干擾lcyb、lcye表達并超量表達crtiso在制備紅色花瓣蕓薹屬植物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了干擾LCYB、LCYE表達同時超量表達CRTISO在制備紅色花瓣蕓薹屬植物中的應用，還公開了干擾LCYB、LCYE基因同時表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO的植物表達載體及該植物表達載體的制備方法，通過干擾LCYB、LCYE基因表達抑制黃色類胡蘿卜素的生物合成，超量表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO促進全反式番茄紅素的積累，因而使花瓣顯紅色，成功制備了花瓣顯紅色的蕓薹屬植物，豐富了蕓薹屬植物的花色。
【專利說明】干擾LCYB、LCYE表達并超量表達CRT ISO在制備紅色花瓣蕓 薹屬植物中的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及干擾LCYB、LCYE基因表達同時超量表達 CRTISO基因在制備紅色花瓣蕓薹屬植物品種中的應用。

【背景技術】
[0002] 油菜是重要的油料作物，栽培歷史悠久、經濟價值高、用途廣泛、適應性強，是我國 的第一大油料作物，也是世界性的重要油料作物。物種分類學上，油菜由蕓薹屬的）三個 物種構成，分別為甘藍型油菜（Brassica napus，2n = 38, AACC)、白菜型油菜（Brassica rapa ssp. oleifera syn. B. campestris, 2n = 20, AA)、芥菜型油菜（Brassica juncea, 2n =36，AABB)。甘藍型油菜油菜是由白菜（Brassica rapa)與甘藍（Brassica oleracea， 2n= 18, CC)通過自然種間雜交后雙二倍化進化而來的一種復合種，雖然栽培歷史僅有幾 百年，但由于其生長勢強，豐產性高，已占世界及我國油菜種植面積90%的以上。白菜型油 菜是蕓薹屬最早被馴化的物種之一，原產于我國西北地區(qū)的大白菜演化而來，世界范圍內 有廣泛的分布面積和悠久的栽培歷史。芥菜型油菜是由白菜與黑芥（Brassica nigra，2n =16, BB)天然雜交后再自然加倍形成的雙二倍體復合種，中國是其原始起源與分化中心， 種植范圍遍布世界。
[0003] 隨著經濟水平的持續(xù)發(fā)展和社會現(xiàn)代化程度的不斷提升，大眾對生活品味的追求 也與日俱增，不僅傳統(tǒng)的名山大川式的旅游越來越火，田園休閑觀光產業(yè)的發(fā)展也很迅速。 油菜大面積生產上形成金黃色花的海洋，是越來越重要的田園生態(tài)旅游資源。油菜花觀賞 的時間為每年的十二月底到來年夏季。每個地方因為種植的時間略有不同，花期會有一點 差異。在我國已形成幾十個知名油菜花觀賞地區(qū)，油菜花開時，競相怒放、流金溢彩、綿延數(shù) 十里，好似金浪滔滔的海洋。
[0004] 自然界花舟顏色雖然種類繁多，但除芥藍（B. oleracea var. alboglabra)的花瓣 是乳白色以外，蕓薹屬植物的花瓣普遍為黃色系列，商業(yè)油菜品種全是黃色花瓣，過于單 調。隨著油菜花色田園生態(tài)觀光產業(yè)的迅猛發(fā)展，迫切需要多姿多彩的花色性狀，使之還可 以開出紅色、藍色等，在不影響油菜菜籽的出油率和其他傳統(tǒng)用途之外，增加其賞花價值， 助推生態(tài)觀光旅游。此外，特定的花色還是油菜育種界渴望的選擇標記性狀，而且花色的非 黃色化還有助于減少露尾甲等蟲害。因此，需要解析油菜花色性狀的分子機理，并開展新花 色的分子育種。
[0005] 蘿卜（Raphanus sativus)屬于蘿卜屬，近年來的分子證據表明蘿卜與白菜、甘藍、 甘藍型油菜的距離甚至遠小于黑芥與它們的距離，意思是說蘿卜與蕓薹屬核心物種的距離 小于蕓薹屬內部的種間距離。但另一方面，蘿卜能開出紅色系的花色，而蕓薹屬和眾多近緣 屬（如白芥屬）則只能開出黃色系的花。這是一個奇怪的現(xiàn)象，因此開展蕓薹屬與蘿卜花 色性狀的比較研究，不僅是這些生物花色性狀基礎研究的需要，也可為油菜等蕓薹屬植物 花色性狀的遺傳改良提供指導。
[0006] 重要觀花植物的花色分子機理和分子育種已取得顯著進展，為研究其它植物花色 機理和開展分子育種提供了重要參考。研究發(fā)現(xiàn)，花色主要由類黃酮（flavonoids)和類 胡蘿卜素（carotenoids)兩大類色素決定。類黃酮是最見的花色素，貢獻黃色、橙色、紅色 到紫色的一系列色系。類黃酮為水溶性物質，具有一個C15骨架，按結構主要分為9類： 查爾麗（chalcones)、澄麗（aurones)、異黃麗（isofIavonoids)、黃麗（fIavones)、黃麗 醇（flavonols)、黃燒雙醇（flavandiols)、花色苷（anthocyanins)、縮合單寧（condensed tannins,即原花青素，proanthocyanins)和縣酐（phlobaphenes)，它們中對植物著色貢獻 最大的是花色苷、黃酮醇、查爾酮和橙酮。其中花色苷是最大的一類黃酮物質，為花朵或其 它組織貢獻品紅、紅色、紫色、藍色等色調，積累于細胞的液泡或色素細胞中，黃色色調則由 查爾酮、橙酮、黃酮醇、黃酮提供。
