B1a、Rht-D1b/Rht-D1b)的高度的一個中間高度。

測定在開花期后通過草甘膦施加進行的種子儲備減少

·關(guān)于不同基因型的田間測試

在開花期后，將5種歐洲冬小麥優(yōu)良系的植株通過向穗手動施加浸漬有120g/l的草甘膦溶液的一個刷子來進行處理(在英國被推薦用于雜草除去)。在完全成熟時，收獲處理的和未處理的植株的來自主莖以及來自分蘗的穗并且測定它們的能育性且將能育性表示為種子/小穗的數(shù)量比。對于5種優(yōu)良系中的每種，收獲來自未處理的植株的7至12個重復(fù)和來自處理的植株的20至24個重復(fù)。

如可以從上表中得出結(jié)論，來自未處理的植株的種子/小穗的平均數(shù)量(平均值)是1.93(標準偏差0.66)，并且來自處理的植株的穗的能育性是2.13(標準偏差0.58)。未處理的植株和處理的植株的結(jié)實無統(tǒng)計學(xué)差異。這一除草劑處理實驗未顯著降低所收獲的每穗種子的數(shù)量。

然而，相較于未處理的穗的這些種子，處理的穗的這些種子皺縮。這些皺縮的種子具有更小大小并且相對易于在收獲后種子加工期間除去。皺縮的種子不太可能發(fā)育成一個正常植株。來自處理的穗的平均78.2％的種子(120粒測試的種子/品系)是不可存活的(不發(fā)芽)，與之相比來自未處理的穗的15.0％的種子(60粒測試的種子/品系)是不可存活的。

·除草劑施加時間的溫室測試

在溫室中通過在4個以下發(fā)育階段用一個浸濕的防滴刷子將120g/l的草甘膦溶液施加至栽培品種Apache的植株的主穗來進行一個實驗：

·在開花期時的主穗(處理1)，

·在開花期后的主穗，但在開花期時無次生分蘗(處理2)，

·在開花期后的主穗，在開花期時一個或多個次生分蘗(處理3)，

·在開花期后的主穗，在開花期后一個或多個次生分蘗(處理4)，

將每次處理至少10個穗用草甘膦處理。收獲主穗(進一步稱為“來自主莖的穗”)以及來自分蘗的穗(進一步稱為“來自次生莖的穗”)并且將這些穗脫粒以便測定結(jié)實/穗。

如可以從以上表2中觀察到，對于這些未處理的穗(對照)，在主莖上19個穗上的平均結(jié)實/穗是34.2并且在次生莖上28個穗上的平均結(jié)實/穗是25.9。

對于用處理1處理的這些穗，在這些主莖的穗上未產(chǎn)生種子，并且次生莖的穗上的結(jié)實相較于未處理的處理對照大大降低(平均10.8對25.9)。

對于用處理2處理的(即僅在開花期后處理的)這些穗，這些主莖的穗平均僅產(chǎn)生由未處理的穗產(chǎn)生的結(jié)實的19.6％。那些種子中的大多數(shù)是皺縮的(60％)。這些次生分蘗上的遠非產(chǎn)生正常結(jié)實(14.2)。

對于用處理3處理的這些穗，這些處理的主穗的結(jié)實顯示接近正常的能育性，但僅產(chǎn)生皺縮的種子。次生分蘗上的這些穗顯示相對正常的能育性，但所產(chǎn)生的42.3％的這些種子是皺縮的。

對于用處理4處理的這些穗，在植株水平下在開花期后進行的草甘膦處理不會妨礙繁殖力，但在處理的主穗上，這些種子中的大多數(shù)是皺縮的(67.4％)。未處理的分蘗上的高結(jié)實可能是該植株內(nèi)部的營養(yǎng)物重新分布的作用。

該實驗的結(jié)論是在開花期后處理的每個穗能夠結(jié)實，但是那些種子中的大多數(shù)(67.4％)是皺縮的并且將會在種子加工期間被消除。草甘膦在植株內(nèi)部的擴散似乎影響同一植株上的一個未處理的穗的能育性，除非這些未處理的穗已經(jīng)達到開花期。因為用草甘膦處理將僅在整個植株將已經(jīng)終止開花時實施，所以未由該處理直接達到的每個穗應(yīng)該能夠產(chǎn)生大部分可存活的種子，但這些種子主要是皺縮的。即使未提供這些雄性種子的完全消除，使用草甘膦的一種開花期后處理也將顯著減少雄性種子儲備，從而使能提高該混合林木生產(chǎn)系統(tǒng)中的雌株/雄株比例。

產(chǎn)生可存活小植株的能力將在這些處理“未處理的”和“處理4”的種子的子集上進行測試。

已經(jīng)在優(yōu)良系A(chǔ)lixan上重復(fù)同一實驗。

一種模擬的混合林生產(chǎn)中的田間測試

實施了用于雜種生產(chǎn)的一種模擬測試。一種矮商業(yè)品種(Courtot，純合的Rht-B1b-Rht-D1b)(一種能育矮生品系)模擬《雌株》并且一種野生型高株商業(yè)品種(Alhambra，純合的Rht-B1a-Rht-D1a)(一種能育中等高品系)模擬《雄株》。這兩種品系具有類似的早熟性并且在播種時以以下比例混合：

