脫除掌葉半夏病毒的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于作物脫除病毒的方法，特別是指一種脫除掌葉半夏病毒的方法。采用低溫處理、高溫處理、消毒處理、切取珠芽培養(yǎng)、叢芽培養(yǎng)或誘導(dǎo)、生根培養(yǎng)；二次脫毒；經(jīng)病毒檢測(cè)、獲得脫毒原種苗；經(jīng)組培擴(kuò)繁、煉苗移栽等方法獲得掌葉半夏脫毒種苗。本發(fā)明解決了掌葉半夏脫除病毒技術(shù)問(wèn)題，為生產(chǎn)提供脫毒掌葉半夏種苗，具有原理運(yùn)用得當(dāng)，方法易行，可有效為掌葉半夏的人工大面積種植，提高掌葉半夏的產(chǎn)量和進(jìn)一步保障其質(zhì)量等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物脫除病毒的方法，特別是指一種脫除掌葉半夏病毒的方法。 脫除掌葉半夏病毒的方法

【背景技術(shù)】
[0002] 掌葉半夏（Pinellia pedatisecta Schott)為天南星科半夏屬植物，又名虎掌南 星，多年生草本。葉片掌狀分裂，小葉9-11片，葉柄纖細(xì)柔弱，淡綠色，長(zhǎng)45?65厘米；肉穗 花序頂生，花序柄與葉柄等長(zhǎng)或稍長(zhǎng)；佛焰苞淡綠色，披針形，下部筒狀，長(zhǎng)圓形，先端銳尖， 長(zhǎng)8-14厘米：花單性，無(wú)花被，雌雄同株；雄花著生在花序上端，雄蕊密集成圓筒狀，長(zhǎng)約6 毫米，
[0003] 有香蕉香氣；雌花著生在花序下部，貼生于苞片上，長(zhǎng)約1. 5厘米；花序先端附屬 物線(xiàn)狀，長(zhǎng)約9厘米，稍彎曲。漿果卵圓形，綠色，長(zhǎng)4-5毫米，徑2?3毫米，內(nèi)含種子1粒。 花期6-7月。
[0004] 掌葉半夏以塊莖入藥，塊莖近球形，類(lèi)似半夏，但較大，徑約3-4厘米，外皮粗糙， 褐色，有時(shí)尚留有已枯葉柄的基部。剝?nèi)ネ馄轭?lèi)白色而呈粉狀，上部散有細(xì)凹點(diǎn)。本品在 江蘇、河北、河南、山西等地作半夏使用。掌葉半夏塊莖供藥用，"味辛，性平，有毒。能化痰 止咳祛風(fēng)痰、消腫，止痛，治毒蛇咬傷及無(wú)名腫毒，治口眼歪斜、半身不遂、破傷風(fēng)、蛇蟲(chóng)咬傷 等。
[0005] 近年來(lái)掌葉半夏人工種植面積不斷擴(kuò)大，但掌葉半夏病毒感染嚴(yán)重，發(fā)病面積達(dá) 90%以上，發(fā)病植株葉片扭曲，布滿(mǎn)褪綠病斑，為典型的煙草花葉病毒癥狀；由于存在掌葉 半夏田間感病植株高溫夏季多發(fā)現(xiàn)象，可能同時(shí)也感染類(lèi)病毒，類(lèi)病毒高溫發(fā)作，需要低溫 處理方能脫除。感病植株矮化，生長(zhǎng)緩慢，甚至整株死亡，產(chǎn)量和質(zhì)量大幅度下降。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種脫除掌葉半夏病毒的方法，以獲得掌葉半夏脫毒種 苗。
[0007] 本發(fā)明的整體技術(shù)方案是：
[0008] 脫除掌葉半夏病毒的方法，包括如下工藝步驟：
[0009] a、低溫處理
[0010] 在自然條件下越冬的掌葉半夏根部覆土 3-5厘米，當(dāng)根部地溫在一 2°C - 3°C時(shí)， 挖開(kāi)根部土壤，取掌葉半夏剛剛萌動(dòng)的芽尖；
[0011] b、高溫處理
[0012] 將取下的芽尖涮洗干凈，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置到培養(yǎng)箱中進(jìn)行在溫 度為50°C，高溫處理15分鐘；
[0013] c、消毒處理
[0014] 將高溫處理過(guò)的芽尖用肥皂水涮洗干凈，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行滅菌處理；
[0015] d、切取珠芽培養(yǎng)：
[0016] 將消毒好的芽尖，在超凈工作臺(tái)上，雙目實(shí)體解剖鏡下，解剖針剝?nèi)?.3-0. 5mm大 小的芽尖生長(zhǎng)點(diǎn)，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得叢生芽或愈傷組織；