[0007] 矮牽牛、玉米、金魚草、擬南芥等植物中的類黃酮生物合成途徑已被充分解析。它 是公共體丙烷生物合成途徑下游的一個重要分支途徑，苯丙烷途徑通過其它分支途徑合成 木質素、芪類、香豆素、植保素等多種次生物質。類黃酮途徑的第一步是由查酮合酶（CHS) 催化1分子P-香豆酰-CoA與3分子丙二酰-CoA縮合形成淺黃色的4, 2'，4'，6' -四羥基 查爾酮?；ㄉ张浠缣祗每?、矢車菊素、飛燕草素等是以查爾酮為底物，經羥化、還原、 氧化、側基修飾等幾步酶的催化反應而形成，依次涉及CHI (查爾酮異構酶）、F3H(黃烷酮 3-羥化酶）、F3' H(類黃酮3' -羥化酶）、F3' 5' H(類黃酮3'，5' -羥化酶）、DFR/FNR(二 氫黃酮醇4-還原酶/黃烷酮4-還原酶）、ANS (花青素合成酶）等。由F3' H和F3' 5' H 決定的花青素（anthocyanidins)的B-環(huán)上的輕基越多，則顏色越偏向藍色。通常情況下， 查爾酮和花青素被進一步修飾，如糖基化（糖基轉移酶，GT)、甲基化（甲基轉移酶，MT)、酰 基化（?；D移酶，AT)，然后轉運（谷胱甘肽S-轉移酶，GST)到液泡中貯存。在黃色金魚 草花的液泡中，查爾酮4' -0-葡萄糖苷被金魚草素合成酶（AS)轉變成亮黃色的金魚草素 (6-0-葡萄糖苷）。艷桐草等植物的橙色至紅色花朵中，黃烷酮經過幾步反應而合成3-脫 氧花色苷。此外，黃酮和黃酮醇也對花色起一定貢獻，它們?yōu)闊o色或淺黃色，可通過所謂共 色作用來促進藍色花色苷的形成和穩(wěn)定。黃酮和黃酮醇分別是以黃烷酮和二氫黃酮醇為底 物，在黃酮合酶（FNS)和黃酮醇合酶（FLS)的催化下合成的。除花青素外，黃酮醇、查爾酮 等其它類黃酮物質也可能涉及糖基化等修飾。
[0008] 模式生物的研究表明，類黃酮途徑結構基因的表達是被一個由R2R3_MYB(PAP、 PFG、TT2 等）、堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH，有 TT8、GL3、EGL3 等） 和WD40重復（WDR，有TTGl等）形成的轉錄因子復合物所調控的，該三元復合物調控了觀花 植物金魚草、矮牽牛、牽牛花、非洲菊和龍膽花的花瓣中花色苷著色的過程，調控行為受器 官、組織等體內信號和光、紫外線等外部信號所影響。擬南芥的研究表明，黃色調的黃酮醇 (苷）生物合成途徑的表達則由PFG基因特異調控，其中成員MYB11、MYB12、MYB111在器官 特異性上發(fā)生明顯分工。
[0009] 類胡蘿卜素（carotenoids)是脂溶性的紅色、橙色和黃色色素，嵌合在葉綠體和 有色體的膜中。類胡蘿卜素是C40-四萜類化合物，由C5-異戊二烯基礎單元合成而來，植 物、真菌、藻類和細菌均可合成，動物雖不能合成，但可從食物中攝入并用作色素和維生素 A 的前體物。類胡蘿卜素為許多花色貢獻了黃色色系，并單獨或與花色苷一道為玫瑰、菊花 等一些植物的花瓣貢獻了橙/紅、黃褐色和褐色色調。迄今，植物類胡蘿卜素生物合成途徑 的幾乎全部關鍵酶基因已被克隆和鑒定，整個途徑起始于質體中的C5的異戊二烯焦磷酸 (isopentenyl pyrophosphate, IPP)單元，據認為該途徑的有關酶之間形成復合物并結合 于質體膜上，4分子IPP縮合為1分子C20的香葉基香葉基焦磷酸（GGPP)，在八氫番茄紅素 合酶（PSY)的催化下2分子GGPP頭對頭地偶合成C40的無色的八氫番茄紅素，它是第一個 類胡蘿卜素。隨后，八氫番茄紅素脫飽和酶（TOS)和ζ-胡蘿卜素脫飽和酶（ZDS)向分子 中順序引入共軛雙鏈，先后形成無色的六氫番茄紅素、淺黃色的胡蘿卜素、橙黃色的鏈 孢紅素、紅色的番茄紅素。隨著共軛雙鏈數(shù)的增加，吸收波長向長波方向移動。脫飽和過程 中產生的一些順式構象被類胡蘿卜素異構酶（CRTIS0、Ζ-ISO)催化轉變?yōu)槿词綐嬒?。?茄紅素可被番茄紅素 β -環(huán)化酶（LCYB)或番茄紅素 ε -環(huán)化酶（LCYE)環(huán)化，這是該途徑的 一個分支點。除半結球萵苣等植物外，絕大多數(shù)植物中LCYE只能給番茄紅素加入ε-環(huán)， 合成黃色的含有1個β-環(huán)和1個ε-環(huán)的α-胡蘿卜素和其衍生物。β -和α -胡蘿卜 素可發(fā)生進一步的羥化或環(huán)氧化修飾，產生許多新結構。胡蘿卜素的加氧產物稱為葉黃質， β -環(huán)和ε -環(huán)的羥化過程分別由β -環(huán)羥化酶（CHYB)和ε -環(huán)羥化酶（CHYE)完成。PSY、 GGPS和LCYB存在花特異型和果實特異型，顯示存在一條有色體特異的類胡蘿卜素合成途 徑。玉米黃素環(huán)氧酶（ZEP)催化玉米黃素發(fā)生C5, 6和C5'，6'位的環(huán)氧化，形成黃色的花 藥黃質和紫黃質，它又可在新黃質合成酶（NSY)的催化下轉變成新黃質。9-順式-紫黃質 和9-順式-新黃質還可用于合成脫落酸（ABA)。
