桔小實蠅鈉離子通道基因的rna干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一種桔小實蠅鈉離子通道基因的RNA干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明利用載體PFGC5941為框架，通過雙酶切，在其內(nèi)含子兩邊分別插入桔小實蠅鈉離子通道基因的正反向特異性目的片段，構(gòu)成RNA干擾載體非常重要的區(qū)域，構(gòu)建的RNA干擾表達載體在轉(zhuǎn)化到植株后，在其強啟動子CaMV35S的驅(qū)動下，在其體細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成雙鏈RNA的“發(fā)卡結(jié)構(gòu)”，使得桔小實蠅取食植株后體內(nèi)同源基因片段的正常表達和翻譯受到影響，實現(xiàn)干擾昆蟲正常生長發(fā)育，達到植株抗桔小實蠅的目的，對桔小實蠅的控制發(fā)揮重要作用，減少化學(xué)農(nóng)藥使用量。
【專利說明】桔小實蠅鈉離子通道基因的RNA干擾載體及其構(gòu)建方法和 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種RNA干擾載體，尤其涉及一種桔小實蠅 鈉離子通道基因的RNA干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 桔小實蠅Bactrocera dorsalis又名東方果實蠅，是一種世界危險性檢疫害蟲，廣 泛分布于中國各大柑橘產(chǎn)區(qū)，使中國的柑橘產(chǎn)業(yè)面臨著嚴重威脅，每年都對柑橘為害造成 巨大經(jīng)濟損失，能危害250多種瓜果蔬菜。桔小實蠅寄主范圍廣，可危害柑橘、芒果和楊桃 等250多種水果蔬菜和作物。隨著氣候變化、種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整和國際貿(mào)易的增加，其危害面 積逐漸擴大，給果蔬業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。目前化學(xué)防治仍是控制桔小實蠅的重要措施， 然而近年來對桔小實蠅種群抗藥性監(jiān)測表明，其抗藥性上升非?？臁?br> [0003] RNA干擾（RNA interference,RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默現(xiàn)象，它是 指通過雙鏈RNA的介導(dǎo)的特異性的降解對應(yīng)序列的mRNA，從而特異性地抑制相應(yīng)基因的表 達，是植物對外來入侵者的一種重要的防御機制。基于RNA干擾技術(shù)獲得抗昆蟲的轉(zhuǎn)基因 材料已在水稻、蔬菜和棉花等作物上取得成功。昆蟲鈉離子通道是神經(jīng)細胞傳導(dǎo)興奮的基 礎(chǔ)，同時，鈉離子通道基因還與昆蟲產(chǎn)生擊倒抗性有關(guān)。目前還沒有人將桔小實蠅鈉離子 通道基因用于構(gòu)建RNA干擾載體對桔小實蠅進行控制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種桔小實蠅鈉離子通道基因的RNA干擾載體，該載體含有 桔小實蠅鈉離子通道基因目的片段，得到的轉(zhuǎn)基因植株可以使取食該植株的桔小實蠅發(fā)生 RNA沉默現(xiàn)象，使得轉(zhuǎn)基因植株對桔小實蠅具有一定抗性。
[0005] 本發(fā)明還提供干擾鈉離子通道基因表達載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用，為利用RNA干擾 技術(shù)的植物抗蟲育種工程提供了一種新的策略和思路。
[0006] 桔小實蠅鈉離子通道基因的RNA干擾載體，包括骨架載體和正、反義鏈，其特征在 于：以桔小實蠅鈉離子通道基因部分片段為正或反義鏈，所述鈉離子通道基因部分片段序 列如SEQ ID N0. 1，所述骨架載體為PFGC5941載體。
[0007] 所述正義鏈插入在酶切位點Xhol和Ncol之間，反義鏈插入在酶切位點Xball和 BamHI之間。
[0008] 桔小實蠅鈉離子通道基因的RNA干擾載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0009] 1)鈉離子通道基因目的片段與質(zhì)粒的連接
