專利名稱：水稻GT轉(zhuǎn)錄因子家族基因OsGTγ-1在控制水稻耐鹽性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻基因工程領(lǐng)域。具體涉及分離克隆一個能夠提高高鹽耐受能力的 水稻GT轉(zhuǎn)錄因子家族基因OsGT γ -1，并通過功能驗證實現(xiàn)其在水稻抗逆性遺傳改良中的 應(yīng)用。本發(fā)明利用篩選T-DNA插入水稻突變體庫的方法，分離克隆到控制水稻耐鹽性的基 因OsGT γ -1，一方面通過共分離檢測驗證該突變體與高鹽敏感表型緊密連鎖，另一方面通 過超量表達(dá)OSGT Y-I基因提高了轉(zhuǎn)基因水稻對高鹽的耐受能力，證實了該基因的功能。
背景技術(shù)：
植物的生長發(fā)育過程不僅取決于其遺傳背景，還會受到諸多環(huán)境因素的影響。植 物生長的環(huán)境并非總是適宜的，在自然界條件下，由于不同的地理位置、氣候條件以及人類 活動等多方面原因，常常會造成各種對植物生長和生存不利的環(huán)境，致使植物受到傷害甚 至死亡。對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)來說，各種不良環(huán)境是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的最直接、最重要的因素， 也是制約許多地區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。如何利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段研究抗逆相關(guān)基因的功 能和調(diào)控機(jī)制，利用這些基因提高作物的抗逆性從而培育出具有優(yōu)良抗逆性的作物品種， 是植物功能基因組研究的重要內(nèi)容，也是農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究的主要目標(biāo)之一。干旱、低溫和土壤鹽堿化一直是制約農(nóng)作物生長發(fā)育和增產(chǎn)增收的主要逆境因 子。干旱可以導(dǎo)致植物細(xì)胞失水，造成細(xì)胞膨壓完全喪失，甚至死亡；凍害可能造成植物 細(xì)胞的機(jī)械傷害，引起細(xì)胞膜的膜脂相變而失水；鹽害除滲透脅迫外，同時還伴有離子毒 害，造成植物細(xì)胞內(nèi)酶類的傷害、植物生長受抑制等。植物感受外界逆境信號后通過信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)過程調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗逆相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)整自身的生理狀態(tài)或形態(tài)來適應(yīng)不利環(huán) 境，維持基本的生存活動。植物感應(yīng)到逆境脅迫后經(jīng)過一系列的信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，啟 動下游大量與脅迫應(yīng)答相關(guān)靶基因的表達(dá)，產(chǎn)生一些使細(xì)胞免受脅迫傷害的物質(zhì)(如LEA 類蛋白、滲調(diào)蛋白、抗凍蛋白、通道蛋白等)，進(jìn)而增強(qiáng)植物對脅迫的耐受能力(Valliyodan B, Nguyen H Τ. Understandingregulatory networks and engineering for enhanced drought tolerance in plants. Curr Opin Plant Biol, 2006，9 :189—195)。目前已經(jīng)從 植物中分離克隆了數(shù)十種編碼與提高逆境脅迫抗性相關(guān)蛋白的基因，根據(jù)基因編碼產(chǎn)物的 功能，可將它們分成兩大類一類是編碼直接保護(hù)細(xì)胞免受逆境脅迫傷害的功能蛋白的功 能基因，包括一些編碼膜蛋白(如水通道蛋白、轉(zhuǎn)運子)的基因；細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中的一 些蛋白酶基因；編碼大分子保護(hù)蛋白(如分子伴侶、LEA蛋白)的基因；編碼滲透調(diào)節(jié)物質(zhì) (如脯氨酸、甜菜堿、糖醇等)合成酶的基因；編碼毒性物質(zhì)降解酶(如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、 超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及抗壞血酸過氧化物酶等)的基因。人們將與提高逆境脅迫 抗性相關(guān)的功能基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，使轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性有了不同程度的提高。另一類 是逆境脅迫下信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的基因，包括抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因(bZIP轉(zhuǎn) 錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、MYC、MYB類及DREB類轉(zhuǎn)錄因子等)；感應(yīng)及轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號的蛋白激 酶(MAPK、CDPK、S6K、受體蛋白激酶、核糖體蛋白激酶等)；信號傳導(dǎo)中起重要作用的蛋白酶(如磷酸酯酶、磷脂酶C等)。 傳統(tǒng)育種實踐表明，想通過品種間和種間雜交等傳統(tǒng)遺傳育種手段提高作物對 逆境脅迫的抗性很難奏效，利用單個功能基因來對作物的抗逆性進(jìn)行改良也難以獲得理 想的效果。近年來發(fā)現(xiàn)一些逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個逆境相關(guān)基因的表達(dá)，利 用轉(zhuǎn)錄因子可以有效實現(xiàn)對植物抗逆性的改良。轉(zhuǎn)錄因子是指能夠與基因啟動子區(qū)域中 順式作用元件發(fā)生特異相互作用的DNA結(jié)合蛋白，也稱反式作用因子，能夠通過它們之間 以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上實現(xiàn)對基因的表達(dá)調(diào)控(Xiong 等.Transcription factors in rice :a genome-wide comparative analysis between monocots and eudicots. Plant Mol Biol，2005，59 :191_203)。實踐證明，在植物體內(nèi)對 某些轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行超量表達(dá)能夠有效提高植物對非生物脅迫的耐受能力。例如超表 達(dá)DREBlA的轉(zhuǎn)基因擬南芥可表現(xiàn)出對干旱、高鹽和凍害的抗性，而對DREB2A進(jìn)行超表達(dá) 能在非脅迫條件下誘導(dǎo)低溫脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，并能提高轉(zhuǎn)基因植株對低溫脅迫的耐 受性(Liu 等，Two transcription factors，DREBl and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separatetwo cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell，1998，10 :1391_1406)。Tsil(Park 等，Overexpression of the tobacco Tsilgene encoding an EREBP/AP2~type transcription factor enhances resistance against pathogen attack and osmoticstress in tobacco. Plant Cell，2001，13 1035-1046)Λ 番茄JERFl以及JERF3在轉(zhuǎn)基因煙草中的超表達(dá)能提高煙草的耐鹽性(Wang等，Ectopic overexpression of tomato JERF3 in tobacco activates downstream geneexpression and enhances salt tolerance.Plant Mol Biol,2004,55 :183-192 ;Zhang 等，The ethylene-, jasmonate-, abscisic acid—and NaCl-responsive tomato transcription factor JERFl modulates expression of GCCbox-containing genes and salt tolerance in tobacco. Planta，2004，220 :262-270)。