[0010] 類胡蘿卜素合成途徑的調控基因克隆還有待加強，但研究表明該途徑的調節(jié)主要 發(fā)生在轉錄水平上，受體內和環(huán)境因素影響，PSY是重要限速酶調控點，光信號通路參與對 類蘿卜素途徑的調控，而且類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCD)/NCED (9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜 素雙加氧酶）從分解的角度參與重要調節(jié)作用。此外，VDE(紫黃質脫環(huán)氧化酶）催化紫黃 質和花藥黃質轉化為玉米黃質。擬南芥AtRAP2. 2對特定組織中的類胡蘿卜素積累有弱的 促進作用，但最近研究表明它的功能主要是調控組織的耐缺氧存活能力。番茄DDBl和DETl 通過對光反應信號途徑的負調控而抑制類胡蘿卜素途徑，而甘藍OR(Orange)和番茄HSP21 則是通過調控有色體的形成而促進類胡蘿卜素的積累。
[0011] 此外，還存在第3類植物色素，即甜菜素（betalains)，是一類存在于液泡中 的水溶性生物堿，可分為紅紫色系的甜菜紅素（betacyanins)和黃色色系的甜菜黃素 (betaxanthins)，但甜菜素只發(fā)現(xiàn)于石竹目的10個科的植物和少數(shù)高等真菌中，其它植物 中還沒有發(fā)現(xiàn)，而且從未發(fā)現(xiàn)甜菜素與花色苷并存于同一種植物中。
[0012] 由于多數(shù)重要觀花植物的花色并不全，存在花色上的重要缺陷，因此花色分子育 種的代謝工程具有重要應用前景。但是包括油菜在內的整個蕓薹屬中，未見利用分子育種 的代謝工程改造油菜花色的報道。


【發(fā)明內容】

[0013] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE表達同時超量表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基因在制備花瓣 呈紅色的蕓薹屬植物品種中的應用；本發(fā)明的目的之二在于提供干擾蕓薹屬植物花瓣中 β-環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE表達同時超量表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基 因的植物表達載體；本發(fā)明的目的之三在于提供上述植物表達載體的制備方法；本發(fā)明的 目的之四在于提供利用所述植物表達載體制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種的方法。
[0014] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術方案：
[0015] 1、干擾蕓薹屬植物花瓣中β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE表達同時超 量表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基因在制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種中的應用。
[0016] 優(yōu)選的，所述干擾蕓薹屬植物花瓣中環(huán)化酶基因 LCYB、ε-環(huán)化酶基因 LCYE 表達的序列如SEQ ID NO. 2所示，所述超量表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基因的序列如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0017] 更優(yōu)選的，所述干擾蕓薹屬植物花瓣中β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE 表達的序列由擬南芥花瓣特異啟動子PAtAP3介導表達，所述花瓣特異啟動子PAtAP3的核 苷酸序列SEQ ID NO. 1第267位至第1044位所示。