·95％Courtot與5％Alhambra混合，

·90％Courtot與10％Alhambra混合，

·85％Courtot與15％Alhambra混合，

·80％Courtot與20％Alhambra混合，

包括分別具有100％Courtot和100％Alhambra的兩種對照。

圖1是田間實驗的一個圖解，每個框表示1.5m×6m的一個區(qū)塊或小塊土地，具有所播種的物種的描述：Courtot(僅播種Courtot種子)，Alhambra(僅播種Alhambra種子)，Courtot-AL-95/5(播種95％的Courtot與5％的Alhambra的一種混合物)，Courtot-AL-90/10(播種90％的Courtot與10％的Alhambra的一種混合物)，Courtot-AL-85/15(播種85％的Courtot與15％的Alhambra的一種混合物)，Courtot-AL-80/20(播種80％的Courtot與20％的Alhambra的一種混合物)。

圖例：在田地上的位置通過使小塊土地的在圖1上的左側(cè)的數(shù)字與在圖1的底部的數(shù)字交叉來給出：

-位于13-18/2、13-18/5、7-12/3、以及1-6/4處的小塊土地：無處理

-位于13-18/3、7-12/4、1-6/2、以及1-6/5處的小塊土地：1次處理

-位于13-18/4、7-12/2、7-12/5(在結(jié)果中未考慮的小塊土地)、以及1-6/3處的小塊土地：2次處理。

在收獲時，雌株上的結(jié)實被認為是實質(zhì)雜種種子。該實驗因此有點偏差，因為該實質(zhì)雜種結(jié)實是相當最優(yōu)的。用一個浸漬的海綿用單向施加(1次處理)或一種雙向(相反)施加(2次處理)將120g/l的草甘膦在開花期后施加在《雄性》植株上。對于根據(jù)圖1中所描述的田間實驗的每種條件進行四個重復(fù)。

結(jié)果在表3中：在具有單獨Alhambra的小塊土地上，觀察到一種中度至強倒伏，從而解釋降低的產(chǎn)率。相比之下，在Courtot-Alhambra小塊土地中未觀察到Alhambra的倒伏：Courtot充當一種支撐。雄株的倒伏易感性因此可以在一種混合林木生產(chǎn)系統(tǒng)中顯著降低。對Alhambra穗的處理(其結(jié)果是這些穗的結(jié)實減少)將這些混合的小塊土地中的產(chǎn)率限制至達51.8％(混合Courtot-AL-80/20，2次處理)。該結(jié)果指示雜種生產(chǎn)中雄性植株的百分比必須加以限制以便限制對雌株產(chǎn)率的影響。

表3：用單獨Courtot或Alhambra或courtot與Alhambra種子的混合物播種的小塊土地的產(chǎn)率結(jié)果。結(jié)果呈噸/公頃。降低％是在一次或兩次處理情況下播種的Courtot與Alhambra的一種組合關(guān)于無處理的相同條件的產(chǎn)率的降低。

Rht-B1b和Rht-D1b基因上的分子標記用于鑒別Courtot種子(表示模型中的雜種種子)和Alhambra種子(表示模型中的雄性種子)。對來自每塊單獨小塊土地的24粒種子進行了分析并且結(jié)果在表4中示出。

由于高株雄性植株相對于較矮雌性植株的會合，對比在無處理的條件下播種的量，相對于雌性種子數(shù)量，雄性種子數(shù)量幾乎翻倍。例如，在混合物“Courtot-Alhambra-90％/10％”中，Alhambra在播種時占這些種子的10％，但它們在收獲時的比例上升至19.7％。在無雄株部分破壞或消除的情況下，具有高株雄株的一種混合林木生產(chǎn)將是不可行的。一種雙重/雙向施加似乎比一種單一施加更有效。例如，在混合物“Courtot-Alhambra-90％/10％”中且使用一種雙向處理，收獲時Alhambra種子的比例被降低至2.2％，其轉(zhuǎn)換為97.8％的雜種性。在一種雙重/雙向施加的情況下，所收獲的批次的《雜種性》總是高于90％。

表4：對于每種種子混合物和每種處理，在播種時和在收獲時指示“雄性”種子(Alhambra)的百分比。實質(zhì)雜種性被計算為“雌性種子”(Courtot)在所收獲的批次中的百分比。處理0對應(yīng)于無處理的批次，處理1對應(yīng)于具有一次施加的一種草甘膦處理的批次，并且處理2對應(yīng)于具有一種雙向施加的草甘膦處理?！安シN”對應(yīng)于在混合播種中Alhambra種子的百分比，并且“收獲”對應(yīng)于在所收獲的種子中Alhambra種子的百分比。

實例2：大麥

除草劑施加的初步測試在2013年夏季進行，在那時使用一種雜草抹藥機將草甘膦以由提供商推薦的速率施加至更矮大麥批次中的高株大麥植株。觀察到可以在不損害相同批次上存在的半矮生大麥植株的情況下破壞高株大麥。

在高株植株和更矮植株的一種混合物上用一種切割工具進行相同實驗并且可以選擇性的切割這些高株植株。

還在兩種大麥品系(指定為基因型A和B)之間進行了一種雜種生產(chǎn)。使用一種分級裝置將所收獲的結(jié)實進行拌種。生產(chǎn)了具有較大種子大小的三種不同的種子等級：高于2.8mm、中等(即高于2.5mm)和小(即低于2.5mm)。這些種批的分子分析表明雜種種子主要在第一批中，具有更大種子大小。尚未分級的雜種種子的比例是72％，而在優(yōu)良2.8mm子樣品中雜種種子的比例是96％。

該實驗表明使用一種種子分選裝置能夠提高所收獲的種子批次中的雜種種子的比例。