[0017] e、叢芽培養(yǎng)或誘導(dǎo)
[0018] el、獲得的叢生芽可直接轉(zhuǎn)接到第一分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)；
[0019] e2、獲得的愈傷組織經(jīng)進(jìn)一步調(diào)控培養(yǎng)，成疏松愈傷組織后，轉(zhuǎn)接到第二分化培養(yǎng) 基上誘導(dǎo)培養(yǎng)叢生芽；
[0020] f、生根培養(yǎng)
[0021] 將步驟e中獲得的叢生芽經(jīng)多代分化轉(zhuǎn)接，形成無(wú)根組培苗，然后轉(zhuǎn)接到生根培 養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，生成可移栽的瓶苗；
[0022] g、二次脫毒
[0023] 將步驟f中制成的生根瓶苗置于光照培養(yǎng)箱中在38°C高溫處理30天，再切取莖尖 生長(zhǎng)點(diǎn)，培養(yǎng)成植株；
[0024] h、植株病毒檢測(cè)
[0025] 用酶鏈免疫吸附法檢測(cè)步驟g中獲得的植株，獲得脫除了煙草花葉病毒的掌葉半 夏原種苗；
[0026] i、煉苗移栽
[0027] 利用組培快繁技術(shù)，對(duì)步驟h脫毒的掌葉半夏原種苗進(jìn)行快速繁育，獲得掌葉半 夏脫病毒種苗。
[0028] 本發(fā)明的具體工藝步驟和工藝方法還有：
[0029] 為對(duì)掌葉半夏根部形成較好防護(hù)，同時(shí)便于測(cè)量其根部地溫，優(yōu)選的實(shí)施方式是， 所述的步驟a中在掌葉半夏的根部覆土表面鋪設(shè)有防護(hù)罩，采用地溫表測(cè)量根部地溫。
[0030] 所述的步驟a中芽尖的長(zhǎng)度為0. 3-0. 5cm。
[0031] 所述的步驟b中將取下的芽尖用肥皂水涮洗干凈。
[0032] 步驟c中的滅菌處理可以采用多種實(shí)現(xiàn)方式，均脫離本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)，其中較 為常見(jiàn)且優(yōu)選的實(shí)施方式是，所述的步驟c中的滅菌處理是采用酒精溶液將芽尖表面滅菌 10 - 20秒，然后用0. 1 %升汞溶液滅菌1-3分鐘，無(wú)菌水沖洗3-5次后用滅菌濾紙吸凈芽 體表面水分，以備切取珠芽。
[0033] 所述的步驟d中切取珠芽培養(yǎng)中誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基由下列組分組成：
[0034] MS+6_BA1. 0mg/kg+IBA0· 〇5mg/kg+ 鹿糖 3〇g/L+ 瓊脂 5g/L，pH = 5· 8 ;
[0035] 培養(yǎng)條件是：溫度25-28 °C，光照2000- 3000Lx。
[0036] 所述的步驟e中第一分化培養(yǎng)基的組成為：MS+6-BA2. 5mg/kg+IBA0. lmg/kg+鹿糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH = 5· 8 ;第二分化培養(yǎng)基的組成為：MS+6-BA2. 0mg/kg+IBA0· lmg/kg+ 鹿糖30g/L+瓊脂5g/L。
[0037] 所述的步驟f中生根培養(yǎng)基的組成是：1/2MS+NAA1. 0mg/kg+鹿糖20g/L，pH = 5· 8〇
[0038] 因掌葉半夏中所存在的病毒種類(lèi)目前學(xué)術(shù)界尚無(wú)明確定論，因此 申請(qǐng)人:采用現(xiàn)有 半夏中的病毒檢測(cè)方法和現(xiàn)有掌葉半夏中公開(kāi)的病毒檢測(cè)方法對(duì)脫毒后的種苗進(jìn)行了檢 測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)病毒的存在。
[0039] 本發(fā)明所具備的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著地技術(shù)進(jìn)步在于：
