專利名稱：掌葉半夏蛋白治療宮頸癌的用途及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)涉及中藥制藥領(lǐng)域，涉及掌葉半夏蛋白治療宮頸癌的用途及其制劑。該掌葉 半夏蛋白為總蛋白具有抗宮頸癌活性。本發(fā)明還涉及含有掌葉半夏蛋白的治療宮頸癌的藥 物組合物。
背景技術(shù)：
宮頸癌是通常發(fā)生在宮頸陰道部或移行帶的鱗狀上皮細(xì)胞及頸管內(nèi)膜的柱狀上 皮細(xì)胞交界處的惡性腫瘤，約占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤50%以上，其病死率居?jì)D女惡性腫 瘤的首位，是女性最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，世界每年新發(fā)現(xiàn)的宮頸癌 45. 9萬例，僅次于乳腺癌，而我國(guó)每年新發(fā)現(xiàn)宮頸癌就有13. 5萬例，約占觀.7%。調(diào)查發(fā) 現(xiàn)，近年來宮頸癌發(fā)病有逐步年輕化趨勢(shì)。半夏為天南星科多年生草本植物，歷版《中國(guó)藥典》收載的半夏為 (PinelliaternataCThunWBriet)，半夏以干燥塊莖入藥，性溫、味辛、有毒，是一種重要 的中藥材。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在558種中藥處方中，半夏使用頻率居第22位?？捎糜谠餆峄?， 降逆止嘔，消痞散結(jié)等。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，半夏具有抗腫瘤、抗生育、降血脂、護(hù)肝和 治療冠心病等多種重要的作用。半夏屬植物全世界8種，我國(guó)產(chǎn)7種，其中6種為中國(guó) 特有，我國(guó)半夏資源分布較廣，除內(nèi)蒙、新疆、青海、西藏未見野生外，其余各省均有分布， 主產(chǎn)于四川、湖北、遼寧、河南、陜西、山西、安徽、江蘇、浙江等地。其同科植物掌葉半夏 (Pinelliapedatisec-ta khott)，其塊莖是全國(guó)多數(shù)省區(qū)習(xí)慣使用的中藥天南星的主要 來源，即虎掌南星，具有祛風(fēng)定驚、化痰散結(jié)的功能。分為野生品種和家中品種。掌葉半夏用于臨床治療“無名腫塊”在我國(guó)已有上千年的歷史，近代臨床及藥理研 究均證實(shí)其確有一定的抗腫瘤作用。1970年上海醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院曾用掌葉半夏汁 等涂抹在患處，以治療宮頸癌取得了良好的效果，故其一直被列為極有發(fā)展?jié)摿Φ目鼓[瘤 中藥之一。雖然其療效較肯定，但其有效成分仍不明確，研究表明其主要成分含有淀粉，辣 性物，掌葉半夏蛋白，苷類，酚類，留醇類，脂肪酸類，無機(jī)元素，生物堿類等多種化學(xué)成分， 早期的研究曾一度集中在脂溶性成分，認(rèn)為谷留醇是抗腫瘤主要有效成分，而其他藥 理作用和毒性作用則主要是各種生物堿所致。1991年孫光星、丁聲頌又發(fā)現(xiàn)掌葉半夏的總蛋白成份對(duì)小鼠肉瘤S-180瘤株具有 明顯的抑制作用。提示抗瘤部分可能是掌葉半夏蛋白。1999年朱銘偉、周抗美、丁聲頌等研 究中觀察到掌葉半夏總蛋白對(duì)多種卵巢癌細(xì)胞株有明顯抑制作用，證實(shí)了其抑瘤成分確實(shí) 存在于總蛋白中。目前以掌葉半夏為原料生產(chǎn)的制劑有，宮頸癌片、宮頸癌栓，其中宮頸癌片為掌葉 半夏藥材用75%乙醇提取、濃縮制得，宮頸癌栓為70%乙醇提取、濃縮后，加水沉淀，取沉 淀物制得，從理化性質(zhì)來看，二者都采用極性較小的脂溶性成分入藥，近年的公開的專利披 露了以掌葉半夏為原料或其提取物制備得到抗宮頸癌的藥物，申請(qǐng)?zhí)朇N2001100636. 6的 專利公開納米宮頸癌制劑藥物及其制備方法，申請(qǐng)?zhí)朇N2001100636. 6)公開宮頸癌滴丸及其制備方法，ZL200510056860. 8公開納米宮頸癌制劑藥物及其制備方法，采用微波提取方 法進(jìn)行提取，對(duì)提取物采用超音速射流技術(shù)制成納米微粒入藥、而“宮頸癌滴丸及其制備方 法”則采用與宮頸癌片相同的提取濃縮工藝制成滴丸，他們主要采用極性較小的成分進(jìn)行 入藥，有效成分都不明確，但已有報(bào)道認(rèn)為抗宮頸癌的活性成分是β-谷留醇。目前未見掌 葉半夏總蛋白用于治療宮頸癌的報(bào)道。對(duì)于宮頸癌目前沒有療效確切的治療藥物，而仍以放化療、手術(shù)治療為主，默 沙東(Merck)藥廠和葛蘭素史克針對(duì)可能造成宮頸癌的HPV病毒，設(shè)計(jì)研制出加衛(wèi)苗 (Gardasil)和卉妍康疫苗兩種預(yù)防宮頸癌的疫苗，但上述兩種疫苗均有導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用 發(fā)生的報(bào)道。因此在對(duì)宮頸癌治療方面，療效可靠，安全性高的藥物的出現(xiàn)顯得尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一提供了一種掌葉半夏蛋白在制造治療宮頸癌和胃癌藥物中的 運(yùn)用。本發(fā)明的目的之二提供了一種藥物組合物，包含掌葉半夏蛋白，和藥物上可接受 的輔料或載體。上述的藥物組合物，其制劑形式可以是凍干粉針劑、外用凝膠劑、溶液劑。上述的藥物組合物，所說的外用凝膠劑、外用溶液劑，其給藥途徑為陰道給藥。上述的藥物組合物，所說的外用凝膠劑，可以是普通凝膠劑，也可以是原位凝膠 劑。