[0018] 最優(yōu)選的，所述蕓薹屬植物為甘藍型油菜（Brassica napus)。
[0019] 2、干擾蕓薹屬植物花瓣中β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE表達同時超 量表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基因的植物表達載體，所述植物載體包括由花瓣特異啟 動子介導的表達β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE基因 RNA干擾序列的表達框和 由組成型啟動子介導超量表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基因的表達框。
[0020] 優(yōu)選的，所述花瓣特異啟動子介導表達β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基因 LCYE RNA干擾序列的表達框依次由花瓣特異啟動子PAtAP3、SEQ ID NO. 2所示的序列、間隔序列、 SEQ ID NO. 2所示的反向互補序列和NOS終止子組成。
[0021] 更優(yōu)選的，所述由組成型啟動子介導超量表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基因的 表達框依次由CaMV35S啟動子，SEQ ID NO. 3所示序列和NOS終止子組成。
[0022] 3、所述植物表達載體的制備方法，包括如下步驟：將SEQ ID NO. 1所示序列 經AscI和SwaI雙酶切后連入經同樣酶切的pFGC5941M質粒，得pFGC5941CEPE質粒， 然后將SEQ ID NO. 2所示的序列連入pFGC5941CEPE載體的PAtAP3啟動子與間隔序列 之間，形成中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia，再將SEQ ID NO. 2所示序列反向連入中間 載體 pFGC5941CEPE-B2RNAia 的間隔序列與 OCS 終止子之間，得 pFGC5941CEPE-B2RNAi 載體，最后將SEQ ID NO. 3所示序列通過NcoI和AscI酶切位點連入經同樣酶切的 pFGC5941CEPE-B2RNAi載體，得干擾蕓薹屬植物花瓣中β -環(huán)化酶基因 LCYB、ε -環(huán)化酶基 因 LCYE表達同時超量表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基因的植物表達載體。
[0023] 優(yōu)選的，所述間隔序列為甘藍型油菜ΡΑΡ2基因第2內含子。
[0024] 4、利用所述植物表達載體制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種的方法，包括如下步 驟：
[0025] a.將所述植物表達載體轉化農桿菌，制得工程菌；
[0026] b.將步驟a所得工程菌轉化蕓薹屬植物無菌苗的下胚軸，共培養(yǎng)后，在Basta除草 劑抗性下誘導分化獲得再生苗，篩選陽性苗轉基因苗得花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種。
[0027] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過研究油菜等蕓薹屬核心物種及蘿卜花色機 理，明確了黃花、白花、紅花之間的關鍵性差異表達基因位點，由此本發(fā)明利用花瓣特異啟 動子在蕓薹屬花瓣中干擾類胡蘿卜素合成的關鍵基因 LCYB和LCYE的表達，從而抑制花瓣 中黃色類胡蘿卜素的積累，通過超量表達合成反式番茄紅素的關鍵基因 CRTIS0,使花瓣中 積累大量反式番茄紅素，僅通過對類胡蘿卜素途徑的代謝工程修飾就獲得花瓣呈紅色的蕓 薹屬植物新品種。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0029] 圖1為蕓薹屬和蘿卜花瓣的顯微觀察結果（A :甘藍型油菜（BnY) ;B :甘藍型油菜 (BnW) ;C :芥菜型油菜（BjY) ;D :白菜型油菜（BrY) ;E :甘藍（BoY) ;F :芥藍（BoW) ;G :蘿卜 (RsR))〇
