一種黃毛藜豆的組培快繁方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種黃毛藜豆的組培快繁方法，該方法包括黃毛藜豆外植體的采集與消毒；黃毛藜豆叢生芽的誘導(dǎo)與增殖；黃毛藜豆壯苗生根培養(yǎng)；黃毛藜豆的煉苗與移栽。本發(fā)明可有效解決黃毛藜豆種子不易收集，且在自然條件下種子發(fā)芽率低等問題，可滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展過程中建設(shè)生態(tài)膠園、油棕園、果園套種豆科綠肥對種苗日益增長的市場需求。
【專利說明】一種黃毛藜豆的組培快繁方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種黃毛藜豆的組培快繁方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃毛藥豆 CMjcuna bracteata T)C· ex Kurz)，屬豆科（Leguminosae)藜豆屬 (Mucuna)多年生纏繞藤本，生于海拔600-2000米的林中或草地、山坡、路邊或溪旁，主要分 布于馬來西亞、緬甸、泰國、越南等東南亞國家，我國云南和海南也有零星分布。其寄生根瘤 菌具有生物固氮功能，且在豐富土壤營養(yǎng)物質(zhì)、改良土壤物理性狀和提高土壤保水保肥性 能等方面具有重要作用，因此，在巴西橡膠樹、油棕等經(jīng)濟(jì)作物的種植過程中常以黃毛藜豆 作為覆蓋作物。
[0003] 近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的種植和耕作模式已經(jīng)不能適應(yīng)現(xiàn) 代社會的發(fā)展需要，推廣應(yīng)用綠肥套種技術(shù)建設(shè)生態(tài)膠園、油棕園、果園，建設(shè)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、 低耗的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，走生態(tài)農(nóng)業(yè)道路是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展方向之一。黃毛藜豆作為一種理 想的綠肥覆蓋植物，被廣泛應(yīng)用于橡膠、油棕等多種重要經(jīng)濟(jì)作物的種植過程中，對其種苗 的需求量也急劇增加。然而，由于黃毛藜豆存在種子不易收集，且種子在自然條件下發(fā)芽率 低等問題，種苗的需求量已經(jīng)呈現(xiàn)出明顯的供不應(yīng)求趨勢。通過組織培養(yǎng)途徑實(shí)現(xiàn)黃毛藜 豆的人工繁殖可滿足日益增長的市場需求，目前，有關(guān)黃毛藜豆組織培養(yǎng)形成再生植株尚 未見報(bào)道。本發(fā)明以黃毛藜豆無菌苗子葉節(jié)為外植體誘導(dǎo)叢生芽，最終實(shí)現(xiàn)植株再生。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是解決黃毛藜豆種子不易收集，且自然條件下發(fā)芽率低，而目前生 產(chǎn)上對其種苗的需求量急劇增加的問題，通過采用生物技術(shù)手段，提供一種黃毛藜豆的組 培快繁方法，以建立一個高效的黃毛藜豆組培快繁技術(shù)體系。
[0005] 本發(fā)明解決所述技術(shù)問題的方案是：一種黃毛藜豆的組培快繁方法，它包括以下 步驟： 1) 黃毛藜豆外植體的采集與消毒：采集黃毛藜豆成熟、健康的種子，用清水洗凈后置于 超凈工作臺上，先用體積百分比濃度70%?75%乙醇處理20?40s，無菌水沖洗4?5遍后 用0. 05 %?0. 15 %的HgCl2水溶液浸泡滅菌10?20min，再用無菌水沖洗4?5遍，無菌 濾紙吸干表面水分，用手術(shù)刀在種背部輕輕劃出一道小口，接種到附加30g/L蔗糖、6. 5g/L 瓊脂，pH為5. 8,且已在溫度121°C、壓力1. 1 kg · cm_2的條件下滅菌20 min的MS培養(yǎng)基 上；接種后放在溫度為27°C ±1°C，光源為日光燈，光照度為2000?3000 lx，光照時間為 12h · cT 1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)； 2) 黃毛藜豆叢生芽的誘導(dǎo)與增殖：種子經(jīng)過3?5d的培養(yǎng)后胚根伸出，10?12 d后， 上胚軸伸長，兩片子葉逐漸展開，分別將子葉展開而第一片真葉尚未展開的無菌幼苗的子 葉節(jié)切下后接種到已在溫度121 °C、壓力1. 1 kg · cnT2的條件下滅菌20 min的誘導(dǎo)叢生芽 培養(yǎng)基中，接種后放在溫度為27°C±1°C，光源為日光燈，光照度為2 000?3000 lx，光照 時間為12 h · d_ 1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；其中，該培養(yǎng)基配方為：MS+ NAA 0. 05mg / L+ 6-BA 1. 5 mg / L，附加30g/L蔗糖和6. 