上述的藥物組合物，所說的凝膠劑，其PH為3. 5-5。上述的藥物組合物，所述的凍干粉針劑，其特征在于其溶解后的PH值是5-8。上述的藥物組合物所說的溶液劑，其特征在于其PH為3. 5-5。本發(fā)明的目的之三提供了含有掌葉半夏蛋白的藥物組合物用于治療宮頸癌、卵巢 癌、子宮癌、胃癌的用途。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明所說的掌葉半夏蛋白是通過下列方法獲得該方法 包括a)掌葉半夏藥材在PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液)中勻漿處理，然后在0-10°C下 浸泡5-20小時(shí)；b)離心分離，取上層棕色清液，加入硫酸銨至硫酸銨濃度達(dá)30-75%，產(chǎn)生沉淀， 于0-5°C環(huán)境中靜置16-M小時(shí)；c)再次低溫離心分離，棄上層清液，得固形物；d)將固形物溶于PBS溶液中，以PBS溶液過層析柱進(jìn)行脫鹽，收集檢測(cè)波長(zhǎng) ^Onm、吸收度大于IOOOmAU時(shí)的洗脫液，得到掌葉半夏蛋白溶液；e)隨意地，將掌葉半夏蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到掌葉半夏蛋白凍干制品。在上述方法中，步驟a)進(jìn)一步包括所說的掌葉半夏藥材為100g，將其在 300mL-800ml (優(yōu)選400-600ml)PBS溶液(也稱為磷酸鹽緩沖溶液)中用組織勻漿機(jī)勻漿 處理，再加入PBS溶液100-600mL (優(yōu)選200_400ml)，在2-6°C (優(yōu)先4°C )浸泡9-15小時(shí) (優(yōu)選12h)。在上述方法中，進(jìn)一步包括步驟b)所說的離心分離，
在上述方法中，進(jìn)一步包括步驟b)所說的硫酸銨，其濃度為50-65%，靜置環(huán)境 溫度在1-4°C，優(yōu)選4°C，16-22小時(shí)，更優(yōu)選19小時(shí)。在上述方法中，進(jìn)一步包括步驟c)所說的離心分離，其轉(zhuǎn)速為3000-7000rpm/ 分，優(yōu)選4000-6000rpm/分；離心時(shí)間為10-30分鐘，優(yōu)選為15-20分鐘。在上述方法中，進(jìn)一步包括d)所說的固形物適量和PBS溶液溶解，以PBS溶液為 流動(dòng)相，過柱的流速為lOml/min。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所說的掌葉半夏蛋白是通過下列方法獲得將IOOg掌葉半夏藥材在PBS溶液(磷酸鹽緩沖溶液)400-600ml中勻漿處理，再 加入同樣的PBS溶液200-400ml，在2-6°C，優(yōu)選4°C下浸泡10_13h ；4000-6000rpm/分轉(zhuǎn)速 離心15-20分鐘，取棕色上層清液；在清液中加入硫酸銨至硫酸銨的濃度為50-65%，產(chǎn)生 沉淀，于1-4°C (優(yōu)選4°C )下靜置16-22小時(shí)，優(yōu)選19小時(shí)，在4000-6000rpm/分轉(zhuǎn)速條 件下低溫(0_5°C )離心15-20分鐘，棄去上清液，得到固形物；將硫酸銨沉淀得到的固形物 溶于適量的PBS溶液中，以PBS溶液為流動(dòng)相過層析柱進(jìn)行脫鹽，流速lOml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) ^Onm，收集吸收度大于IOOOmAU時(shí)的洗脫液，得到掌葉半夏蛋白溶液；隨意地，可將掌葉半 夏蛋白溶液采用冷凍干燥獲得掌葉半夏蛋白凍干制品。將掌葉半夏蛋白溶液進(jìn)行冷凍干 燥達(dá)到長(zhǎng)期保存目的。每IOOg掌葉半夏經(jīng)硫酸銨沉淀、脫鹽后得固形物(凍干制品)為 0. 68-2. 03go上述方法中，按本領(lǐng)域的常規(guī)知識(shí)，掌葉半夏藥材的用量與PBS溶液的用量可適 當(dāng)變化或成比例放大或縮小。本發(fā)明所說的掌葉半夏藥材是指掌葉半夏的塊莖，干的或新鮮的均可，最好是新 鮮的。本發(fā)明所說的PBS溶液指的是磷酸鹽緩沖溶液，其pH為7. 4。本發(fā)明所說的掌葉半 夏蛋白實(shí)質(zhì)上是掌葉半夏總蛋白。為了進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)得到掌葉半夏蛋白脫鹽樣品的蛋白質(zhì)濃度及含量和糖濃度 及含量，以刀豆蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了掌葉半夏蛋白中蛋白濃度及含量和糖濃度及含量測(cè)定。儀器與材料；680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad)；水浴鍋(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備儀器廠)移液器(德 國(guó)印pendorf)；刀豆蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA試劑，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)；Bradford 蛋白定量試劑盒(包括考馬斯亮藍(lán)染色劑和小牛血清蛋白溶液，Tian Gen Biotech) ；96孔 板(Costar美國(guó))；葡萄糖(分析純，重慶北碚化學(xué)試劑廠)；苯酚(分析純，成都科龍化工 試劑廠)；濃硫酸(分析純，重慶無機(jī)化學(xué)試劑廠)。