[0030] 圖2為DFR、TT8、GL3、EGL3在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達（A為DFR在蕓 薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達；B為TT8在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達；C為 GL3在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達；D為EGL3在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異 表達；BnYPe :甘藍型油菜黃花瓣；BnWPe :甘藍型油菜白花瓣；BjYPe :芥菜型油菜黃花瓣； BrYPe :白菜型油菜黃花瓣；BoYPe :羽衣甘藍黃花瓣；BoWPe :芥藍白花瓣；RsRPe :蘿卜紅紫 花瓣）。
[0031] 圖3為0R、(XD1在蕓薹屬花瓣和蘿卜花瓣間的差異表達（A為OR在蕓薹屬花瓣和 蘿卜花瓣間的差異表達；B為CCDl在蕓薹屬花瓣和蘿卜花瓣間的差異表達；BnYPe :甘藍型 油菜黃花瓣；BnWPe :甘藍型油菜白花瓣；BjYPe :芥菜型油菜黃花瓣；BrYPe :白菜型油菜黃 花瓣；BoYPe :羽衣甘藍黃花瓣；BoWPe :芥藍白花瓣；RsRPe :蘿卜紅紫花瓣）。
[0032] 圖 4 為 N0S-PAtAP3、B2RNAi 和 BnCRTISOIPCR 擴增結果（A :N0S-PAtAP3 ;B : B2RNAi ；C ：BnCRTIS01) 〇
[0033] 圖5pFGC5941CEPE和pBLycoRF3載體構建過程中酶切結果（A :AscI和SwaI 雙酶切 PFGC5941M ;B :AscI 和 SwaI 雙酶切 pMD19-T-N0S-PAtAP3 ;C :SwaI 和 AatI 雙酶 切 PFGC5941CEPE ;D :SwaI 和 AatII 雙酶切 pMD19-T-B2RNAi ;E :BamHI 和 XbaI 雙酶切 pMD19-T-B2RNAi ;F :BamHI 和 XbaI 雙酶切 pFGC5941CEPE-B2RNAia ;G :NcoI 和 AscI 雙酶切 pFGC5941CEPE-B2RNAia ;H :NcoI 和 AscI 雙酶切 pMD19-T-BnCRTIS01)。
[0034] 圖6為pBLyc〇RF3轉化甘藍型油菜結果（A :野生型甘藍型油菜；B :轉基因陽性植 株）。

【具體實施方式】
[0035] 下面將結合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0036] 本發(fā)明實施例采用的植物材料：甘藍型油菜黃花瓣（中雙9號品種）、甘藍型油菜 乳花瓣、白菜型油菜黃花瓣（6Y733品系）、芥菜型油菜黃花瓣（CNG12011品系）、羽衣甘藍 (B.oleracea var.acephala ftricolor，K10-3 品系）黃花瓣、芥藍變種白花瓣（R9057 品 系）、蘿卜紅花瓣均取自西南大學重慶市油菜工程技術研究中心歇馬基地的常規(guī)試驗植株。 擬南芥（Arabidopsis thaliana，Columbia野生型）種子購自國際擬南芥中心，種植于室內 人工氣候室。
[0037] 實施例使用的試劑及試劑盒如下：PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、SYBR? Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus) ROX plus、 DNA Ligation Kit、pMD19_T、Taq DNA 聚合酶、DNase I (RNase-free)及 buffer、RNase Inhibitor、DL-2000及λ-HindIII DNA Marker購自大連寶生物（TaKaRa)生物工程有限公 司；RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產品；膠回收 試劑盒、小量法質粒抽提試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司；限制性內切酶購自立陶 宛MBI Fermentas 公司；MS (Murashige&Skoog medium, including vitamins)培養(yǎng)基為荷蘭 Duchefa公司產品；DL_2000plus、Easy-Taq酶、dNTPs等試劑購自北京全式金（Transgen) 生物技術有限公司；X -Gluc (5-brom〇-4-chlor〇-3-indolyl-β -D-glucuronic acid)、利福 平（Rif)、鏈霉素（Str)、卡那霉素（Kan)、氨芐青霉素（Amp)、瓊脂糖、Tris、CTAB、Tris飽和 酚（pH = 8. 0)、Tryptone、Yeast Extract、X-gal、IPTG、CTAB 等其它生化與分子生物學試 劑購自上海生工生物工程技術服務有限公司；植物激素購自上海稼豐園藝用品等公司。