[0010] 提取桔小實蠅總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以SEQ ID N0. 2和SEQ ID NO. 3為引物對鈉離子通道基因的正向目的片段進行PCR擴增，以SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5為引物對鈉離子通道基因的反向目的片段進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，目的片段約為 550bp，回收PCR產(chǎn)物，與載體pMD-19連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到重組質(zhì)粒PMD-19-C1R1 和PMD-19-C2R2,進行序列驗證，測序正確的目的片段即可用于RNA干擾載體的構(gòu)建；所述 SEQ ID NO. 2?5的序列如下：
[0011] SEQ ID N0. 2 :5, -GCCATGGCAGATGGTGATTTGCCTCGT-3,；
[0012] SEQ ID NO. 3 :5' -CCATGGATATCGCCATGTATAGTGAA-3' ；
[0013] SEQ ID NO. 4 :5' -GCTCTAGAGCCAGATGGTGATTTGCCTCGT-3' ；
[0014] SEQ ID NO. 5 :5' -CGGGATCCATATCGCCATGTATAGTGAA-3' ；
[0015] 2)鈉離子通道基因的RNA干擾載體的構(gòu)建
[0016] 將上述測序正確的鈉離子通道基因正向目的片段質(zhì)粒pMD-19-ClRl與載體 PFGC5941分別用Xhol和Ncol雙酶切，將pMD-19-ClRl與載體PFGC5941的酶切產(chǎn)物進行連 接得到插入正向目的片段的重組質(zhì)粒PFGC5941-C1R1 ;將PFGC5941-C1R1和鈉離子通道基 因反向目的片段質(zhì)粒PMD-19-C2R2分別用Xball和BamHI雙酶切，將酶切產(chǎn)物進行連接，即 可得到插入正、反義鏈的RNA干擾載體PFGC5941-C1R1/C2R2,經(jīng)PCR擴增檢測、核苷酸序列 分析，目的片段序列正確的干擾載體可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
[0017] 所述的桔小實蠅鈉離子通道基因的RNA干擾載體在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn) 基因植物為柑橘屬植物。
[0018] 所述應(yīng)用為將桔小實蠅鈉離子通道基因的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化有關(guān)受體植物，使之 對桔小實蠅產(chǎn)生抗性，所述受體植物為柑桔。
[0019] 所述轉(zhuǎn)化的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。
[0020] 所述農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌菌株EHA105。
[0021] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明構(gòu)建了含有桔小實蠅鈉離子通道基因正反向目的片 段的RNA干擾載體以及該載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明利用載體PFGC5941為框架，通過 雙酶切，在其內(nèi)含子兩邊分別插入桔小實蠅鈉離子通道基因的正反向特異性目的片段，構(gòu) 成RNA干擾載體非常重要的區(qū)域，為形成"發(fā)卡結(jié)構(gòu)"提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本發(fā)明構(gòu)建的RNA干擾 表達載體在轉(zhuǎn)化到植株后，在其強啟動子CaMV35S的驅(qū)動下，可以在其體細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成 雙鏈RNA的"發(fā)卡結(jié)構(gòu)"，使得桔小實蠅取食植株后體內(nèi)同源基因片段的正常表達和翻譯受 到影響，從而實現(xiàn)干擾昆蟲正常生長發(fā)育的目的，達到植株抗桔小實蠅的目的，對桔小實蠅 的控制發(fā)揮重要作用，能夠減少化學(xué)農(nóng)藥使用量，具有極其廣闊的市場前景。載體PFGC5941 還攜帶能抗除草劑的Bar基因，為轉(zhuǎn)基因苗的初步篩選提供標(biāo)記基因。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為提取的桔小實蠅總RNA的電泳圖。M:DL5000Marker。
[0023] 圖2為鈉離子通道基因正向反向目的片段的克隆電泳圖。1、2是鈉離子通道基因 正向片段電泳圖；3、4是鈉離子通道基因反向片段電泳圖；M:DL5000Marker。
[0024] 圖3為鈉離子通道基因正向反向目的片段插入載體PFGC5941位置示意圖。