1)蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)染色法，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為小牛血清白蛋白。樣品的配制；分別精密稱取冷凍干燥后的樣品約8mg，PBS緩沖液定容至10ml，分 別精密移取脫鹽后的約1ml，精密稱取刀豆蛋白標(biāo)準(zhǔn)品C0NA5. :3mg，PBS緩沖液定容至10ml。精密移取0、2、4、6、8、10、15ul標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(lmg/ml)，以PBS溶液補(bǔ)足 至15ul，加入考馬斯亮藍(lán)染色^5ul，放置5分鐘，在570nm測(cè)定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = 8. 58X-0. 0302，相關(guān)系數(shù)r = 0. 998。同樣方法測(cè)定樣品液的蛋白濃度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì) 算其蛋白濃度，并根據(jù)下公式計(jì)算，結(jié)果見表1。
原始濃度χ 10 蛋白 = 15_
—#且χ 100%
固形物重量2)糖含量的測(cè)定以苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，以不同濃度的硫酸銨沉淀蛋白為樣品。樣品的配制；分別精密稱取冷凍干燥后的樣品約8mg，PBS緩沖液定容至10ml，分 別精密移取脫鹽后的約1ml，精密稱取刀豆蛋白標(biāo)準(zhǔn)品C0NA5. :3mg，PBS緩沖液定容至10ml。精密移取0、200、400、600、800ul葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入5%的苯酚水溶液1ml，水 補(bǔ)足至5ml，混勻后迅速加入濃硫酸細(xì)1，100°C水浴1小時(shí)，在490nm測(cè)定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線 為Y = O. 0911X+0.對(duì)1，相關(guān)系數(shù)r = 0. 990。同樣方法測(cè)定樣品液的糖溶液，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)
曲線計(jì)算其糖濃度，結(jié)果見表1。
^原、臓 X1Q X100O/O
固形物_ 重量本發(fā)明的掌葉半夏蛋白，經(jīng)過細(xì)胞活性篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，掌葉半夏蛋白對(duì)于各期宮 頸癌細(xì)胞均顯示了很好的藥理活性。本發(fā)明的掌葉半夏蛋白可開發(fā)成治療宮頸癌的各種制 劑，優(yōu)其是陰道用制劑，如陰道凝膠劑或溶液劑，和凍干粉針制劑等。在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療宮頸癌的藥物組合物，包含掌葉半 夏蛋白，和藥物上可接受的輔料或載體。在上述實(shí)施方案中，所述的藥物組合物，其制劑形式優(yōu)選凍干粉針劑、外用凝膠劑 或溶液劑。其中外用外用凝膠劑為陰道用凝膠劑，可以是普通凝膠劑，也可以是原位凝膠劑。 溶液劑為陰道用溶液劑。掌葉半夏蛋白普通凝膠劑主要由掌葉半夏蛋白、高分子基質(zhì)材料、潤(rùn)滑劑、防腐 劑、促滲透劑、穩(wěn)定劑、PH值調(diào)節(jié)劑組成，其中掌葉半夏蛋白在凝膠劑含量中不限定任何特 定范圍，只要在有效劑量范圍即可，可選為占制劑總重的0. 3 % -30 %，優(yōu)選為0. 5 % -20 %， 更優(yōu)選為至15% (以掌葉半夏總蛋白計(jì))。羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、聚乙烯 吡咯烷酮、黃原膠或他們的任意組合，高分子基質(zhì)材料用量占制劑總重量的0. 5%至10%， 優(yōu)選為"5% ；潤(rùn)滑劑選自甘油、丙二醇、透明質(zhì)酸鈉或他們的任意組合，潤(rùn)滑劑用量占 制劑總重量的2. 5%至30%優(yōu)選為5% -20% ；防腐劑選自尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊 金丙酯、苯扎溴銨或他們的任意組合，防腐劑用量占制劑總重量的0. 02%至1%，優(yōu)選為 0. 1% "0.5% ；促滲透劑選自薄荷腦、氮酮、丙二醇、肉豆蔻酸異丙酯、油酸或他們的任意組 合，促滲透劑用量占制劑總重量?jī)?yōu)選為0. 2%至5%，優(yōu)選為0. 5% -15% ；穩(wěn)定劑可選自 EDTA, EDTA-2Na、EDTA_4Na、EDTA_2NaCa或他們的任意組合，穩(wěn)定劑用量占制劑總重量?jī)?yōu)選 為0. 02%至1%，優(yōu)選為0. 1% -0.5%;PH值調(diào)節(jié)劑選自氫氧化鈉、檸檬酸、酒石酸氫鉀、海 藻酸、山梨酸、富馬酸、酒石酸、蘋果酸、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、三乙醇胺等，PH值調(diào)節(jié)劑用量以 調(diào)節(jié)PH至3. 5-5的量為準(zhǔn)，余量為水。