[0040] 本發(fā)明利用掌葉半夏煙草花葉病毒在高溫下鈍化的原理，經(jīng)高溫鈍化，切取莖尖 生長(zhǎng)點(diǎn)，植株的生長(zhǎng)點(diǎn)一般不帶病毒；同時(shí)由于類(lèi)病毒在低溫下基本不活動(dòng)，經(jīng)過(guò)冬季低溫 在第二年早春萌動(dòng)的牙尖生長(zhǎng)點(diǎn)基本不帶病毒；經(jīng)低溫、高溫處理，切取莖尖，培養(yǎng)成植株； 然后，將莖尖培養(yǎng)成的植株，進(jìn)行第二次脫毒后培養(yǎng)成植株。經(jīng)病毒檢測(cè)，獲得脫病毒掌葉 半夏植株。通過(guò)本發(fā)明的方法能有效獲得脫毒掌葉半夏種苗，為掌葉半夏的人工大面積種 植、提高掌葉半夏的產(chǎn)量和質(zhì)量提供了技術(shù)支撐。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 以下結(jié)合實(shí)施例本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保護(hù) 范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)，任何依據(jù)說(shuō)明書(shū)作出的等效技術(shù)手段替換，均不脫離本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0042] 實(shí)施例1
[0043] 脫除掌葉半夏病毒的方法，包括如下工藝步驟：
[0044] a、低溫處理
[0045] 在自然條件下越冬的掌葉半夏根部覆土 3-5厘米，當(dāng)根部地溫在一 2°C - 3°C時(shí)， 挖開(kāi)根部土壤，取掌葉半夏剛剛萌動(dòng)的芽尖；
[0046] b、高溫處理
[0047] 將取下的芽尖涮洗干凈，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置到培養(yǎng)箱中進(jìn)行在溫 度為50°C，高溫處理15分鐘；
[0048] c、消毒處理
[0049] 將高溫處理過(guò)的芽尖用肥皂水涮洗干凈，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行滅菌處理；
[0050] d、切取珠芽培養(yǎng)：
[0051] 將消毒好的芽尖，在超凈工作臺(tái)上，雙目實(shí)體解剖鏡下，解剖針剝?nèi)?.3-0. 5_大 小的芽尖生長(zhǎng)點(diǎn)，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得叢生芽或愈傷組織；
[0052] e、叢芽培養(yǎng)或誘導(dǎo)
[0053] el、獲得的叢生芽可直接轉(zhuǎn)接到第一分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)；
[0054] e2、獲得的愈傷組織經(jīng)進(jìn)一步調(diào)控培養(yǎng)，成疏松愈傷組織后，轉(zhuǎn)接到第二分化培養(yǎng) 基上誘導(dǎo)培養(yǎng)叢生芽；
[0055] f、生根培養(yǎng)
[0056] 將步驟e中獲得的叢生芽經(jīng)多代分化轉(zhuǎn)接，形成無(wú)根組培苗，然后轉(zhuǎn)接到生根培 養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，生成可移栽的瓶苗；
[0057] g、二次脫毒
[0058] 將步驟f中制成的生根瓶苗置于光照培養(yǎng)箱中在38°C高溫處理30天，再切取莖尖 生長(zhǎng)點(diǎn)，培養(yǎng)成植株；
[0059] h、植株病毒檢測(cè)
[0060] 用酶鏈免疫吸附法檢測(cè)步驟g中獲得的植株，獲得脫除了煙草花葉病毒的掌葉半 夏原種苗；
[0061] i、煉苗移栽
[0062] 利用組培快繁技術(shù)，對(duì)步驟h中獲得的脫毒掌葉半夏原種苗進(jìn)行快速繁育，長(zhǎng)至 3-5cm，球莖長(zhǎng)至0. 5 cm以上，在蛭石基質(zhì)上進(jìn)行移栽煉苗，獲得掌葉半夏脫病毒種苗。 [0063] 本實(shí)施例中具體工藝步驟和工藝方法還有：
[0064] 為對(duì)掌葉半夏根部形成較好防護(hù)，同時(shí)便于測(cè)量其根部溫度，優(yōu)選的實(shí)施方式是， 所述的步驟a中在掌葉半夏的根部覆土表面鋪設(shè)有防護(hù)罩，采用地溫表測(cè)量根部地溫。
[0065] 所述的步驟a中芽尖的長(zhǎng)度為0· 5cm。