[0025] 圖4為載體PFGC5941經(jīng)Xhol和Ncol酶切后的電泳圖。1、2是載體PFGC5941 ;3、 4 是經(jīng) Xhol 和 Ncol 酶切后的載體 PFGC5941 ;M 是 DL5000Marker。
[0026] 圖5為鈉離子通道基因正向片段經(jīng)Xhol和Ncol酶切后的電泳圖。1、2是經(jīng)Xhol 和Ncol酶切后的鈉離子通道基因正向片段；Μ是DL5000Marker。
[0027] 圖6為重組質(zhì)粒PFGC5941-C1R1酶切后的電泳圖。1為重組質(zhì)粒PFGC5941-C1R1 ; 2 為經(jīng) Xbal 和 BamHI 酶切后的重組質(zhì)粒 PFGC5941-C1R1 ;M 是 DL5000Marker。
[0028] 圖7為載體PFGC5941-C1R1/C2R2經(jīng)Xbal和BamHI酶切后的電泳圖。1、2是經(jīng) Xbal 和 BamHI 酶切后的重組質(zhì)粒 PFGC5941-C1R1/C2R2 ;M 是 DL5000Marker。
[0029] 圖8為陽性轉(zhuǎn)基因苗的PCR擴增檢測電泳圖。1是質(zhì)粒PFGC-C1R1/C2R2對照；2 是清水對照；3-6是陽性擴增產(chǎn)物；Μ是DL5000Marker。

【具體實施方式】
[0030] 大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 α (北京天根生化科技有限公司，中國）；
[0031] 農(nóng)桿菌ΕΗΑ105(中國農(nóng)科院柑橘研究所改良中心提供）；
[0032] 總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，中國）；
[0033] PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNAEraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，日 本）；
[0034] DNA回收純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司，中國）；
[0035] 質(zhì)粒提取試劑盒（TaKaRa公司，日本）；
[0036] pMD19-T (TaKaRa 公司，日本）；
[0037] Ncol、Xbal、Xhol、BamHI (NEB 公司，美國）；
[0038] LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨（Tryptone) 10g/L、酵母提取物（Yeast extract) 5g/L、氯 化鈉（NaCl) 10g/L ;
[0039] LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨（Tryptone) 10g/L、酵母提取物（Yeast extract) 5g/L氯 化鈉（NaCl)10g/L、瓊脂粉 15g/L。
[0040] S0C培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 ;酵母浸粉5 ;氯化鈉 0. 5 ;氯化鉀0. 186 ;氯化鎂0. 95 ;硫 酸鎂 1. 2 ;葡萄糖 3. 6 ; (g/L)pH7. 0
[0041] 載體PFGC5941 :本發(fā)明的載體PFGC5941由中國農(nóng)科院柑橘研究所改良中心提供， 也可向公眾提供。植物干擾表達載體PFGC5941是各研究中使用較多的植物雙元表達載體。 它含有強啟動子CaMV35S可以啟動外源基因有效表達；還有一段內(nèi)含子結(jié)構(gòu)（來源于矮牽 牛）作為間隔序列，是構(gòu)成RNA干擾載體非常重要的區(qū)域，為形成"發(fā)卡結(jié)構(gòu)"提供結(jié)構(gòu)基 礎(chǔ)；另外，PFGC5941載體還攜帶能抗除草劑的Bar基因，為轉(zhuǎn)基因苗的初步篩選提供標(biāo)記基 因。
[0042] 實施例1鈉離子通道基因的克隆及回收純化
[0043] 一、桔小實蠅總RNA的提取及全長cDNA的獲得
[0044] 采用總RNA提取試劑盒提取由西南大學(xué)植物保護學(xué)院提供的桔小實蠅蟲源的總 RNA，具體步驟參見總RNA提取試劑盒使用說明。提取的總RNA電泳圖如圖1所示。
[0045] 將提取得到的總 RNA 利用 PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn) 錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體步驟參見反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明。
[0046] 二、鈉離子通道基因目的片段的克隆及回收純化