上述掌葉半夏蛋白普通凝膠劑的制備方法為將防腐劑、穩(wěn)定劑溶解分散于潤(rùn)滑 劑和促滲透劑的混合液中，然后將高分子材料分散于潤(rùn)滑劑和促滲透劑的混合液中，再將 掌葉半夏蛋白溶液倒入上述的混合體系中攪拌、溶脹，在攪勻后，加水至規(guī)定量，攪拌均勻， 即成凝膠劑。掌葉半夏蛋原位凝膠劑，主要由掌葉半夏蛋白、原位凝膠化物質(zhì)、增粘成分、潤(rùn)滑 劑、藥物、PH值調(diào)節(jié)劑、水組成。其中掌葉半夏蛋白在凝膠含量中不限定任何特定范圍，只 要在有效劑量范圍即可，優(yōu)選掌葉半夏蛋白的含量為占制劑總重量的0. 3%至30%，優(yōu)選 為0.5%至20%，更優(yōu)選為至15% (以掌葉半夏總蛋白計(jì))；原位凝膠化物質(zhì)選自泊 洛沙姆、卡波姆、甲基纖維素或他們的任意組合，泊洛沙姆的分子量為1000-16000，其中包 括泊洛沙姆407、泊洛沙姆388、泊洛沙姆188，卡波姆分子量為1 X 105_4X 106、甲基纖維素 分子量為2X 104-38X 104，原位凝膠化物質(zhì)用量占制劑總重量的0. 至50%，優(yōu)選為
至20% ；增粘高分子化合物選自黃原膠、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、殼聚糖、聚卡波非、 聚羧乙烯、透明質(zhì)酸鈉、聚乙烯醇、聚維酮、海藻酸鈉、聚乙烯醇、玻璃酸鈉、吉冷膠中或他們 的任意組合，增粘高分子化合物用量占制劑總重量為0 %至10 %，優(yōu)選為1 %至5 %，加入 增粘高分子化合物目的是為人體腔道表面添加保護(hù)層、延長(zhǎng)藥物在陰道表面的滯留時(shí)間。 PH值調(diào)節(jié)劑選自氫氧化鈉、檸檬酸、酒石酸氫鉀、海藻酸、山梨酸、富馬酸、抗壞血酸、酒石 酸、蘋果酸、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、三乙醇胺等，來提高較高的緩沖能力，PH值調(diào)節(jié)劑以調(diào)節(jié)PH 至3. 5-5的量為準(zhǔn)；潤(rùn)滑劑選自甘油、丙二醇、山梨醇或他們的任意組合，潤(rùn)滑劑用量占制 劑總重量為0%至10%，優(yōu)選為至5%。防腐劑選自苯甲酸、苯甲酸鈉、苯扎氯銨、苯扎 溴銨、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯或他們的任意組合防腐劑用量占制劑總重量為 0.02%至1%，優(yōu)選為0. 至0. 5%。余量用水補(bǔ)齊。掌葉半夏蛋白原位凝膠劑的制備方法，將原位凝膠物質(zhì)、增粘高分子材料分散于 潤(rùn)滑劑中，將藥物溶解在水中，在攪拌狀態(tài)下將掌葉半夏蛋白液加入到分散好的原位凝 膠物質(zhì)、增粘高分子材料混合體系中，攪拌至溶解，用PH緩沖調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)溶液PH值為 3. 5-5，溶液通過微孔濾膜過濾，加水至總量，取樣進(jìn)行質(zhì)量檢查，合格后，在無菌條件下分 裝至規(guī)定容器中，包裝即得。掌葉半夏蛋白溶液劑，主要由活性成分掌葉半夏蛋白和可藥用輔料組成，其中掌 葉半夏蛋白在外用制劑含量中不限定任何特定范圍，只要在有效劑量范圍即可，優(yōu)選為占 制劑總重的0. 3%至30%，優(yōu)選為0. 5 % -20%，最優(yōu)選1 % -15% (以掌葉半夏總蛋白計(jì))， 藥用輔料溶液占制劑總重量的70%至99.7%，優(yōu)選為80%至99%。其中藥用輔料溶液可 以選擇水、乙醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇、乙二醇或幾種的任意組合。掌葉半夏蛋白溶液劑制備方法首先稱取配方量的原料藥、輔料加入全量注射用水的約90%，攪拌，使溶解完全； 然后測(cè)定溶液的PH值，必要時(shí)用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH3. 5-5 ；再次補(bǔ)加輔料溶液至 全量；最后，除菌過濾、灌裝、封口既得溶液劑。掌葉半夏蛋白凍干粉針，主要由掌葉半夏總蛋白粉針含有作為活性成分的掌葉 半夏蛋白與可藥用輔料組成，其中掌葉半夏總蛋白在凍干粉針劑中的重量百分比可以是 0. 3-50%，優(yōu)選為10-40%，更有選為20-30% ；可藥用的輔料可以選自氯化鈉、氯化鉀、磷
酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、磷酸、鹽酸、或氫氧化鈉、甘露醇、葡萄糖或他們的任意組合。掌葉半夏蛋白凍干粉針的制備方法首先稱取配方量的掌葉半夏藥材、輔料加入全量注射用水的約90%，攪拌，使溶解 完全，測(cè)定溶液的PH值，必要時(shí)用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH4-8。然后補(bǔ)加注射用水至全 量，在上述溶液中加入0. 05%的針用活性炭，攪拌30min后，濾除活性炭和不溶性雜質(zhì)。必 要時(shí)，可以重復(fù)操作。再采用0. 22 μ m微孔濾膜進(jìn)行除菌過濾，將除菌的藥物溶液無菌灌裝 到西林瓶中一定的體積。最后在低溫真空下進(jìn)行冷凍干燥，抽真空，加塞，扎蓋，即得掌葉半 夏蛋白凍干粉針制劑。本發(fā)明的掌葉半夏蛋白用于治療宮頸癌，其用量范圍為注射IOOmg-IOOOmg/次， 最好在210-750mg/次，外用0.3%-30%制劑，1-2次/天，本發(fā)明的含有掌葉半夏蛋白的藥 物組合物用于治療宮頸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1掌葉半夏蛋白制備儀器冰箱(容聲B⑶-271)；組織勻漿機(jī)；CP224S分析天平(賽多利斯儀器有限 公司)；5804R高速冷凍離心機(jī)(印pendorf德國(guó)).