利用水楊酸誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用水楊酸誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛多糖的方法，采用如下步驟：(1)鐵皮石斛種子播撒于1/2MS培養(yǎng)基表面，在溫度23～25℃，光照強(qiáng)度1500～1700lx，光暗比為10h/14h條件下進(jìn)行培養(yǎng)，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗；(2)用0.1％的無水乙醇溶液溶解水楊酸，配制成濃度為5mmol/L的水楊酸母液。將水楊酸母液添加到1/2MS培養(yǎng)基中至水楊酸終濃度為98～102μmol/L；然后將石斛組培苗轉(zhuǎn)苗到上述添加了水楊酸的1/2MS培養(yǎng)基，在26～28℃、相對濕度66～68％、光強(qiáng)1800～2000lx、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)29～31天。本發(fā)明在組織培養(yǎng)中通過施加少量的水楊酸，即可大幅提高了鐵皮石斛中石斛多糖的積累效率，投資少，效果顯著，方便易行。
【專利說明】利用水楊酸誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種利用水楊酸誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛多糖的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]石斛多糖具有多種藥理功效，主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降血糖和抗白內(nèi)障等方面。但由于鐵皮石斛在自然條件下繁殖率低、生長緩慢、且被過度采挖利用。此外，由于生態(tài)環(huán)境的破壞，導(dǎo)致野生資源瀕臨滅絕。這都限制了石斛多糖生產(chǎn)和進(jìn)一步開發(fā)利用。石斛組織培養(yǎng)物在多糖含量、多糖的單糖化學(xué)組成及作用等方面與天然野生品存在著極大的相似性，以組織培養(yǎng)物替代原藥材或者生產(chǎn)有效成分成為解決石斛資源短缺的方法之一，但依然無法解決石斛多糖藥源緊缺的問題。
[0003]目前，國內(nèi)市場上已經(jīng)有一些提高鐵皮石斛多糖產(chǎn)量的相關(guān)技術(shù)，如浙江農(nóng)林大學(xué)的“一種提高鐵皮石斛多糖含量的栽培方法”(CN201210096652.0)，在紅光或紅光和藍(lán)光的混光條件下栽培鐵皮石斛，來提高鐵皮石斛的多糖含量。浙江農(nóng)林大學(xué)的“一種提高鐵皮石斛多糖的方法”(CN201110044537.4)，通過改善栽培條件以及聲波刺激以達(dá)到提高鐵皮石斛多糖的目的。關(guān)于鐵皮石斛積累多糖的誘導(dǎo)因子，上述相關(guān)技術(shù)都集中在物理因子調(diào)節(jié)方面，并且需要光、聲發(fā)生器等設(shè)施，技術(shù)工藝比較復(fù)雜，這無疑增加了生產(chǎn)成本和技術(shù)推廣的難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種能夠克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，技術(shù)工藝簡單易行、廉價高效且能顯著提高鐵皮石斛生產(chǎn)石斛多糖效率的利用水楊酸誘導(dǎo)鐵皮石斛快速生產(chǎn)石斛多糖的方法。其具體的技術(shù)方案為:
[0005]利用水楊酸誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛多糖的方法，其特征在于采用如下步驟:
[0006](I)制備鐵皮石斛組培苗:鐵皮石斛種子播撒于1/2MS培養(yǎng)基表面，在溫度23~25°C，光照強(qiáng)度1500~17001x，光暗比為10h/14h條件下培養(yǎng)至苗高3~4cm，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗；
[0007](2)誘導(dǎo)鐵皮石斛的多糖積累:用0.1 %的無水乙醇溶液溶解水楊酸，配制成濃度為5mmol/L的水楊酸母液,將水楊酸母液添加到1/2MS培養(yǎng)基中至水楊酸終濃度為98~102ymol/L ;然后將石斛組培苗轉(zhuǎn)苗到上述添加了水楊酸母液的1/2MS培養(yǎng)基，在26~28°C、相對濕度66~68%、光強(qiáng)1800~20001x、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)29~31天。
[0008]所述利用水楊酸誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛多糖的方法，其特征在于:步驟(1)中，鐵皮石斛采用浙江雁蕩山鐵皮石斛，采用添加30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基，石斛種子采用浙江雁蕩山鐵皮石斛種子。
[0009]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是:在組織培養(yǎng)中施加了少量的水楊酸，大幅提高了鐵皮石斛中石斛多糖的積累效率，具有投資少、效果顯著、方便易行的特點(diǎn)，對于降低石斛多糖的生產(chǎn)成本、滿足石斛多糖的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1:
[0011]步驟1、制備鐵皮石斛組培苗:選用采用浙江雁蕩山鐵皮石斛種子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基表面，在溫度23°C，光照強(qiáng)度15001x，光暗比為10h/14h條件下讓種胚分化成芽。日光燈下培養(yǎng)至鐵皮石斛無菌苗高度約3~4cm，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的鐵皮石斛無菌苗。