在水稻中超量表達(dá)SNACl基因顯著提高了 轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性和耐鹽性(Hu等，Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC(NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice. Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103 :12987-12992)。由于轉(zhuǎn)錄因子的超量表達(dá)能夠激活 多個與同類性狀相關(guān)的基因的表達(dá)，因此與導(dǎo)入或改良個別功能基因來提高作物某種抗性 的傳統(tǒng)方法相比，對關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行改良或增強(qiáng)其調(diào)控能力，可以通過調(diào)控一個轉(zhuǎn)錄 因子而激活多個功能基因發(fā)揮作用，為作物抗逆性分子育種提供更為有效的方法和途徑。作為一種重要的糧食作物和模式植物，水稻品質(zhì)的改良和產(chǎn)量的提高一直是人們 努力的目標(biāo)。通過研究水稻中與逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子從而提高水稻抗逆性是培育抗逆水稻 品種的一條有效途徑。在我們的前期研究中分離到一個受多種逆境誘導(dǎo)的基因，序列分析 表明它屬于植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子GT家族的成員。已有的研究表明這個家族的成員參 與包括植物光應(yīng)答在內(nèi)的一些生理反應(yīng)，并能與相應(yīng)GT元件特異結(jié)合或與其它轉(zhuǎn)錄因子 之間發(fā)生相互作用從而實現(xiàn)對多種不同基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。水稻GT-2和擬南芥GT-I可在體 內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄(Le等，Transcriptional activation by Arabidopsis GT-I may be through interaction withTF II A-TBP-TATA complex. Plant J. 1999，18:663_668 ;Ni 等，GT-2 : in vivo transcriptional activation activityand definition of novel twin DNAbinding domains with reciprocal target sequence selectivity. Plant Cell. 1996, 8 :1041-1059)，擬南芥 PTL 參與調(diào)節(jié)花器官的發(fā)育(Brewer 等，PETAL LOSS, a trihelix transcription factor gene, regulates perianth architecture in the Arabidopsis flower. Development. 2004，131 :4035_4045)，但這個家族是否參與植物的逆境應(yīng)答尚無報 道。因此。從水稻中分離克隆該家族的基因并鑒定它在提高水稻抗逆性方面所發(fā)揮的功能， 對于培育抗逆水稻新品種具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于從水稻中分離克隆一個包含該功能蛋白同源基因完整編碼區(qū)段的DNA片段(在本發(fā)明中所述“DNA片段”與“核苷酸序列”同義，下同)，利用這個基因 提高水稻對高鹽脅迫的耐受能力，實現(xiàn)該基因在水稻耐鹽性遺傳改良中的應(yīng)用。對這個基 因編碼的蛋白序列進(jìn)行分析表明它與擬南芥中的GT-3a和GT-3b蛋白有一定的同源性，系 統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果表明該基因?qū)儆贕T轉(zhuǎn)錄因子家族中一個新的亞家族GT γ中的成員，因 此被命名為OsGTy-I基因。本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一種包含OsGT γ -1基因的DNA片段，該片段賦予植物對高 鹽脅迫耐受性增強(qiáng)的能力。其中，所述的OsGT Y-I基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQ NO 1中第475-1707位所示的DNA序列；或2)編碼與1)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列；或3) 1)和2)所包含的亞片段。可以采用已經(jīng)克隆的OsGT γ -1基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本 發(fā)明的基因或同源基因。同樣，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)，從基因 組、mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的OsGT γ -1基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同 源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含OsGT γ-1基因的序列，將這一序列與任何 一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體連接后轉(zhuǎn)化植物，可獲得耐鹽性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因 植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時，可以在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一 種強(qiáng)啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時，也可使用增強(qiáng)子， 這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱 讀框相同，以保證整個序列的翻譯。攜帶有本發(fā)明OsGT γ -1基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接 DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach，1998,Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411-463 ；Geiserson and Corey,1998, Plant Molecular Biology(2nd Edition)?？墒褂冒ū景l(fā)明的OSGTY-I基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主是包括水稻在內(nèi)多種 植物，培育耐鹽的植物品種。本發(fā)明基因是受逆境誘導(dǎo)表達(dá)的，因此可將本發(fā)明的基因與任何感興趣的逆境誘 導(dǎo)啟動子結(jié)合后連入合適的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化植物宿主，在逆境條件下可誘導(dǎo)表達(dá)基因，提 高植物對高鹽脅迫的抗性。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