取清洗后的掌葉半夏藥材100g，用pH 7. 4的PBS溶液400mL組織勻漿機(jī)，以同樣 的PBS溶液200mL在4°C浸泡12h，以6000rpm/分轉(zhuǎn)速離心15分鐘，得棕色上清液605mL， 加入硫酸銨至硫酸銨濃度達(dá)30%，進(jìn)行沉淀，于冰箱4°C靜置19小時(shí)，6000rpm/分低溫離 心15min，棄去上清液，將上面30%硫酸銨得到的固形物溶于2ml的PBS溶液，通過脫鹽層 析柱，以PBS溶液進(jìn)行脫鹽，流速lOml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，當(dāng)吸收度大于IOOOmAU時(shí)收集 洗脫液。收集得到的硫酸銨沉淀的蛋白溶液，此溶液即為所得蛋白溶液，或者采用冷凍干燥 工藝將將所得蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到固形物(凍干制品)，便于長(zhǎng)期保存。IOOg掌葉 半夏經(jīng)硫酸銨沉淀、脫鹽后得固形物為0. 68g。實(shí)施例2掌葉半夏蛋白制備儀器冰箱(容聲B⑶-271)；組織勻漿機(jī)；CP224S分析天平(賽多利斯儀器有限 公司)；5804R高速冷凍離心機(jī)(印pendorf德國(guó))。取清洗后的掌葉半夏藥材100g，用pH 7. 4的PBS溶液SOOmL組織勻漿機(jī)，以同樣 的PBS溶液IOOmL在2°C浸泡9h，以3000rpm/分轉(zhuǎn)速離心30分鐘，得棕色上清液910mL， 加入硫酸銨至硫酸銨濃度達(dá)65%，進(jìn)行沉淀，于冰箱2°C靜置16小時(shí)，3000rpm/分低溫離 心30min，棄去上清液，將上面65%硫酸銨得到的固形物溶于2ml的PBS溶液，通過脫鹽層 析柱，以PBS溶液進(jìn)行脫鹽，流速lOml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，當(dāng)吸收度大于IOOOmAU時(shí)收集 洗脫液。收集得到的硫酸銨沉淀的蛋白溶液，此溶液即為所得蛋白溶液，或者采用冷凍干燥 工藝將將所得蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到固形物，便于長(zhǎng)期保存。IOOg野生掌葉半夏經(jīng)硫 酸銨沉淀、脫鹽后得固形物為2. 03g。IOOg家種掌葉半夏經(jīng)硫酸銨沉淀、脫鹽后得固形物為 0. 81g。實(shí)施例3掌葉半夏蛋白制備儀器冰箱(容聲B⑶-271)；組織勻漿機(jī)；CP224S分析天平(賽多利斯儀器有限 公司)；5804R高速冷凍離心機(jī)(印pendorf德國(guó)).
取清洗后的掌葉半夏藥材100g，用pH 7. 4的PBS溶液300mL組織勻漿機(jī)，以同樣 的PBS溶液600mL在5°C浸泡15h，以7000rpm/分轉(zhuǎn)速離心10分鐘，得棕色上清液907mL， 加入硫酸銨至硫酸銨濃度達(dá)55%，進(jìn)行沉淀，于冰箱5°C靜置22小時(shí)，7000rpm/分低溫離 心lOmin，棄去上清液，將上面55%硫酸銨得到的固形物溶于2ml的PBS溶液，通過脫鹽層 析柱，以PBS溶液進(jìn)行脫鹽，流速lOml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，當(dāng)吸收度大于IOOOmAU時(shí)收集 洗脫液。收集得到的硫酸銨沉淀的蛋白溶液，此溶液即為所得蛋白溶液，進(jìn)一步采用冷凍干 燥工藝將所得蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到固形物，便于長(zhǎng)期保存。IOOg野生掌葉半夏經(jīng)硫 酸銨沉淀、脫鹽后得固形物為2. IOgo IOOg家種掌葉半夏經(jīng)硫酸銨沉淀、脫鹽后得固形物為 0. 76g0實(shí)施例4含有掌葉半夏蛋白0. 3%的原位凝膠取掌葉半夏蛋白0. 3g，泊洛沙姆407 30g,泊洛沙姆188 20g,海藻酸4. 0g、乳酸 2g、檸檬酸lg，酒石酸鉀0. 4g、苯甲酸1 %，氫氧化鈉(調(diào)節(jié)PH值約3. 5-5)，無菌蒸餾水至 100%。制法分別將泊洛沙姆、掌葉半夏蛋白液、海藻酸預(yù)混，將乳酸、檸檬酸、苯甲酸、酒 石酸鉀溶解在50g水中，一邊攪拌，一邊將泊洛沙姆、海藻酸預(yù)混物加入到乳酸、檸檬酸、苯 甲酸、酒石酸鉀溶液中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值約3. 5-5，持續(xù)攪拌30分鐘，確保混合均勻。 然后加水至100%，短時(shí)間攪拌混合物，靜止。然后繼續(xù)攪拌直到獲得均勻的凝膠稠度。檢 驗(yàn)PH，在3. 5-5范圍內(nèi)。實(shí)施例5含有掌葉半夏蛋白的原位凝膠取掌葉半夏蛋白lg、卡波姆0. lg，羥丙甲纖維素0.4g、尼泊金甲酯O.Olg、尼泊金 丙酯0. Olg, EDTA 0. 02g、氮酮0. 2g，甘油30g,氫氧化鈉(調(diào)節(jié)PH值約3. 5_5用量)，無菌 蒸餾水至100%。制法首先將尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、EDTA分散，溶解在氮酮和甘油混合體系 中，其次將取氫氧化鈉溶解在20g水中，再次分別將卡波姆、羥丙甲纖維素在攪拌下緩慢加 入尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、甘油、氮酮、EDTA混合體系中，再將掌葉半夏蛋白液混合、分散 于卡波姆、羥丙甲纖維素、甘油、氮酮體系中，一邊攪拌，一邊將氫氧化鈉溶液加入到上述甘 油體系中，調(diào)節(jié)PH值約3. 