[0047] (1)在NCBI網(wǎng)站上搜索桔小實蠅鈉離子通道基因全長序列，比對保守序列，根據(jù) 桔小實蠅JN416983 (登錄號）序列的保守序列設(shè)計目的片段正向和反向特異性引物，引物 C1和R1擴增鈉離子通道基因正向目的片段，引物C2和R2擴增反向目的片段，引物名稱和 序列及對應(yīng)的酶切位點如表1所示：
[0048] 表1桔小實蠅鈉離子通道基因擴增引物
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 桔小實蠅鈉離子通道基因的RNA干擾載體，包括骨架載體和正、反義鏈，其特征在 于：以桔小實蠅鈉離子通道基因部分片段為正或反義鏈，所述鈉離子通道基因部分片段序 列如SEQ ID NO. 1，所述骨架載體為PFGC5941載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桔小實蠅鈉離子通道基因的RNA干擾載體，其特征在于：所 述正義鏈插入在酶切位點Xhol和Ncol之間，反義鏈插入在酶切位點Xball和BamHI之間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的桔小實蠅鈉離子通道基因的RNA干擾載體的構(gòu)建方法，包括 如下步驟： 1) 鈉離子通道基因目的片段與質(zhì)粒的連接 提取桔小實蠅總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3為 引物對鈉離子通道基因的正向目的片段進行PCR擴增，以SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5為引 物對鈉離子通道基因的反向目的片段進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，目的片段約為550bp， 回收PCR產(chǎn)物，與載體pMD-19連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到重組質(zhì)粒PMD-19-C1R1和 PMD-19-C2R2,進行序列驗證，測序正確的目的片段即可用于RNA干擾載體的構(gòu)建；所述SEQ ID NO. 2?5的序列如下： SEQ IDN0. 2 :5' -GCCATGGCAGATGGTGATTTGCCTCGT-3' ； SEQ ID NO. 3 :5' -CCATGGATATCGCCATGTATAGTGAA-3' ； SEQ ID NO. 4 :5' -GCTCTAGAGCCAGATGGTGATTTGCCTCGT-3' ； SEQ IDNO. 5 :5' -CGGGATCCATATCGCCATGTATAGTGAA-3' ； 2) 鈉離子通道基因的RNA干擾載體的構(gòu)建 將上述測序正確的鈉離子通道基因正向目的片段質(zhì)粒PMD-19-C1R1與載體PFGC5941 分別用Xhol和Ncol雙酶切，將pMD-19-ClRl與載體PFGC5941的酶切產(chǎn)物進行連接得到插 入正向目的片段的重組質(zhì)粒PFGC5941-C1R1 ;將PFGC5941-C1R1和鈉離子通道基因反向目 的片段質(zhì)粒PMD-19-C2R2分別用Xball和BamHI雙酶切，將酶切產(chǎn)物進行連接，即可得到插 入正、反義鏈的RNA干擾載體PFGC5941-C1R1/C2R2,經(jīng)PCR擴增檢測、核苷酸序列分析，目的 片段序列正確的干擾載體可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
4. 權(quán)利要求1-2任一所述的桔小實蠅鈉離子通道基因的RNA干擾載體在轉(zhuǎn)基因植物中 的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因植物為柑橘屬植物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，為將權(quán)利要求1-2任一所述的桔小實蠅鈉離子通道基 因的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化有關(guān)受體植物，使之對桔小實蠅產(chǎn)生抗性，所述受體植物為柑桔。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)化的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌菌株EHA105。
【文檔編號】A01H5/00GK104059938SQ201410315849
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】冉春, 岳建蘇, 劉浩強, 叢林, 李鴻筠 申請人:西南大學(xué)柑桔研究所