序列表SEQ ID NO :1顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有OsGT Y-I基因編碼區(qū)的 核苷酸序列。圖1 采用MrBayes 3. 0版軟件(公開使用軟件)依據(jù)水稻和擬南芥中GT家族成 員和部分其他植物物種中已報道的GT因子蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果。圖2(包含圖2a-圖2c)用Real-time PCR檢測OsGT γ _1基因在各種逆境脅迫 條件下、水稻不同組織中和在不同激素處理下的表達(dá)水平。4種非生物逆境脅迫依次是S， 高鹽；D，干旱；C，低溫；w，傷害。高鹽、干旱、低溫脅迫取樣時間點為0、1、3、6小時，傷害脅 迫取樣時間點為0、1、10、30分鐘。13個組織器官依次是1，分蘗期的根；2，拔節(jié)期的莖；3， 4葉期的葉片；4葉期的葉鞘；5，穗(0. 5-lcm) ；6，穗(3-5cm) ；7，穗(大于IOcm) ；8，開花前 的穗頂端分生組織；9，雄蕊；10，雌蕊；11，發(fā)芽1天的苗；12，發(fā)芽3星期的苗；13 ；3星期的 黃花苗。7種激素處理依次是A，脫落酸(ABA) ；I，生長素(IAA) ；G，赤霉素(GA) ；K，細(xì)胞分 裂素(KT) ;J，茉莉酸(JA) ；E，乙烯利(Eth) ；S，水楊酸(SA)。噴施激素處理的濃度分別為 26. 43mg/L、10mg/L、40mg/L、100mg/L、21. 03mg/L、43. 35mg/L、138. 12mg/L，處理后按不同時 間點取樣，ABA、IAA、GA、KT激素處理取樣時間點為0,0. 5、1、3小時，JA、Eth、SA激素處理 取樣時間點為0、1、2、4小時。圖3 :0sGT Y-I蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果。OsGTy-I :GFP融合載體和pU1391GFP空 載體分別轉(zhuǎn)化水稻，在激光共聚焦顯微鏡下對轉(zhuǎn)基因植株的根進(jìn)行觀察。G，GFP熒光圖像； PI，用碘化丙啶染色的熒光圖像；M，合成圖像。圖4(包含圖4a-圖4e)水稻osgt Y-I突變體的鑒定。a，突變體中T-DNA插入 位置示意圖；b，根據(jù)插入位點設(shè)計引物驗證共分離的PCR結(jié)果。F表示在插入位點上游設(shè) 計的引物，R表示在插入位點下游設(shè)計的引物，VP表示根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計的引物。在 T1代植株中，純合突變體只有R和VP配對可以擴(kuò)增的出，因為有T-DNA插入F與R配對的 產(chǎn)物太大無法得到擴(kuò)增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有F和R配對可以得 到產(chǎn)物，雜合植株則R和VP配對以及F和R配對時都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。其中泳道3，4， 13，15，18 為 T-DNA 純合；1，2，5，6，7,9,10，11，12，14，16，17 為 T-DNA 雜合；8，9 為 T-DNA 陰 性；c，用Real-time PCR檢測正常生長條件和高鹽脅迫下OSGT γ _1基因在5個純合突變體 家系(Μ1-Μ5)和野生型對照家系(CK)中的表達(dá)水平；d，正常生長條件和150mM NaCl高鹽 脅迫下一周后5個純合突變體家系(M1-M5)和野生型對照家系(CK)的生長情況；e，正常生 長條件和150mM NaCl高鹽脅迫下一周后5個純合突變體家系(M1-M5)和野生型對照家系 (CK)地上部分長度統(tǒng)計結(jié)果。圖5(包含圖5a_圖5d)超量表達(dá)OsGT γ _1基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。 a, OsGTy-I基因超量表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；b，用Real-time PCR檢測OsGT γ _1基因在5 個獨立超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系(01-05)和野生型對照家系(CK)中的表達(dá)水平；c，正常生長條 件和150mMNaCl高鹽脅迫下一周后5個超量表達(dá)家系(01-05)和野生型對照家系(CK)的 生長情況；d，正常生長條件和150mM NaCl高鹽脅迫下一周后5個超量表達(dá)家系(01-05)和 野生型對照家系(CK)地上部分長度統(tǒng)計結(jié)果。圖6 超量表達(dá)實驗所用PCB2004H載體圖。圖7 亞細(xì)胞定位實驗所用pU1391cGFP載體圖。
具體實施例方式OsGT Y -1基因的全長cDNA是從日本水稻全長數(shù)據(jù)庫(http //cdnaOl. dna. affrc.go.jp)中J013022H04質(zhì)粒中擴(kuò)增所得。OsGT γ-1是一個抗逆相關(guān)基因。主要依 據(jù)有以下幾個方面(1)利用Real-time PCR方法對其進(jìn)行逆境條件下的表達(dá)譜分析(圖 2a)，發(fā)現(xiàn)在脅迫處理(干旱、高鹽、低溫脅迫和ABA處理)的過程中，OsGTY-I的表達(dá)量明 顯上升。組織表達(dá)譜分析結(jié)果(圖2b)表明OsGT γ -1在不同組織中均有一定程度的表達(dá)， 在葉片、葉鞘和幼穗中的表達(dá)量較高。(2)通過生物信息學(xué)方法預(yù)測該基因是水稻GT轉(zhuǎn)錄 因子家族的成員，OsGT Y-I蛋白的亞細(xì)胞定位分析表明其定位于細(xì)胞核中(圖3)。(3)該 基因的T-DNA插入水稻突變體中OsGT γ -1表達(dá)受到抑制，純合突變體對高鹽脅迫的敏感性 增強(qiáng)(圖4)。(4)將其全長基因在水稻中超量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株對高鹽脅迫的耐受能力大 大增強(qiáng)(圖5)。這些結(jié)果都表明OsGT γ -1基因是一個逆境相關(guān)調(diào)控基因，參與植物對逆境 的調(diào)控。以下實施例進(jìn)一步定義本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在上述前期工作基礎(chǔ)上分離克隆 包含有OsGT γ -1基因完整編碼區(qū)段的DNA片段以及驗證OsGT γ -1基因功能的方法。根據(jù) 以下的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本 發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條 件。實施例1 對水稻GT家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析并分離克隆包含有OSGT γ _1基因 區(qū)段的DNA片段基于已報道的植物GT 蛋白質(zhì)序列在 NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih. gov), TIGR(The Institute for Genomic Research, http://www. tigr. org)禾口 TAIR(TheArabidopsis Information Research, http://www. arabidopsis. org)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索的結(jié)果，收集GT轉(zhuǎn)錄因子家族成 員序列，手動除去重復(fù)序列。采用MrBayes 3. O版軟件(公開使用軟件)對水稻和擬南芥中 GT家族成員和部分其他植物物種中已報道的GT因子蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(結(jié)果見 圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞家族GT γ中的成員均尚未被報道過，挑選這個亞家族中的成員OsGT γ -1 作為研究對象。該基因?qū)?yīng)日本水稻全長數(shù)據(jù)庫(http://Cdna01. dna. affrc. go. jp)中的 cDNA克隆J013022H04(登錄號為AK065397)。根據(jù)該克隆序列，設(shè)計引物0E07F(5' -GTTG GTACCAGGTTTTTAGGCGTGG-3 ‘，序列特異引物外加接頭 KpnI 位點)和 0E07R(5 ‘ -GAACTGCA GTGACCGATTGCAGTTAG-3'，序列特異引物外加接頭PstI)，將該克隆的序列從日本水稻全長 數(shù)據(jù)庫(http://cdna01. dna. affrc. go. jp)中的 cDNA 克隆 J013022H04 質(zhì)粒中擴(kuò)增出來。 擴(kuò)增產(chǎn)物對應(yīng)本發(fā)明中SEQ ID NO 1顯示序列的391-1850bp。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變 性 3min ；94°C 40sec，55°C 40sec，72°C 2min，32 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0 將擴(kuò)增獲得的 PCR 產(chǎn)物連入pGEM -T載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測序，獲得所需的全長基因， 該克隆命名為pGEM-OsGT Y-I0 本發(fā)明所涉及的序列來源于NCBI(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)， TIGR(http://www. tigr. org), KOME(http://cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/),定位的基 因的位置信息以 “TIGR Rice Annotation Release 5” 為準(zhǔn)。
實施例2 分析水稻內(nèi)源基因OSGT γ -1的組織和逆境表達(dá)譜