5-5，持續(xù)攪拌30分鐘，確保混合均勻。然后加水至100%，短時(shí) 間攪拌混合物，靜止。然后繼續(xù)攪拌直到獲得均勻的凝膠稠度。檢驗(yàn)PH，在3. 5-5范圍內(nèi)。實(shí)施例6含有掌葉半夏蛋白2. 5%的原位凝膠掌葉半夏蛋白凍干品2. 5g，泊洛沙姆407 20g，泊洛沙姆188 10g，海藻酸4. 0g、肉 豆蔻酸異丙酯15g、EDTA lg、黃原膠3g、甘油30g、乳酸2g、檸檬酸lg，酒石酸鉀0. 4g、氫氧 化鈉(調(diào)節(jié)PH值約3. 5-5)，無菌蒸餾水至100 %。制法分別將泊洛沙姆、海藻酸預(yù)混后，在攪拌下緩慢加入甘油、肉豆蔻酸異丙酯、 EDTA中，將乳酸、檸檬酸、酒石酸鉀、掌葉半夏總蛋白凍干品溶解在20g水中，一邊攪拌，一 邊將乳酸、檸檬酸、酒石酸鉀、掌葉半夏蛋白凍干品溶液加入到上述甘油體系中，用氫氧化 鈉調(diào)節(jié)PH值約3. 5-5，持續(xù)攪拌30分鐘，確?；旌暇鶆?。然后加水至100%，短時(shí)間攪拌混 合物，靜止。然后繼續(xù)攪拌直到獲得均勻的凝膠稠度。檢驗(yàn)PH，應(yīng)在3. 5-5范圍內(nèi)。實(shí)施例7含有掌葉半夏蛋白10%的原位凝膠掌葉半夏蛋白凍干品10g、卡波姆5g，聚乙烯吡咯烷酮lg、尼泊金甲酯0. 02g、EDTA0. 02g、氮酮0. 2g，甘油30g，氫氧化鈉(調(diào)節(jié)PH值約3. 5-5用量)，無菌蒸餾水至100%。制法首先將尼泊金甲酯、EDTA分散，溶解在氮酮和甘油混合體系中，其次將取氫 氧化鈉和掌葉半夏蛋白凍干品分別溶解在20g水中，再次分別將卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮 在攪拌下緩慢加入尼泊金甲酯、甘油、氮酮、EDTA混合體系中，然后將掌葉半夏蛋白液分散 于卡波姆、羥丙甲纖維素、甘油、氮酮體系中，一邊攪拌，一邊將氫氧化鈉溶液加入到上述甘 油體系中，調(diào)節(jié)PH值約3. 5-5，持續(xù)攪拌30分鐘，確?；旌暇鶆?。然后加水至100%，短時(shí) 間攪拌混合物，靜止。然后繼續(xù)攪拌直到獲得均勻的凝膠稠度。檢驗(yàn)PH，應(yīng)在3. 5-5范圍 內(nèi)。實(shí)施例8含有掌葉半夏蛋白30%的原位凝膠掌葉半夏總蛋白凍干品30g，泊洛沙姆4075g，泊洛沙姆5g，透明質(zhì)酸鈉0. 4g、甘油 Sg、尼泊金乙酯1 %，氫氧化鈉(調(diào)節(jié)PH值約3. 5-5)，無菌蒸餾水至100%。制法分別將泊洛沙姆、羥丙甲纖維素、尼泊金乙酯、透明質(zhì)酸鈉混后，在攪拌下緩 慢加入甘油中，將掌葉半夏蛋白和氫氧化鈉分別溶解在20g水中，一邊攪拌，一邊將掌葉半 夏總蛋白溶液加入到上述甘油體系中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值約3. 5-5，持續(xù)攪拌30分鐘，確 保混合均勻。然后加水至100%，短時(shí)間攪拌混合物，靜止。然后繼續(xù)攪拌直到獲得均勻的 凝膠稠度。檢驗(yàn)PH，在3. 5-5范圍內(nèi)。實(shí)施例9含有掌葉半夏蛋白0. 3%的凝膠掌葉半夏總蛋白0. 3g、卡波姆2. 0g、丙二醇10g、EDTA_2Na 0. 05g、氮酮0. 2g、尼泊 金甲酯0. lg、三乙醇胺適量(調(diào)PH至3. 5-5的量)蒸餾水加至100g。制法將尼泊金甲酯分散溶解到氮酮、丙二醇、EDTA-2Na體系中，將卡波姆分散到 上述體系中，取處方量的掌葉半夏蛋白液混合到卡波姆分散液中，加三乙醇胺調(diào)PH至透明 粘稠狀，最后加蒸餾水至足量，分裝即可。實(shí)施例10含有掌葉半夏蛋白的凝膠掌葉半夏蛋白lg、卡波姆5. 0g、丙二醇10g、EDTA-2Na 0. 02g、氮酮15g、尼泊金丙 酯0. 02g、三乙醇胺適量(調(diào)PH至3. 5-5的量)蒸餾水加至100g。制法將尼泊金丙酯分散溶解到氮酮、丙二醇、EDTA-2Na體系中，將卡波姆分散到 上述體系中，取處方量的掌葉半夏蛋白液混合到卡波姆分散液中，加三乙醇胺調(diào)PH至透明 粘稠狀，最后加蒸餾水至足量，分裝即可。實(shí)施例11含有掌葉半夏蛋白2. 5%的凝膠掌葉半夏蛋白凍干品2.5g、卡波姆10g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、甘油30g、 EDTA-2NaO. 05g、氮酮15g、尼泊金丙酯0. 2g、三乙醇胺適量(調(diào)PH至3. 5-5的量)蒸餾水 加至IOOg0制法將尼泊金丙酯分散溶解到氮酮、甘油、EDTA_2Na體系中，將卡波姆、聚乙烯 吡咯烷酮分散到上述體系中，取處方量掌葉半夏總蛋白凍干品用20g水溶解，將掌葉半夏 蛋白液混合到卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮分散液中，然后加入三乙醇胺，調(diào)PH至3. 5-5之間， 最后加蒸餾水至足量，分裝即可。實(shí)施例12含有掌葉半夏蛋白10%的凝膠掌葉半夏蛋白凍干品10g、羧甲基纖維素鈉5g、甘油2. 5g、EDTA_2Na 0. 05g、氮酮5 尼泊金丙酯0. 2g、酒石酸適量(調(diào)PH至3. 5-5的量)蒸餾水加至100g。