[0038] 本發(fā)明中使用的pFGC5941M質粒由甘藍型油菜（Brassica napus)PAP2基因第2內 含子（BnPAP2I2)的新型間隔區(qū)取代了 pFGC5941的原有PhChsA間隔區(qū)，并在新間隔區(qū)與啟 動子之間的多克隆位點處新增了一個Aat II切點（其具體改造過程參見馬麗娟.馮瑜.江 麗萍.申敏.柴友榮；PFGC5941的改造及蕓薹屬透明種皮1基因（TTl)家族RNA干擾載體 構建.農業(yè)生物技術學報，2010年，第18卷，第6期，第1189?1196頁）。
[0039] 實施例所用PCR引物合成和測序由上海英駿/英濰捷基公司、上海生工、北京六合 華大等公司商業(yè)完成。
[0040] 實施例1、蕓薹屬和蘿卜花瓣顯色亞細胞器的顯微觀察
[0041] 分別采取新鮮的甘藍型油菜黃花瓣（BnY);甘藍型油菜乳花瓣（BnW);芥菜型油菜 黃花瓣（BjY);白菜型油菜黃花瓣（BrY);羽衣甘藍黃花瓣（BoY);芥藍白花瓣（BoW);蘿卜 紅花瓣（RsR)，放在冰面冷鮮保存運回實驗室，然后徒手切片，用低倍鏡觀察快速篩查，挑選 合格切片進行仔細觀察與照相，結果如圖1所示。結果顯示，蕓薹屬幾個物種的黃花瓣中顯 黃色的物質在一個細胞中呈現(xiàn)為眾多小顆粒狀，不均勻地分布于細胞內，被液泡擠壓到貼 壁的位置，說明黃色花瓣中顯色細胞器為有色體，其色素為黃色類胡蘿卜素。甘藍型油菜乳 花瓣中也有一些細胞擁有淺黃色有色體，但總體數(shù)量少且細胞間不一致，芥藍白花瓣中幾 乎看不到有色體，說明是有色體的減少或消失導致其黃色變淺或消失。蘿卜花瓣中紫紅色 色素均勻分布于每個細胞的中央位置，越是中央越濃，越偏離中央越淡，說明蘿卜花瓣的顯 色亞細胞器為液泡,顯色物質為花青素苷。
[0042] 實施例2、檢測蕓薹屬和蘿卜花瓣色素
[0043] 在盛花期早晨分別取剛開放的甘藍型油菜黃花瓣（BnY);甘藍型油菜乳花瓣 (BnW);芥菜型油菜黃花瓣（BjY);白菜型油菜黃花瓣（BrY);羽衣甘藍黃花瓣（BoY);芥藍 白花瓣（BoW);蘿卜紅花瓣（RsR)，立即陰涼保鮮運回實驗室，50?60°C烘干，研成粉末后過 60目篩，避光干燥保存。
[0044] 1、石油醚、鹽酸和氨水測試結果
[0045] 稱取保存的花瓣粉末0. 100g，分別放入編有號碼的具塞試管中，分別加入石油醚、 10 %鹽酸、30 %氨水各約10mL，輕輕混勻，過濾，觀察顏色變化，結果如下：
[0046] (1)石油醚反應：甘藍型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜都表現(xiàn)出亮黃色，表明類 胡蘿卜含量的含量高；羽衣甘藍表現(xiàn)出淺黃色，說明其含有少量的類胡蘿卜素；而芥藍和 蘿卜花表現(xiàn)出無色，表明不含類胡蘿卜素。
[0047] (2)鹽酸測試：只有蘿卜紅花瓣表現(xiàn)出粉紅色，說明含有花青素苷，而甘藍型油 菜、白菜型油菜、芥菜型油菜花瓣表現(xiàn)出不同程度的黃色，說明含黃酮（醇）而不含花青素。 芥藍白和羽衣甘藍表現(xiàn)近無色，說明不含有花青素，而且黃酮（醇）也很少。
[0048] (3)氨水測試：蕓薹屬各材料均表現(xiàn)出不同程度的黃色，說明其含有或多或少的 黃酮（醇），而蘿卜花表現(xiàn)出的黃綠色，該顏色是由花色苷呈現(xiàn)的藍色和類黃酮呈現(xiàn)的黃色 混合而成，但所有材料均不表現(xiàn)橙紅色或紅色，說明不含橙酮。
[0049] 2、類黃酮的顯色反應
[0050] 取保存的花瓣粉末0. l〇〇g，用甲醇提取24h，過濾，定容至50mL，各取2mL提取液， 然后進行下列顏色反應，觀察顏色變化。
[0051] (1)濃鹽酸-鎂粉反應：加入少量鎂粉，再后加入濃鹽酸5滴，輕輕搖勻，靜置lh。 結果顯示，甘藍型油菜、芥藍顯示無色，可能含有查爾酮、橙酮；甘藍型油菜、白菜型油菜、芥 菜型油菜顯示極淡紫紅和微紫紅，說明不含查爾酮、橙酮和兒茶素，可能含有黃酮、黃酮醇、 二氫黃酮醇、二氫黃酮；蘿卜花顯現(xiàn)出粉紅色，說明含有花青素。
[0052] ⑵濃鹽酸-鋅粉反應：加入少量鋅粉，再加入濃鹽酸10滴，輕輕搖勻，靜置lh。 結果顯示，蘿卜花呈現(xiàn)粉紅色，說明含有花青素苷。其余均無色或者黃色，說明不含花青素 苷。
[0053] (3)醋酸鉛反應：加1.0%醋酸鉛2mL，輕輕搖勻，靜置2h。結果顯示，所有蕓薹屬 材料均出現(xiàn)不同程度的黃色沉淀，說明類黃酮具備酚羥基而且不含查耳酮和橙酮，可能具 有鄰二酚羥基或者兼有4-酮基、3-0H或者4-酮基、5-0H結構；蘿卜花出現(xiàn)綠色沉淀，說明 含有花青素苷。
[0054] (4)三氯化鐵反應：加5. 0%三氯化鐵2ml，輕輕搖勻。結果顯示，所有材料都出現(xiàn) 黃色，說明色素分子中不含酚羥基。