以水稻品種“珍汕97” ( 一個中國大面積公開推廣應(yīng)用的水稻品種)為材料，在3 葉期分別進(jìn)行干旱、冷害和高鹽脅迫以及傷害處理。干早處理是將幼苗斷水，高鹽脅迫是將 幼苗根部浸泡在200mM/L NaCl溶液中，低溫處理是將幼苗置于4°C生長箱，在0、1、3、和6 小時四個時間點取樣，傷害脅迫取樣時間點為0、1、10、30分鐘。噴施激素處理所用的7種 激素依次是A，脫落酸(ABA) ；I，吲哚乙酸(IAA) ；G，赤霉素(GA3) ；K，細(xì)胞分裂素(KT) ;J， 茉莉酸(JA) ；E，乙烯利(Eth) ；S，水楊酸(SA)。濃度分別為:26.43mg/L、10mg/L、40mg/L、 100mg/L、21. 03mg/L、43. 35mg/L、138. 12mg/L，處理后按不同時間點取樣，ABA、IAA、GA、KT 激 素處理取樣時間點為0、0. 5、1、3小時，JA、Eth、SA激素處理取樣時間點為0、1、2、4小時?？?RNA采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)提取(提取方法根據(jù)上述TRIZOL試劑說明 書)。由于該基因本底表達(dá)較低，表達(dá)譜分析是利用Real-time PCR完成的，利用反轉(zhuǎn)錄酶 SSII(購自Invitrogen公司)將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(方法根據(jù)反轉(zhuǎn)錄酶試劑 說明書)，反應(yīng)條件為65°C5min，42°C50min，70°C lOmin。利用反轉(zhuǎn)錄酶(購自Invitrogen 公司)。以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用引物H04F 5，-ATCTGGTGGTCCAACTGCTGA-3， 和 H04R :5，-CGGCGTTT-TTCAAGTCGAAT-3，擴(kuò)增 OsGT Y _1 基因特異片段，以 OsActinl 基因作為內(nèi)對照(利用弓丨物 ActinlF :5，-TGGCATCTCTAGCACATTCC-3，和 ActinlR 5’ -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’擴(kuò)增OsActinl基因特異片段)進(jìn)行熒光實時相對定量分 析。反應(yīng)條件為95°C 5min ；95°C 10sec，60°C 5sec，72°C 34sec，45 個循環(huán)。結(jié)果表明，本 發(fā)明克隆的基因OsGTY-I能被干旱、高鹽、低溫和ABA誘導(dǎo)表達(dá)，但不受傷害脅迫和其它 激素處理誘導(dǎo)(如圖2a和圖2c所示)，是一個受逆境誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子。以水稻品種“明恢 63”(一個中國大面積公開推廣和應(yīng)用的水稻品種)為材料，提取不同生長時期的組織的 RNA用Reai-time PCR檢測OsGT γ -1基因的表達(dá)水平。選取的13種組織器官分別是1，分 蘗期的根；2，拔節(jié)期的莖；3，4葉期的葉片；4葉期的葉鞘；5，穗(0. 5-lcm) ；6，穗(3-5cm)； 7，穗(大于IOcm) ；8，開花前的穗頂端分生組織；9，雄蕊；10，雌蕊；11，發(fā)芽1天的苗；12， 發(fā)芽3星期的苗；13 ；3星期的黃花苗。結(jié)果表明=OsGTY-I基因在所選取的組織中均有一 定量的表達(dá)，但以葉片、葉鞘和幼穗中的表達(dá)量較高(如圖2b所示)。實施例3 =OsGTy-I蛋白的亞細(xì)胞定位利用水稻穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系，我們將包含預(yù)測為OsGTY-I核定位序列的cDNA片段 同報告基因GFP融合，通過玉米里的一個強(qiáng)啟動子Ubiquitin的驅(qū)動在水稻植株中表達(dá)， 對陽性轉(zhuǎn)基因植株的根在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察的結(jié)果說明OsGTY-I蛋白定位 于細(xì)胞核內(nèi)(如圖3所示)。融合載體構(gòu)建方法如下0sGTY-1部分cDNA序列(對應(yīng)除 去3'-末端5個氨基酸和終止密碼子的編碼區(qū)序列)通過引物5' -CTAGGTACCGAGCTT CTCTTTGGAATTTGTG-3‘(序列特異引物外加接頭 KpnI 位點)和 5' -TAACCCGGGCTTTGGTT TGATACCCATCTC-3 ‘(序列特異引物外加接頭SmnaI位點)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物對應(yīng)本發(fā) 明中SEQ ID NO :1顯示序列的391-1850bp。以日本水稻全長數(shù)據(jù)庫Knowledge-based OryzaMolecular biological Encyclopedia (http://cdna01. dna. affrc. go. jp)中該基 13 對應(yīng)的cDNA克隆J013022H04(登錄號AK065397)質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得目的片段。PCR反 應(yīng)體系為質(zhì)粒DNA模板0. 3μ 1(約lOOng)，IOmM引物各1 μ 1，IXrTaq聚合酶反應(yīng)緩沖 液(購自 TaKaRa 公司)，25mM MgCl2 5 μ 1，IOmM dNTP 1 μ 1，rTaq 聚合酶(5U/ μ 1)(購自TaKaRa 公司)0· 25 μ 1，加 ddH20 至 50 μ 1。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 3min ；94°C 40sec, 50°C 40sec, 72°C 2min, 32 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。通過 KpnI 和 SmaI 將 OsGT γ -1 的上述 cDNA序列酶切純化后連接到常用于植物蛋白亞細(xì)胞定位的載體pU1391cGFP(由華中農(nóng)業(yè) 大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室已畢業(yè)的代明球博士改造，載體圖見圖7)中的GFP報告 基因前面，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlO β (菌株購自Irwitrogen公司)。通過酶切篩選陽性克隆，獲 得轉(zhuǎn)化載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法(如下述具體步驟)將以上載體 (PU1391cGFP-0sGTy-l)導(dǎo)入到水稻品種中花11 (中國水稻研究所提供的一個公開使用的 水稻品種)中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、煉苗、 移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(中花11)遺傳轉(zhuǎn)化方法(體系)在Hiei等人 艮 白勺方夕去(Hiei等,Efficient transformation ofrice,Oryza sativa L. ,mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, Plant J,6 271-282,1994)基礎(chǔ)上改良進(jìn)行(如下述具體步驟)。
具體遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下(1)愈傷組織誘導(dǎo)將成熟的水稻種子中花11 (中國水稻研究所提供的一個公開 使用的水稻品種)去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯化汞(HgCl2)種子 表面消毒15分鐘；用滅菌水洗種子4-5次；將該消過毒的種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(成分見 后)；將接種后的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25士 1°C。(2)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基(成分 見后)上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25士 1°C。(3)預(yù)培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗 下培養(yǎng)2周，溫度25士 1°C。