制法將尼泊金丙酯分散溶解到氮酮、EDTA_2Na、甘油體系中，將羧甲基纖維素 鈉分散到上述體系中，取將酒石酸用20g水溶解，取處方量掌葉半夏蛋白凍干品用20g水 溶解，將掌葉半夏總蛋白液混合到羧甲基纖維素鈉分散液中，然后加入酒石酸液，調(diào)PH至 3. 5-5之間，最后加蒸餾水至足量，分裝即可。實(shí)施例13含有掌葉半夏總蛋白30%的凝膠掌葉半夏蛋白凍干品30g、羧甲基纖維素鈉2g、羥丙基纖維素1.5g、甘油15g、 EDTA-2Na 0. 05g、氮酮5g、苯扎溴銨0. 5ml、酒石酸適量(調(diào)PH至3. 5-5的量)蒸餾水加至 IOOg0制法將羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素分散到氮酮、甘油、EDTA_2Na體系中，取 將酒石酸用20g水溶解，取處方量掌葉半夏總蛋白凍干品用20g水溶解，將掌葉半夏蛋白液 混合到羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素分散液中，然后加入酒石酸液，調(diào)PH至3. 5-5之間， 最后加蒸餾水至足量，分裝即可。實(shí)施例14含有掌葉半夏蛋白15%的凝膠掌葉半夏蛋白凍干品15g、羧甲基纖維素鈉0. 5g、甘油2. 5g、EDTA lg、氮酮5g、尼 泊金甲酯lg、檸檬酸適量(調(diào)PH至3. 5-5的量)蒸餾水加至100g。制法將尼泊金甲酯分散溶解到氮酮、甘油、EDTA體系中，將羧甲基纖維素鈉分散 到上述體系中，取將檸檬酸用20g水溶解，取處方量掌葉半夏蛋白凍干品用20g水溶解，將 掌葉半夏總蛋白液混合到羧甲基纖維素鈉分散液中，然后加入檸檬酸液，調(diào)PH至3. 5-5之 間，最后加蒸餾水至足量，分裝即可。實(shí)施例15含有掌葉半夏蛋白0. 3%的凍干粉針劑處方掌葉半夏蛋白0.3g氯化鈉0. 5g枸櫞酸0. 15g枸櫞酸鈉0. 15g甘露醇8gHCl或NaOH溶液適量_加入注射用水至IOOml制法將西林瓶用純化水清洗，再用注射用水沖洗干凈，180°C的烘箱內(nèi)干熱滅菌 2小時(shí)，避菌保存，備用；將注射用局部覆聚四氟乙烯膜鹵化丁基橡膠塞用純化水清洗，再 用注射用水沖洗干凈，濕熱滅菌，避菌晾干；稱取配方量的掌葉半夏蛋白、氯化鈉、甘露醇、 枸櫞酸鈉、枸櫞酸加入全量注射用水的約90%，攪拌，使溶解完全；測(cè)定溶液的pH值，必要 時(shí)用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH4-8 ；補(bǔ)加注射用水至全量；在上述溶液中加入0. 05%的 針用活性炭，攪拌30min;濾除活性炭和不溶性雜質(zhì)。必要時(shí)，可以重復(fù)操作；除菌過濾。必 要時(shí)，可以重復(fù)操作；將除菌的藥物溶液無菌灌裝到西林瓶中一定的體積；在低溫真空下 進(jìn)行冷凍干燥，抽真空，加塞，扎蓋，即得掌葉半夏蛋白凍干粉針制劑。實(shí)施例16含有掌葉半夏蛋白20%的凍干粉針劑處方
掌葉半夏蛋白氯化鈉磷酸二氫鉀HCl 或 NaOH 溶液__
20g 0. 5g 0. 25g
適量
加入注射用水至IOOml制法將西林瓶用純化水清洗，再用注射用水沖洗干凈，180°C的烘箱內(nèi)干熱滅菌 2小時(shí)，避菌保存，備用；將注射用局部覆聚四氟乙烯膜鹵化丁基橡膠塞用純化水清洗，再 用注射用水沖洗干凈，濕熱滅菌，避菌晾干；稱取配方量的掌葉半夏蛋白、氯化鈉、磷酸二氫 鉀加入全量注射用水的約90%，攪拌，使溶解完全；測(cè)定溶液的pH值，必要時(shí)用鹽酸或氫氧 化鈉溶液調(diào)節(jié)PH4-8 ；補(bǔ)加注射用水至全量；在上述溶液中加入0. 05%的針用活性炭，攪拌 30min濾除活性炭和不溶性雜質(zhì)。必要時(shí)，可以重復(fù)操作；除菌過濾。必要時(shí)，可以重復(fù)操 作；將除菌的藥物溶液無菌灌裝到西林瓶中一定的體積；在低溫真空下進(jìn)行冷凍干燥，抽 真空，加塞，扎蓋，即得掌葉半夏蛋白凍干粉針制劑。實(shí)施例17含有掌葉半夏蛋白50%的凍干粉針劑處方掌葉半夏蛋白50g氯化鈉0. 5g磷酸二氫鈉0. 2gHCl或NaOH溶液適量制法將西林瓶用純化水清洗，再用注射用水沖洗干凈，180°C的烘箱內(nèi)干熱滅菌 2小時(shí)，避菌保存，備用；將注射用局部覆聚四氟乙烯膜鹵化丁基橡膠塞用純化水清洗，再 用注射用水沖洗干凈，濕熱滅菌，避菌晾干；稱取配方量的掌葉半夏蛋白、氯化鈉、磷酸二氫 鈉加入全量注射用水的約90%，攪拌，使溶解完全；測(cè)定溶液的pH值，必要時(shí)用鹽酸或氫氧 化鈉溶液調(diào)節(jié)PH4-8 ；補(bǔ)加注射用水至全量；在上述溶液中加入0. 05%的針用活性炭，攪拌 30min;濾除活性炭和不溶性雜質(zhì)。必要時(shí)，可以重復(fù)操作；除菌過濾。必要時(shí)，可以重復(fù)操 作；將除菌的藥物溶液無菌灌裝到西林瓶中一定的體積；在低溫真空下進(jìn)行冷凍干燥，抽 真空，加塞，扎蓋，即得掌葉半夏蛋白凍干粉針制劑。實(shí)施例18含有掌葉半夏蛋白0. 3%的溶液劑掌葉半夏蛋白0.3g藥用乙醇IOg無菌注射用水加至IOOml制法將藥用乙醇和注射用水混合成注射溶媒，取80ml溶媒將處方量的掌葉半夏 蛋白溶解，測(cè)定PH，調(diào)節(jié)PH至3. 5-8，加混合溶媒至IOOml，用0. 22微米微孔濾膜過濾除菌， 在局部百級(jí)以下灌封、燈檢、包裝、成品檢驗(yàn)、入庫(kù)。
加入注射用水至IOOml