[0055] (5)三氯化鋁反應：加1. 0%三氯化鋁甲醇溶液I ml。結果顯示，所有材料都呈現(xiàn) 程度不同的黃色，說明含類黃酮物質。
[0056] (6)濃硫酸反應：加 I. 5mL濃H2SO4,輕輕搖勻，再置沸水浴5min。所有蕓薹屬材料 均呈現(xiàn)不同程度的黃色，說明含黃酮（醇），沸水中5min顏色不改變，說明不含查爾酮、橙 酮，可能不含二氫黃酮，可能含異黃酮和二氫異黃酮。蘿卜花出現(xiàn)橙黃色，說明含有花青素。
[0057] (7)四氫硼鈉反應：加四氫硼鈉8mg，再加1. 0%鹽酸2mL，輕輕搖勻，靜置此。所 有蕓薹屬材料均呈現(xiàn)程度不同的黃色，說明不含二氫黃酮和二氫黃酮醇。蘿卜花呈現(xiàn)極淡 粉紅色，說明含有二氫黃酮和/或二氫黃酮醇。
[0058] (8)堿性試劑反應：加5% Na2C033ml，輕輕搖勻，密閉靜置30min，通空氣lOmin。所 有材料均呈現(xiàn)程度不同的黃色，通空氣后顏色不變，說明不含二氫黃酮醇。
[0059] (9)氨性氯化銫反應：取甲醇IOml,加氨水定容至25ml,成為被氨水飽和的甲醇溶 液。向樣品液中加入〇. 〇lmol/L氯化鍶甲醇液10滴，再加被氨水飽和的甲醇液10滴，用手 輕輕搖勻，靜置lh。蘿卜花呈現(xiàn)出沉淀，說明有3'，4' -二羥基取代。
[0060] (10)硼酸反應：加1.0%硼酸10滴，再加2.0% H3B033ml，芥藍白花瓣呈現(xiàn)出無色， 說明芥藍白花瓣類黃酮可能不含c 5-oh。
[0061] 3、花瓣色素成分的紫外-可見光譜分析
[0062] (1)葉綠素：稱取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，采用體積分數(shù)為 90%的丙酮：乙醇（4:1，V/V)提取24h，過濾，定容至25ml，采用紫外-可見分光光度計在 200?700nm范圍內掃描。結果表明，所有樣品在662nm和644nm處均無吸收峰，說明均不 含葉綠素。
[0063] (2)類胡蘿卜素：稱取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入石油醚： 丙酮（I: I，V/V)提取24h，過濾，定容至25ml，采用紫外-可見分光光度計在200?700nm 范圍內掃描。結果表明，甘藍型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘藍在440和470nm 左右都有吸收峰，說明含有類胡蘿卜素，定量分析測定的含量分別為6. 824、6. 712、5. 548、 I. 248mg/g。而芥藍和蘿卜花瓣則沒有特征吸收峰，說明不含有類胡蘿卜素。
[0064] (3)類黃酮：稱取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入鹽酸化甲醇 (pH = 3) 2ml置于4°C冰箱中提取24h，過濾，定容至25ml，用紫外-可見分光光度計在 220?600nm范圍內掃描。結果表明，甘藍型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘藍、芥 藍、蘿卜花瓣的提取液在330和270nm均有吸收峰，說明他們都含有類黃酮化合物，定量分 析測定的含量分別為 483、7· 651、7· 001、L 391、L 003、8· 373mg/g。
[0065] (4)花青素苷：稱取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入甲醇提取 24h，過濾，定容至50ml，用紫外-可見分光光度計在200?700nm范圍內掃描。結果表 明，蘿卜花瓣色素在532nm左右有較明顯的花色苷特征吸收峰，是花色苷帶I吸收峰，在 260-270nm區(qū)域內以一個不太強帶II的峰，定量分析測定的含量為237. 27mg/100g。所有 蕓薹屬樣本均無花色苷吸收峰，即不含花色苷。
[0066] 實施例3、蕓薹屬和蘿卜花瓣色素生物合成途徑的分子鑒定
[0067] (1)蕓薹屬和蘿卜花瓣類黃酮途徑基因的表達特征
[0068] 為研究蕓薹屬和蘿卜花瓣色素出現(xiàn)差異的分子機理，設計蕓薹屬和蘿卜類黃酮途 徑基因的RT-PCR檢測引物，并以5SrRNA作為內參，具體如表1所示：
[0069] 表1、類黃酮途徑RT-PCR檢測引物

【權利要求】
1. 干擾蕓薹屬植物花瓣中0 -環(huán)化酶基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE表達同時超量 表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基因在制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述干擾蕓薹屬植物花瓣中￠-環(huán)化酶 基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE表達的序列如SEQ ID NO. 2所示，所述超量表達類胡蘿卜 素異構酶CRTISO基因的序列如SEQ ID NO. 3所示。
3. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述干擾蕓薹屬植物花瓣中￠-環(huán)化酶 基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE表達的序列由擬南芥花瓣特異啟動子PAtAP3介導表達，所 述花瓣特異啟動子PAtAP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1第267位至第1044位所示。
4. 根據權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于：所述蕓薹屬植物為甘藍型油菜 (Brassica napus)〇
5. 干擾蕓薹屬植物花瓣中P -環(huán)化酶基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE表達同時超量 表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基因的植物表達載體，其特征在于：所述植物載體包括由花 瓣特異啟動子介導的表達0 -環(huán)化酶基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE RNA干擾序列的表達 框和由組成型啟動子介導表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基因的表達框。
6. 根據權利要求5所述的植物表達載體，其特征在于：所述花瓣特異啟動子介導表達 3 -環(huán)化酶基因LCYB、e -環(huán)化酶基因LCYE RNA干擾序列的表達框依次由花瓣特異啟動子 PAtAP3、SEQ ID NO. 2所不的序列、間隔序列、SEQ ID NO. 2所不的反向互補序列和NOS終止 子組成。
7. 根據權利要求5所述的植物表達載體，其特征在于：所述由組成型啟動子介導超量 表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基因的表達框依次由CaMV35S啟動子，SEQ ID NO. 3所示序 列和NOS終止子組成。
8. 權利要求5-7任一項所述植物表達載體的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟：將SEQ ID NO. 1所示序列經AscI和Swal雙酶切后連入經同樣酶切的pFGC5941M質 粒，得PFGC5941CEPE質粒，然后將SEQ ID NO. 2所示的序列連入PFGC5941CETO載體的 PAtAP3啟動子與間隔序列之間，形成中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia，再將SEQ ID NO. 2 所示序列反向連入中間載體PFGC5941 CEPE-B2RNAia的間隔序列與0CS終止子之間，得 pFGC5941CEPE-B2RNAi載體，最后將SEQ ID NO. 3所示序列通過Ncol和AscI酶切位點連入 經同樣酶切的pFGC5941CEPE-B2RNAi載體，得干擾蕓薹屬植物花瓣中0 -環(huán)化酶基因LCYB、 e -環(huán)化酶基因LCYE基因表達同時超量表達類胡蘿卜素異構酶CRTISO基因的植物表達載 體。
9. 根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于：所述間隔序列為甘藍型油菜PAP2基 因第2內含子。
10. 利用權利要求5-7任一項所述植物表達載體制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種的 方法，其特征在于，包括如下步驟： a. 將權利要求5-7任一項所述植物表達載體轉化農桿菌，制得工程菌； b. 將步驟a所得工程菌轉化蕓薹屬植物無菌苗的下胚軸，共培養(yǎng)后，在Basta除草劑抗 性下誘導分化獲得再生苗，篩選陽性苗轉基因苗得花瓣呈紅色的蕓薹屬植物。
【文檔編號】A01H4/00GK104388464SQ201410794025
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月19日 優(yōu)先權日:2014年12月19日
【發(fā)明者】柴友榮, 劉雪, 廖霏霏, 金筱耘, 付春, 蔣佳怡, 董博, 李加納, 徐新福, 馬書語 申請人:西南大學