(4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上(成分見后)預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌 EHA105 (來源于CAMBIA，商用菌株)兩天，培養(yǎng)溫度28°C ；將所述的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng) 基(成分見后)里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時。(5)農(nóng)桿菌侵染將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液 至OD6J). 8-1. 0 ；將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干； 然后放置在共培養(yǎng)基(成分見后)上培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度19-20°C。(6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；浸泡在含400ppm羧 芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培 養(yǎng)基(成分見后)上選擇2-3次，每次2周(第一次篩選羧芐青霉素濃度為400ppm，第二次 以后為250ppm，潮霉素濃度250ppm)。(7)分化將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗處培養(yǎng)5-7周；轉(zhuǎn) 移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上(成分見后)，光照下培養(yǎng)，溫度26°C。(8)生根剪掉分化時產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3 周，溫度26°C。(9)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初 的幾天保持水分濕潤。培養(yǎng)基組分及其配方(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin， 羧節(jié)青霉素)；KT(Kinetin，激動素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)； IAA(Indole-3-acetic acid,噴哚乙酸)；2，4-D (2，4-Dichlorophenoxyaceticacid， 2，4- 二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁 香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲 基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)； MSmix (MS微量成分溶液)。 (2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(IOX)]的配制硝酸鉀(KNO3)28. 3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4. Og硫酸銨((NH4)2SO4)4. 63g硫酸鎂(MgSO4· 7H20)1. 85g氯化鈣(CaCl2· 2H20)1. 66g逐一溶解，然后室溫下定容至IOOOml。2)N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制碘化鉀(KI)0. 08g硼酸(H3BO3)0. 16g硫酸錳(MnSO4· 4H20)0. 44g硫酸鋅(ZnSO4· 7H20)0. 15g室溫下溶解并定容至1000ml。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70°C，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA · 2H20) 3. 73 克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小時，定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)配制煙酸(Nicotinic acid)0. Ig維生素Bl (Thiamine HCl)0. Ig維生素B6(Pyridoxine HCl) 0. Ig甘氨酸(Glycine)0. 2g肌醇(Inositol)IOg加水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)MS培養(yǎng)基大量元素母液(10X)的配制硝酸銨(NH4NO3)16. 5g硝酸鉀19. Og磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3. 7g氯化鈣4. 4g室溫下溶解并定容至1000ml。6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(100X)的配制
碘化鉀0. 083g硼酸0. 62g硫酸錳0. 86g鉬酸鈉(Na2MoO4· 2H20)0. 025g硫酸銅(CuSO4· 5H20)0. 0025g室溫下溶解并定容至1000ml。7) 2,4-D貯存液，6_BA貯存液，萘乙酸(NAA)貯存液，吲哚乙酸(IAA)貯存液均為lmg/mlο8)葡萄糖貯存液0· 5g/ml。9) AS 貯存液的配制秤取 AS 0. 392g，DMSO 10ml。(3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X)IOml維生素C存液(100X)IOml2，4_D 貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0. 3gCH0. 6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X)IOml維生素貯存液(100X)IOml2，4_D 貯存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0. 6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)12. 5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2. 5ml
維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1. 75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱熔解培養(yǎng) 基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 μ 1 AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 2g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱熔解培養(yǎng) 基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 μ 1 AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)5mlN6mix 母液(100X)0.5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)0.5ml維生素貯存液(100X)Iml2，4-DC存液0.2mlCH0. 08g蔗糖2g加蒸餾水至IOOml，調(diào)節(jié)pH值到5. 4，分裝到兩個IOOml的三角瓶中，封口滅菌。使 用前加入Iml葡萄糖貯存液和100 μ 1 AS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.625mlCH0. 15g蔗糖7. 5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。使用前熔解培養(yǎng)基，加入250 μ 1HN和400ppmCN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA 貯存液0.5mlKT C存液0.5mlNAA C存液50 μ 1IAA C存液50 μ 1CH0. 15g蔗糖7. 5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封口滅菌。使用前熔解培養(yǎng)基， 加入250 μ 1 HN和200ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。8)分化培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X)IOml維生素貯存液(100X)IOml6-BA 貯存液2mlKT C存液2mlNAA C存液0.2mlIAA 貯存液0.2mlCHIg蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養(yǎng)基MSmax 母液(IOX)50mlMSmix 母液(100X)5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分裝到 生根管中(25ml/管)，封口滅菌。10) LA 培養(yǎng)基 LB (pH 7. 0) IL