[0066] 所述的步驟b中將取下的芽尖用肥皂水涮洗干凈。
[0067] 步驟c中的滅菌處理可以采用多種實(shí)現(xiàn)方式，均脫離本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)，其中較 為常見(jiàn)且優(yōu)選的實(shí)施方式是，所述的步驟c中的滅菌處理是采用酒精溶液將芽尖表面滅菌 13秒，然后用0. 1 %升汞溶液滅菌2分鐘，無(wú)菌水沖洗5次后用滅菌濾紙吸凈芽體表面水 分，以備切取珠芽。
[0068] 所述的步驟d中切取珠芽培養(yǎng)中誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基由下列組分組成：
[0069] MS+6_BA1. 0mg/kg+IBA0· 〇5mg/kg+ 鹿糖 3〇g/L+ 瓊脂 5g/L，pH = 5· 8 ;
[0070] 培養(yǎng)條件是：溫度28°C，光照2000Lx。
[0071] 所述的步驟e中第一分化培養(yǎng)基的組成為：MS+6-BA2. 5mg/kg+IBA0. lmg/kg+鹿糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH = 5· 8 ;第二分化培養(yǎng)基的組成為：MS+6-BA2. 0mg/kg+IBA0· lmg/kg+ 鹿糖30g/L+瓊脂5g/L。
[0072] 所述的步驟f中生根培養(yǎng)基的組成是：1/2MS+NAAL 0mg/kg+鹿糖20g/L，pH = 5· 8〇
[0073] 實(shí)施例2
[0074] 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于：
[0075] 所述的步驟a中芽尖的長(zhǎng)度為0· 3cm。
[0076] 所述的步驟c中的滅菌處理是采用酒精溶液將芽尖表面滅菌10秒，然后用0. 1% 升汞溶液滅菌1分鐘，無(wú)菌水沖洗3次后用滅菌濾紙吸凈芽體表面水分，以備切取珠芽。
[0077] 所述的步驟d中培養(yǎng)條件是：溫度25°C，光照3000LX。
[0078] 其余內(nèi)容同實(shí)施例1。
[0079] 實(shí)施例3
[0080] 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于：
[0081] 所述的步驟a中芽尖的長(zhǎng)度為0. 5cm。
[0082] 所述的步驟c中的滅菌處理是采用酒精溶液將芽尖表面滅菌20秒，然后用0. 1% 升汞溶液滅菌3分鐘，無(wú)菌水沖洗5次后用滅菌濾紙吸凈芽體表面水分，以備切取珠芽。
[0083] 所述的步驟d中培養(yǎng)條件是：溫度28°C，光照2000LX。
[0084] 其余內(nèi)容同實(shí)施例1。
[0085] 實(shí)施例4
[0086] 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于：
[0087] 所述的步驟a中芽尖的長(zhǎng)度為0· 4cm。
[0088] 所述的步驟c中的滅菌處理是采用酒精溶液將芽尖表面滅菌15秒，然后用0. 1% 升汞溶液滅菌2分鐘，無(wú)菌水沖洗4次后用滅菌濾紙吸凈芽體表面水分，以備切取珠芽。
[0089] 所述的步驟d中培養(yǎng)條件是：溫度26°C，光照2500LX。
[0090] 其余內(nèi)容同實(shí)施例1。
【權(quán)利要求】
1.脫除掌葉半夏病毒的方法，其特征在于包括如下工藝步驟： a、 低溫處理 在自然條件下越冬的掌葉半夏根部覆土 3-5厘米，當(dāng)根部地溫在一 2°C-3°C時(shí)，挖開(kāi) 根部土壤，取掌葉半夏剛剛萌動(dòng)的芽尖； b、 高溫處理 將取下的芽尖涮洗干凈，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置到培養(yǎng)箱中進(jìn)行在溫度為 50°C，高溫處理15分鐘； c、 消毒處理 將高溫處理過(guò)的芽尖用肥皂水涮洗干凈，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行滅菌處理； d、 切取珠芽培養(yǎng)： 將消毒好的芽尖，在超凈工作臺(tái)上，雙目實(shí)體解剖鏡下，解剖針剝?nèi)々? 3-0. 