5g/L瓊脂，該培養(yǎng)基pH為5. 8,其中MS為基本培養(yǎng)基； 3) 黃毛藜豆壯苗生根培養(yǎng)：選擇健壯的、植株高度在5?8cm的單個叢生芽，切下后接 種到已在溫度121 °C、壓力1. 1 kg · cnT2的條件下滅菌20 min的壯苗生根培養(yǎng)基中，接種 后的叢生芽小植株放在溫度為27°C±1°C，光源為日光燈，光照度為2 000?3 000 lx，光 照時間為12 h · d_ 1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；其中，該培養(yǎng)基配方為：1/2 MS+ NAA 0. 5 mg/ L， 附加30g/L蔗糖和6. 5g/L瓊脂，該培養(yǎng)基pH為5. 8,其中1/2MS為基本培養(yǎng)基； 4) 黃毛藜豆的煉苗與移栽：取培養(yǎng)30?50 d，根系發(fā)達(dá)，植株高為10?15 cm的黃毛 藜豆組培苗，預(yù)先室內(nèi)進(jìn)行開蓋煉苗3 d，洗凈根部附著的培養(yǎng)基，放入0. 05?0. 15%多菌 靈水溶液中浸泡消毒10?20 min后，移栽到預(yù)先消毒處理過的沙床中，澆水淋透，適當(dāng)保 濕遮蔭。
[0006] 本發(fā)明通過采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，提供一種黃毛藜豆的組培快繁方法，以建立 一個高效的黃毛藜豆組培快繁技術(shù)體系，有效解決了黃毛藜豆由于種子收集難、且在自然 條件下發(fā)芽率低造成的種苗供不應(yīng)求的問題，對我國熱帶、亞熱帶地區(qū)推廣應(yīng)用綠肥套種 技術(shù)建設(shè)生態(tài)膠園、油棕園、果園，建設(shè)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、低耗的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，走"資源節(jié)約型、 環(huán)境友好型"的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)道路奠定了良好的基礎(chǔ)。

【具體實(shí)施方式】 [0007] 實(shí)施例： 1) 黃毛藜豆外植體的采集與消毒：采集黃毛藜豆成熟、健康的種子，用清水洗凈后置于 超凈工作臺上，先用體積百分比濃度75%乙醇處理30s，無菌水沖洗4遍后用0. 1%的HgCl2 水溶液浸泡滅菌15 min，再用無菌水沖洗5遍，無菌濾紙吸干表面水分，用手術(shù)刀在種背部 輕輕劃出一道小口，接種到附加30g/L蔗糖、6. 5g/L瓊脂、pH為5. 8,并已置于溫度121°C、 壓力1. 1 kg · cm_2的條件下滅菌20 min的MS培養(yǎng)基上。接種后放在溫度為27°C ±1°C， 光源為日光燈，光照度為2000?3000 lx，光照時間為12 h^cf1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)； 2) 黃毛藜豆叢生芽的誘導(dǎo)與增殖：種子經(jīng)過4 d的培養(yǎng)后胚根伸出，10d后，上胚軸伸 長，兩片子葉逐漸展開，分別將子葉展開而第一片真葉尚未展開的無菌幼苗的子葉節(jié)切下 后接種到誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為：MS+ NAA 0.05mg / L+ 6-BA L5 mg / L，附 加30g/L蔗糖和6. 5g/L瓊脂，pH為5. 8,MS為基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基在溫度121 °C、壓力1. 1 kg*cnT2的條件下滅菌20 min。切下的子葉節(jié)接種到培養(yǎng)基中后放在溫度為27°C±1°C， 光源為日光燈，光照度為2000?3000 lx，光照時間為12 h · cf 1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。30d 后，增殖系數(shù)可達(dá)10以上； 3) 黃毛藜豆壯苗生根培養(yǎng)：選擇健壯的、植株高度在5?8cm左右的單個叢生芽，切下 后接種在壯苗生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為：1/2 MS+ NAA 0. 5 mg/ L，附加30g/L蔗糖和 6. 5g/L瓊脂，pH為5. 8,1/2MS為基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基在溫度121°C、壓力1. 1 kg · cm_2的 條件下滅菌20min。接種到壯苗生根培養(yǎng)基中的叢生芽小植株放在溫度為27°C ±1°C，光 源為日光燈，光照度為2000?3000 lx，光照時間為12h ·(!_1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，10?15 天后小植株基部長出數(shù)條根，生根率可達(dá)85%以上，即長成完整植株，達(dá)到移栽標(biāo)準(zhǔn)； 4) 黃毛藜豆的煉苗與移栽：取培養(yǎng)40d，根系發(fā)達(dá)，植株高為10?15 cm的黃毛藜豆 組培苗，預(yù)先室內(nèi)進(jìn)行開蓋煉苗3 d，洗凈根部附著的培養(yǎng)基，放入0. 1%多菌靈水溶液中浸 泡消毒15 min后，移栽到預(yù)先消毒處理過的沙床中，澆水淋透，保濕遮蔭7d，其間每天通風(fēng) 透氣lOmin兩次，移栽成活率為95%以上，一周后即可挖苗上山定植。