實(shí)施例19含有掌葉半夏蛋白20%的溶液劑處方掌葉半夏總蛋白20g無菌注射用水加至IOOml制法取80ml注射用水將處方量的掌葉半夏蛋白溶解，測(cè)定PH，調(diào)節(jié)PH至3. 5-8, 加混合溶媒至100ml，用0. 22微米微孔濾膜過濾除菌，在局部百級(jí)以下灌封、燈檢、包裝、成 品檢驗(yàn)、入庫(kù)。實(shí)施例20含有掌葉半夏蛋白30%的溶液劑處方掌葉半夏蛋白30g丙二醇25g無菌注射用水加至IOOml制法將藥用丙二醇和注射用水混合成注射溶媒，取80ml溶媒將處方量的掌葉半 夏蛋白溶解，測(cè)定PH，調(diào)節(jié)PH至3. 5-8，加混合溶媒至100ml，用0. 22微米微孔濾膜過濾除 菌，在局部百級(jí)以下灌封、燈檢、包裝、成品檢驗(yàn)、入庫(kù)。實(shí)施例21掌葉半夏蛋白中蛋白濃度及含量和糖濃度及含量測(cè)定680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad)；水浴鍋(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備儀器廠)移液器(德 國(guó)印pendorf)；刀豆蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA試劑，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)；Bradford 蛋白定量試劑盒(包括考馬斯亮藍(lán)染色劑和小牛血清蛋白溶液，Tian Gen Biotech) ；96孔 板(Costar美國(guó))；葡萄糖(分析純，重慶北碚化學(xué)試劑廠)；苯酚(分析純，成都科龍化工 試劑廠)；濃硫酸(分析純，重慶無機(jī)化學(xué)試劑廠)。1)蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)染色法，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為小牛血清白蛋白。樣品的配制；分別精密稱取冷凍干燥后的樣品約8mg，PBS緩沖液定容至10ml，分 別精密移取脫鹽后的約1ml，精密稱取刀豆蛋白標(biāo)準(zhǔn)品C0NA5. :3mg，PBS緩沖液定容至10ml。精密移取0、2、4、6、8、10、15ul標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(lmg/ml)，以PBS溶液補(bǔ)足 至15ul，加入考馬斯亮藍(lán)染色^5ul，放置5分鐘，在570nm測(cè)定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = 8. 58X-0. 0302，相關(guān)系數(shù)r = 0. 998。同樣方法測(cè)定樣品液的蛋白濃度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì) 算其蛋白濃度，并根據(jù)公式結(jié)果見表2。
權(quán)利要求
1.掌葉半夏蛋白在制造治療宮頸癌和胃癌藥物中的運(yùn)用。
2.如權(quán)利要求1所述的運(yùn)用，所說的掌葉半夏蛋白由下述方法制得，該方法包括a)掌葉半夏藥材在PBS溶液中勻漿處理，然后在溫度為0-10°C下浸泡5-20小時(shí)；b)離心分離，取上層棕色清液，加入硫酸銨至硫酸銨濃度達(dá)30-75%，進(jìn)行沉淀，于 0-5 °C環(huán)境中靜置12-M小時(shí)；c)再次低溫離心分離，棄上層清液，得固形物；d)將固形物溶于PBS溶液中，以PBS溶液過層析柱進(jìn)行脫鹽，收集檢測(cè)波長(zhǎng)280nm， 吸收度大于IOOOmAU時(shí)的洗脫液，得到掌葉半夏蛋白溶液；e)隨意地，將掌葉半夏蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到掌葉半夏蛋白凍干制品。
3.—種藥物組合物，包含掌葉半夏蛋白，和藥物上可接受的輔料或載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其制劑形式可以是凍干粉針劑、外用凝膠劑、溶液劑；
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，所說的外用凝膠劑、外用溶液劑，其給藥途徑為陰道 給藥；
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，所說的外用凝膠劑，可以是普通凝膠劑，也可以是原 位凝膠劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，所說的凝膠劑，其PH為3.5-5。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，所述的凍干粉針劑，其特征在于其溶解后的PH值 是 5-8。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，所說的溶液劑，其特征在于其PH為3.5-5。
10.權(quán)利要求3-9中任一所述的組合物，用于治療宮頸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及掌葉半夏蛋白治療宮頸癌的用途及其制劑。該掌葉半夏蛋白為總蛋白，是通過提取掌葉半夏的塊莖而得，具有抗宮頸癌活性，其活性明顯強(qiáng)于5-氟尿嘧啶。本發(fā)明還涉及含有掌葉半夏蛋白的治療宮頸癌的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K125/00GK102106944SQ20091025098
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者丁彥吉, 張濤, 曾凡新, 潘正, 鄧杰, 鐘怡 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司