TryptoneIOgYeast extracts5gNaClIOg瓊脂粉15g加蒸餾水定容至1000ml，封口滅菌。使用前熔解培養(yǎng)基，加入相應(yīng)抗生素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。實施例4 鑒定OSGT γ -1水稻T-DNA插入突變體為研究OsGTy-I的功能，用該基因的基因組序列(包含其啟動子區(qū)IOOObp)在 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)室作物遺傳改良國家重點實驗室的水稻突變體數(shù)據(jù)庫(http://rmd. ncpgr. cn/，一個向國內(nèi)外公開開放的公共數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫所涉及的水稻突變體材料公眾可以向持 有人中國湖北省武漢市的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室免費索取)中進(jìn)行 BLAST檢索，發(fā)現(xiàn)了一個水稻T-DNA插入突變體(03Z11BT07)。本發(fā)明所涉及的序列來源 T NCBI(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/), TIGR(http://www. tigr. org), KOME(http:// cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/)，定位的基因的位置信息以 “TIGR Rice Annotation Release 5” 為準(zhǔn)。根據(jù)側(cè)翼序列與水稻基因組的匹配情況，可以確定插入位點，在插入位點的兩邊 設(shè)計一對引物F和R，及T-DNA上設(shè)計一條引物VP，如圖4a，F(xiàn)表示在插入位點上游設(shè)計 的引物，R表示在插入位點下游設(shè)計的引物，VP表示根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計的引物。在 T1代植株中，T-DNA純合植株只有R和VP配對可以擴(kuò)增的出，因為有T-DNA插入F與R 配對的產(chǎn)物太大無法得到擴(kuò)增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有F和R配 對可以得到產(chǎn)物，雜合植株則R和VP配對以及F和R配對時都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。根 據(jù)插入位點設(shè)計的引物序列為F (引物)5 ‘ -GGCACGTCATGGTTGGTAC-3 ‘，R (引物) 5' -AACAAAAGCGGCGGTAATG-3‘，VP(弓丨物)5' -AATCCAGATCCCCCGAATTA-3‘。PCR 反應(yīng) 體系為水稻突變體小樣DNA模板0. 5 μ 1 (約50ng)，IOmM引物各0. 2 μ 1，1 XrTaq聚合酶 反應(yīng)緩沖液，25mM MgCl2 2 μ 1, IOmM dNTP 0· 2 μ 1，rTaq 聚合酶(5U/μ 1) 0. 1 μ 1，加 ddH20 至 20 μ 1。反應(yīng)程序為94°C 3min ；94°C 40sec,55°C 40sec,72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C延 伸IOmin0 PCR結(jié)果如圖4b所示，其中泳道3，4，13，15，18為T-DNA純合；1，2，5，6，7，9， 10，11，12，14，16，17為T-DNA雜合；8，9為T-DNA陰性。結(jié)果表明T_DNA(左邊界)插入在 OsGT γ -1基因的啟動子區(qū)(離轉(zhuǎn)錄起始位點約500bp)。選取5個已鑒定基因型的純合突變體家系和野生型家系進(jìn)行高鹽脅迫實驗。利用 Real-time PCR的方法檢測正常條件下和高鹽脅迫條件下純合突變體家系和野生型家系中 OSGTy-I基因的表達(dá)量，結(jié)果表明OSGTy-I基因在純合突變體中的表達(dá)均受到抑制(如 圖4c所示)。高鹽脅迫實驗具體步驟如下將純合突變體家系和野生型家系種子去殼消毒 (75 %酒精處理3min，0. 15 %氯化汞處理IOmin，無菌水清洗5次)，在MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，2-3 天后挑選發(fā)芽好且長勢一致的種子分別轉(zhuǎn)移到含有Ommol/L和150mmol/L的NaCl的MS培 養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)室生長7-8天后觀察表型和測量植株的株高。每個家系的每種處理不 少于15棵植株，實驗設(shè)置3次重復(fù)。結(jié)果表明純合突變體植株在正常條件下的生長與對 照沒有明顯差異，但純合突變體植株在高鹽脅迫處理條件下的生長顯著(t測驗P < 0. 05) 劣于對照，說明抑制OSGT γ -1基因的表達(dá)會使植株對高鹽脅迫的敏感性增強(qiáng)(見圖4)。該實驗設(shè)置的3次生物學(xué)重復(fù)結(jié)果一致，說明該突變表型確實是T-DNA插入造成的。為了驗 證該突變體的遺傳穩(wěn)定性及進(jìn)一步驗證共分離情況，又繁殖了一代即T2代。將T1代收獲的 種子播種得到T2代純合，雜合和野生型種子。同樣進(jìn)行上述脅迫實驗，結(jié)果一致。實施例5 =OSGT γ -1基因超量表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性型鑒定為了更好地闡明OSGTy-I基因的功能，申請人將其在水稻中超量表達(dá)，由轉(zhuǎn)基因 植株的表型研究該基因的功能。
超量表達(dá)載體構(gòu)建方法如下首先通過查找日本水稻全長數(shù)據(jù)庫 Knowledge-based Oryza Molecularbiological Encyclopedia(http//cdnaOl. dna. affrc. go. jp)，找到其所對應(yīng)的cDNA克隆J013022H04 (登錄號AK065397)，并購買其全長 cDNA。以該全長 cDNA 為模板，用引物 0E07F(5' -GTTGGTACCAGGTTTTTAGGCGTGG-3 ‘，序列 特異引物外加接頭 KpnI 位點)和 0E07R(5 ‘ -GAACTGCAGTGACCGATTGCAGTTAG-3 ‘，序列特 異引物外外加接頭PstI)擴(kuò)增出包含OSGT Y-I全長的DNA片段。PCR反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性 3min ；94°C 40sec，50°C 40sec，72°C 2min，32 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0 將該擴(kuò)增片 段亞克隆到pGEM -T載體(購于Promega公司)上，篩選陽性克隆并進(jìn)行測序驗證，再用引 物 ALLF(5‘-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT AAT ACG ACT CACTAT AGG G) 禾口 ALLR (5‘ -GGG GAC CAC TIT GTA CAA GAA AGC TGG GTA TTT AGG TGA CAC TATAG)從 帶有該片段的pGEM -T載體上擴(kuò)增出一條可供重組到pCB2004H載體上的片段，PCR條件 同上。按Invitrogen公司提供的重組克隆試劑盒說明書進(jìn)行重組反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DHlO β (大腸桿菌DHlOii菌株購自Invitrogen公司)。通過酶切篩選陽性克隆，獲得轉(zhuǎn) 化載體。PCB2004H是已公開發(fā)表的用于超量表達(dá)載體構(gòu)建的載體(Hou等，A homolog of human ski-interacting protein in rice positively regulates cellviability and stress tolerance, Proc Natl Acad Sci USA，2009，106 :6410_6415)(載體圖見圖 6)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法(如下述具體步驟)將上述超量表達(dá)載體 (pCB2004H-0SGT γ -1)導(dǎo)入到水稻品種中花11 (中國水稻研究所提供的一個公開使用的水 稻品種)中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、煉苗、移 栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。