5mm大小的 芽尖生長(zhǎng)點(diǎn)，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得叢生芽或愈傷組織； e、 叢芽培養(yǎng)或誘導(dǎo) el、獲得的叢生芽可直接轉(zhuǎn)接到第一分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)； e2、獲得的愈傷組織經(jīng)進(jìn)一步調(diào)控培養(yǎng)，成疏松愈傷組織后，轉(zhuǎn)接到第二分化培養(yǎng)基上 誘導(dǎo)培養(yǎng)叢生芽； f、 生根培養(yǎng) 將步驟e中獲得的叢生芽經(jīng)多代分化轉(zhuǎn)接，形成無(wú)根組培苗，然后轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基 上進(jìn)行生根培養(yǎng)，生成可移栽的瓶苗； g、 二次脫毒 將步驟f中制成的生根瓶苗置于光照培養(yǎng)箱中在38°C高溫處理30天，再切取莖尖生長(zhǎng) 點(diǎn)，培養(yǎng)成植株； h、 植株病毒檢測(cè) 用酶鏈免疫吸附法檢測(cè)步驟g中獲得的植株，獲得脫除了煙草花葉病毒的掌葉半夏原 種苗； i、 煉苗移栽 利用組培快繁技術(shù)，對(duì)步驟h中獲得的脫毒掌葉半夏原種苗進(jìn)行快速繁育，獲得掌葉 半夏脫病毒種苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫除掌葉半夏病毒的方法，其特征在于所述的步驟a中在掌 葉半夏的根部覆土表面鋪設(shè)有防護(hù)罩，采用地溫表測(cè)量根部地溫。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫除掌葉半夏病毒的方法，其特征在于所述的步驟a中芽尖 的長(zhǎng)度為〇. 3-0. 5cm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫除掌葉半夏病毒的方法，其特征在于所述的步驟b中將取 下的芽尖用肥皂水涮洗干凈。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫除掌葉半夏病毒的方法，其特征在于所述的步驟c中的滅 菌處理是采用酒精溶液將芽尖表面滅菌10 - 20秒，然后用0. 1 %升汞溶液滅菌1-3分鐘， 無(wú)菌水沖洗3-5次后用滅菌濾紙吸凈芽體表面水分，以備切取珠芽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫除掌葉半夏病毒的方法，其特征在于所述的步驟d中切取 珠芽培養(yǎng)中誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基由下列組分組成： MS+6-BA1. Omg/kg+IBAO. 05mg/kg+ 鹿糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH = 5· 8 ; 培養(yǎng)條件是：溫度25-28°C，光照2000- 3000Lx。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫除掌葉半夏病毒的方法，其特征在于所述的步驟e中第一 分化培養(yǎng)基的組成為：MS+6-BA2. 5mg/kg+IBA0. lmg/kg+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH = 5. 8 ; 第二分化培養(yǎng)基的組成為：MS+6-BA2. Omg/kg+IBAO. lmg/kg+鹿糖30g/L+瓊脂5g/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫除掌葉半夏病毒的方法，其特征在于所述的步驟f中生根 培養(yǎng)基的組成是：1/2MS+NAA1. 0mg/kg+ 蔗糖 20g/L，pH = 5. 8。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104082149SQ201410359931
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】溫春秀, 謝曉亮, 劉靈娣, 賈東升, 劉銘, 田偉, 邊建波 申請(qǐng)人:謝曉亮