[0008] 上述中，除非另有說明，百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度。
【權(quán)利要求】
1. 一種黃毛藜豆的組培快繁方法，其特征在于，它包括以下步驟： 1) 黃毛藜豆外植體的采集與消毒：采集黃毛藜豆成熟、健康的種子，用清水洗凈后置于 超凈工作臺上，先用體積百分比濃度70%?75%乙醇處理20?40s，無菌水沖洗4?5遍后 用0. 05 %?0. 15 %的HgCl2水溶液浸泡滅菌10?20min，再用無菌水沖洗4?5遍，無菌 濾紙吸干表面水分，用手術(shù)刀在種背部輕輕劃出一道小口，接種到附加30g/L蔗糖、6. 5g/L 瓊脂，pH為5. 8,且已在溫度121°C、壓力1. 1 kg · cm_2的條件下滅菌20 min的MS培養(yǎng)基 上；接種后放在溫度為27°C ±1°C，光源為日光燈，光照度為2000?3000 lx，光照時間為 12h · cT 1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)； 2) 黃毛藜豆叢生芽的誘導(dǎo)與增殖：種子經(jīng)過3?5d的培養(yǎng)后胚根伸出，10?12 d后， 上胚軸伸長，兩片子葉逐漸展開，分別將子葉展開而第一片真葉尚未展開的無菌幼苗的子 葉節(jié)切下后接種到已在溫度121 °C、壓力1. 1 kg · cnT2的條件下滅菌20 min的誘導(dǎo)叢生芽 培養(yǎng)基中，接種后放在溫度為27°C±1°C，光源為日光燈，光照度為2 000?3000 lx，光照 時間為12 h · d_ 1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；其中，該培養(yǎng)基配方為：MS+ NAA 0. 05mg / L+ 6-BA 1. 5 mg / L，附加30g/L蔗糖和6. 5g/L瓊脂，該培養(yǎng)基pH為5. 8,其中MS為基本培養(yǎng)基； 3)黃毛藜豆壯苗生根培養(yǎng)：選擇健壯的、植株高度在5?8cm的單個叢生芽，切下后 接種到已在溫度121 °C、壓力1. 1 kg · cnT2的條件下滅菌20 min的壯苗生根培養(yǎng)基中，接 種后的叢生芽小植株放在溫度為27°C±1°C，光源為日光燈，光照度為2 000?3 000 lx ，光照時間為12 h · d_ 1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；其中，該培養(yǎng)基配方為：1/2 MS+ NAA 0. 5 mg/ L，附加30g/L蔗糖和6. 5g/L瓊脂，該培養(yǎng)基pH為5. 8,其中1/2MS為基本培養(yǎng)基； 4)黃毛藜豆的煉苗與移栽：取培養(yǎng)30?50 d，根系發(fā)達(dá)，植株高為10?15 cm的黃毛 藜豆組培苗，預(yù)先室內(nèi)進(jìn)行開蓋煉苗3 d，洗凈根部附著的培養(yǎng)基，放入0. 05?0. 15%多菌 靈水溶液中浸泡消毒10?20 min后，移栽到預(yù)先消毒處理過的沙床中，澆水淋透，適當(dāng)保 濕遮蔭。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃毛藜豆的組培快繁方法，其特征在于，在步驟1)中，用 乙醇處理的時間為30s。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃毛藜豆的組培快繁方法，其特征在于，在步驟1)中， HgCl2水溶液的濃度為0. 10%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種黃毛藜豆的組培快繁方法，其特征在于，在步驟1) 中，用HgCl2水溶液浸泡滅菌時間為15min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃毛藜豆的組培快繁方法，其特征在于，在步驟4)中，多 菌靈水溶液的濃度為〇. 1%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種黃毛藜豆的組培快繁方法，其特征在于，在步驟4) 中，用多菌靈水溶液中浸泡消毒的時間為15min。
【文檔編號】A01H4/00GK104137775SQ201410352660
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】張全琪, 倪燕妹, 鄭杰, 陳海堅(jiān), 黃志 , 王力前 申請人:廣東農(nóng)墾熱帶作物科學(xué)研究所