具體遺傳轉(zhuǎn)化步驟同實施例3中所述。本實施例利用Real-time PCR的方法鑒定Ttl代轉(zhuǎn)基因植株中OSGT γ _1基因的表 達(dá)量，選取了 5個OSGT Y-I超量表達(dá)T2家系(如圖5b所示)進(jìn)行高鹽脅迫實驗。具體步 驟如下將超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系和野生型家系種子去殼消毒(75%酒精處理3min，0. 15% 氯化汞處理lOmin，無菌水清洗5次)，在含有50mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，野生型對 照家系晚一天播于不含潮霉素的MS培養(yǎng)基上，2-3天后挑選發(fā)芽好且長勢一致的種子分別 轉(zhuǎn)移到含有Ommol/L和150mmol/L的NaCl的MS培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)室生長7_8天后觀察 表型和測量植株的株高。每個家系的每種處理不少于15棵植株，實驗設(shè)置3次重復(fù)。結(jié)果 表明在正常條件下OSGTy-I超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的生長與對照沒有明顯差異，但在高鹽 脅迫處理下生長要顯著(t測驗P<0.01)優(yōu)于對照(圖5)，說明本發(fā)明的OSGTY-I基因 的表達(dá)可以緩解高鹽脅迫造成的植株生長受阻，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物對高鹽脅迫的耐受性(如 圖5)。序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>水稻GT轉(zhuǎn)錄因子家族基因OsGT γ _1在控制水稻耐鹽性中的應(yīng)用<130><141>2009-12-15<160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1998<212>DNA<213> 水稻(Oryza sativa)<220><221>gene<222>(1). . (1998)<223><220><221>CDS<222>(475). . (1707)<223><400>1gattcttcct ttctctgtgt ttgtttgttt ccagttgcca ctaaccagcc agagccccgg 60gggggagaag agcgagagag gaggagaaat cttgcagcaa tccctcgctt agattcgcca 120ttaccgccgc ttttgttccc accaagatta ccaccccctc ctcctcctgt gctcgagcgc 180tcgcatcgca tttcaggctg cttcttgatt ctgcgaggag gttgaaatct ctcgtgattg 240caacagctgc catccgttcg ttccggtgga gtgcacccct tcatcaccaa ggaggagaaa 300aagctgtaat cttcggccgt ttctgccttt ctgcagcaaa cggttgaaga aaagccgcgt 360cttttgggcg gatttcgcgg aggccgcttg aggtttttag gcgtggttcg tgtgagcttc 420tctttggaat ttgtggggga aagagtgagg gagggaggga gctcagtggg agag atg 477Met1gag ggg aat ttg ccg ccg aga gga gcc ctt gtc cat ggc cat ggc ggc 525Glu Gly Asn Leu Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val His Gly His Gly Gly51015ggc gtc ggc gcc ttc gat ctg gag gcg acg atg cag ccg ccg ccg ccg 573Gly Val Gly Ala Phe Asp Leu Glu Ala Thr Met Gln Pro Pro Pro Pro202530ttc cac ttc gcc cag gat ccg cac ctc cac cac cac cag ggc atg gtc 621Phe His Phe Ala Gln Asp Pro His Leu His His His Gln Gly Met Val354045ccc gtc cgc ggg aac ccg atg ctg gat ttg ggc aat gtg gtc aag acc 669Pro Val Arg Gly Asn Pro Met Leu Asp Leu Gly Asn Val Val Lys Thr
50556065tcg ccg age gac gag gag gac gtg gat gac ggc cac cac cat ggt ggc 717Ser Pro Ser Asp Glu Glu Asp Val Asp Asp Gly His His His Gly Gly707580ggc ggc ggc age ggt aag gag gcc tcc cag tgg cac egg gtg aag tgg 765Gly Gly Gly Ser Gly Lys Glu Ala Ser Gln Trp His Arg Val Lys Trp859095ate agt ggc atg gtc aag ctg ctg gtg tcc gcc gtg gcc tac ate gac 813lie Ser Gly Met Val Lys Leu Leu Val Ser Ala Val Ala Tyr lie Asp100105110gag gac gtc gac atg gac tac ggc acg ggc age gcc gcg agg agg aag 861Glu Asp Val Asp Met Asp Tyr Gly Thr Gly Ser Ala Ala Arg Arg Lys115120125cac gcc atg ctg aag agg aag ggg aag tgg agg ctc gtc tcc gcg gcg 909His Ala Met Leu Lys Arg Lys Gly Lys Trp Arg Leu Val Ser Ala Ala130135140145atg acc gag agg ggc ttc ccg gtg tcg ccg cag cag tgc gag gac aag 957Met Thr Glu Arg Gly Phe Pro Val Ser Pro Gln Gln Cys Glu Asp Lys150155160ttc aac gat ctc aac aag agg tac aag agg atg acc gag ate ctt ggc 1005Phe Asn Asp Leu Asn Lys Arg Tyr Lys Arg Met Thr Glu lie Leu Gly165170175egg gga acg gcg tgc cag gtc gtc gag cac ccc gag ctt ctt gag ggg 1053Arg Gly Thr Ala Cys Gln Val Val Glu His Pro Glu Leu Leu Glu Gly180185190atg egg ctc tcg gga aag ctc aaa gag gag get agg aag cac ctg aac 1101Met Arg Leu Ser Gly Lys Leu Lys Glu Glu Ala Arg Lys His Leu Asn195200205tea aag cat ctg cac tat gag gag atg tgc tcg tac cat aac agg aac 1149Ser Lys His Leu His Tyr Glu Glu Met Cys Ser Tyr His Asn Arg Asn210215220225aaa atg tgt ctg ttt gat gat ccc gcc ctt cag aag tea ttg cgt ttg 1197Lys Met Cys Leu Phe Asp Asp Pro Ala Leu Gln Lys Ser Leu Arg Leu230235240gcg ctt agg agt gga gag gag cgt gca aag aag aac ccg ttt ggg tat 1245Ala Leu Arg Ser Gly Glu Glu Arg Ala Lys Lys Asn Pro Phe Gly Tyr245250255gat gat gag gat ttt tct gac gat gac gac gaa gat gaa gaa ttc gat 1293Asp Asp Glu Asp Phe Ser Asp Asp Asp Asp Glu Asp Glu Glu Phe Asp
260265270gat ctg gag gtc age get gaa gat cat cac cat gga att cat ggt gcc 1341Asp Leu Glu Val Ser Ala Glu Asp His His His Gly lie His Gly Ala275280285aag agg ctg aag cat gat cag gag gag acg cat ttt ggg tct aat ctg 1389Lys Arg Leu Lys His Asp Gln Glu Glu Thr His Phe Gly Ser Asn Leu290295300305tea gaa gtt get gtt att gac atg aac aaa atg ctc tct gag gga tct 1437Ser Glu Val Ala Val lie Asp Met Asn Lys Met Leu Ser Glu Gly Ser310315320ggt ggt cca act get gaa aag agt ccc tct acc cct ggt atg cgt gat 1485Gly Gly Pro Thr Ala Glu Lys Ser Pro Ser Thr Pro Gly Met Arg Asp325330335att cga ctt gaa aaa cgc cgc ctg aag ate aaa get cag atg ctg aaa 1533lie Arg Leu Glu Lys Arg Arg Leu Lys lie Lys Ala Gln Met Leu Lys340345350att gag cag aag cat ttc aag tgg ctg agg ttc age aag gag aag gac 1581lie Glu Gln Lys His Phe Lys Trp Leu Arg Phe Ser Lys Glu Lys Asp355360365agg gaa ttg gag aag atg aga ctg gag aat gaa aag atg aaa ctg gag 1629Arg Glu Leu Glu Lys Met Arg Leu Glu Asn Glu Lys Met Lys Leu Glu370375380385aat gag egg ttg gaa ttg gag ctg aag ctt aaa gaa ata gag atg ggt 1677Asn Glu Arg Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Glu lie Glu Met Gly390395400ate aaa cca aag aag att ttt agt gat tga agccttggaa tgatagaact1727lie Lys Pro Lys Lys lie Phe Ser Asp405410agaaatggtt agagttgctg gtgatccttt tgtcttttgc aggagcttgc agatttaggg 1787tcttatatat acattgatct gtgcccctgt ttgaatttta ccttagctaa ctgcaatcgg 1847tcaagtgaat ggctattcca gttgttaagt gtttaaactt ggtactagtt ggcctttcaa 1907atgataaatg tttaagccgt ccttgtacat gcctgctgtt aactttctgc agttgtttgt 1967gtgttgctat tgacctctga gtcttttttt t1998<210>2<211>410<212>PRT<213>7jC稻(Oryza sativa)<400>2Met Glu Gly Asn Leu Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val His Gly His Gly
151015Gly Gly Val Gly Ala Phe Asp Leu Glu Ala Thr Met Gln Pro Pro Pro202530Pro Phe His Phe Ala Gln Asp Pro His Leu His His His Gln Gly Met354045Val Pro Val Arg Gly Asn Pro Met Leu Asp Leu Gly Asn Val Val Lys505560Thr Ser Pro Ser Asp Glu Glu Asp Val Asp Asp Gly His His His Gly65707580Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys Glu Ala Ser Gln Trp His Arg Val Lys859095Trp lie Ser Gly Met Val Lys Leu Leu Val Ser Ala Val Ala Tyr lie100105110Asp Glu Asp Val Asp Met Asp Tyr Gly Thr Gly Ser Ala Ala Arg Arg115120125Lys His Ala Met Leu Lys Arg Lys Gly Lys Trp Arg Leu Val Ser Ala130135140Ala Met Thr Glu Arg Gly Phe Pro Val Ser Pro Gln Gln Cys Glu Asp145150155160Lys Phe Asn Asp Leu Asn Lys Arg Tyr Lys Arg Met Thr Glu lie Leu165170175Gly Arg Gly Thr Ala Cys Gln Val Val Glu His Pro Glu Leu Leu Glu180185190Gly Met Arg Leu Ser Gly Lys Leu Lys Glu Glu Ala Arg Lys His Leu195200205Asn Ser Lys His Leu His Tyr Glu Glu Met Cys Ser Tyr His Asn Arg210215220Asn Lys Met Cys Leu Phe Asp Asp Pro Ala Leu Gln Lys Ser Leu Arg225230235240Leu Ala Leu Arg Ser Gly Glu Glu Arg Ala Lys Lys Asn Pro Phe Gly245250255Tyr Asp Asp Glu Asp Phe Ser Asp Asp Asp Asp Glu Asp Glu Glu Phe260265270Asp Asp Leu Glu Val Ser Ala Glu Asp His His His Gly lie His Gly275280285Ala Lys Arg Leu Lys His Asp Gln Glu Glu Thr His Phe Gly Ser Asn290295300Leu Ser Glu Val Ala Val lie Asp Met Asn Lys Met Leu Ser Glu Gly305310315320.
Ser Gly Gly Pro Thr Ala Glu Lys Ser Pro Ser Thr Pro Gly Met Arg325330335Asp lie Arg Leu Glu Lys Arg Arg Leu Lys lie Lys Ala Gln Met Leu340345350Lys lie Glu Gln Lys His Phe Lys Trp Leu Arg Phe Ser Lys Glu Lys355360365Asp Arg Glu Leu Glu Lys Met Arg Leu Glu Asn Glu Lys Met Lys Leu370375380Glu Asn Glu Arg Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Glu lie Glu Met385390395400Gly lie Lys Pro Lys Lys lie Phe Ser Asp405410
權(quán)利要求
一種能夠提高鹽脅迫耐受能力的OsGTγ-1基因在水稻耐鹽性遺傳改良中的應(yīng)用，該基因是序列表SEQ NO1中第475-1707位所示的DNA序列。
2.一種能夠提高鹽脅迫耐受能力的OsGTY-I基因在水稻耐鹽性遺傳改良中的應(yīng)用， 該基因編碼的氨基酸序列如序列表SEQ NO 1第475-1707位所示。
3.權(quán)利要求2所述的基因在提高水稻鹽脅迫耐受能力中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種GT轉(zhuǎn)錄因子家族基因OsGTγ-1基因在控制水稻耐鹽性中的應(yīng)用。通過功能分析和鑒定獲得一個控制水稻耐鹽性的基因OsGTγ-1，驗證了該基因在水稻耐鹽性抗逆遺傳改良中的應(yīng)用。所述的OsGTγ-1基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQ NO1中第475-1707位所示的核苷酸序列；或編碼與1)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。將含OsGTγ-1基因的核苷酸序列與外源啟動子連接后轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性得到顯著提高。
文檔編號C07K14/415GK101812462SQ20091027324
公開日2010年8月25日 申請日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者方玉潔, 熊立仲 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)