[0012]步驟2、誘導(dǎo)鐵皮石斛積累石斛多糖:水楊酸采用美國西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司生產(chǎn)的水楊酸。先用0.1 %的無水乙醇溶液溶解水楊酸,配制成濃度為5mmol/L的水楊酸母液,將水楊酸母液添加到含30g/L鹿糖的1/2MS培養(yǎng)基中，至水楊酸終濃度為98 μ mol/L，然后將石斛組培苗轉(zhuǎn)苗到上述添加了水楊酸母液的1/2MS培養(yǎng)基，與空白對照組同時在26 °C、相對濕度66 %、光強(qiáng)18001X、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)31天。
[0013]實(shí)施例2:
[0014]步驟1、制備鐵皮石斛組培苗:選用采用浙江雁蕩山鐵皮石斛種子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基表面，在溫度24°C，光照強(qiáng)度16001x，光暗比為10h/14h條件下讓種胚分化成芽。日光燈下培養(yǎng)至鐵皮石斛無菌苗高度約3~4cm，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的鐵皮石斛無菌苗。
[0015]步驟2、誘導(dǎo)鐵皮石斛積累石斛多糖:水楊酸采用美國西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司生產(chǎn)的水楊酸。先用0.1 %的無水乙醇溶液溶解水楊酸,配制成濃度為5mmol/L的水楊酸母液,將水楊酸母液添加到含30g/L鹿糖的1/2MS培養(yǎng)基中，至水楊酸終濃度為100 μ mol/L，然后將石斛組培苗轉(zhuǎn)苗到上述添加了水楊酸母液的1/2MS培養(yǎng)基，與空白對照組同時在27°C、相對濕度67%、光強(qiáng)19001x、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)30天。
[0016]實(shí)施例3:
[0017]步驟1、制備鐵皮石斛組培苗:選用采用浙江雁蕩山鐵皮石斛種子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基表面，在溫度25°C，光照強(qiáng)度17001x，光暗比為10h/14h條件下讓種胚分化成芽。日光燈下培養(yǎng)至鐵皮石斛無菌苗高度約3~4cm，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的鐵皮石斛無菌苗。
[0018]步驟2、誘導(dǎo)鐵皮石斛積累石斛多糖:水楊酸采用美國西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司生產(chǎn)的水楊酸。先用0.1 %的無水乙醇溶液溶解水楊酸,配制成濃度為10mmol/L的水楊酸母液，將水楊酸母液添加到含30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基中，至水楊酸終濃度為102 μ mol/L，然后將石斛組培苗轉(zhuǎn)苗到上述添加了水楊酸母液的1/2MS培養(yǎng)基，與空白對照組同時在28°C、相對濕度68%、光強(qiáng)20001x、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)29天。
[0019]采用以下方法對本發(fā)明中水楊酸誘導(dǎo)的鐵皮石斛組培苗及空白對照組定期進(jìn)行觀察和檢測，具體是每天取少量鐵皮石斛樣品按以下步驟對本發(fā)明水楊酸誘導(dǎo)的鐵皮石斛及空白對照組中的石斛多糖含量進(jìn)行提取測定:①精確稱取5g鐵皮石斛苗，80°C殺青30分鐘，60°C下烘干至恒重。磨成石斛粉(40目)，加入石油醚(按固液比1: 10)，回流比，重復(fù)3次，脫脂后的石斛粉溶于50°C溫水，加0.5%已活化的纖維素酶液(pH值為5)，恒溫酶解1.5h 升溫至90°C滅活纖維素酶，迅速冷卻并過濾；濾渣加入90%酒精浸提lh，過濾所得濾渣加入水溶解，磁力攪拌器攪拌，常溫下浸提兩次，每次lh，過濾。加入無水乙醇，使體系乙醇濃度達(dá)到80% (體積比)。在冰箱中靜置5天，過濾，濾渣經(jīng)真空干燥得石斛多糖稱取在105°C下干燥至恒重的葡萄糖0.010g，配制成濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至不同濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程；④準(zhǔn)確吸取樣品測定液2mL,置于IOmL試管中,加入苯酹溶液ImL,潤旋混勻,冰浴5min,加5mL濃硫酸,混勻,沸水浴15min。取出試管，流水冷卻至室溫，在490nm波長下測定其吸光值；⑤記錄測得的吸光值，通過線性方程計算樣品葡萄糖濃度，按公式計算石斛多糖含量(％) =LXDXfXV/W計算出多糖含量，其中L (mg/ml)表示樣品液中葡萄糖的濃度，D表示樣品液的稀釋因素，f表示換算因素，V(ml)表示供試液的體積，W(mg)表示石斛重量。
[0020]結(jié)果表明:本發(fā)明中用水楊酸處理的鐵皮石斛苗中所檢測的石斛多糖含量相比于對照組顯著提高，處理后鐵皮石斛苗石斛多糖的平均含量達(dá)到32.69~36.28%，是對照的
1.71 ~1.9 倍。
【權(quán)利要求】
1.一種利用水楊酸誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛多糖的方法，其特征在于采用如下步驟: (1)制備鐵皮石斛組培苗:鐵皮石斛種子播撒于1/2MS培養(yǎng)基表面，在溫度23~25°C，光照強(qiáng)度1500~17001x，光暗比為10h/14h條件下進(jìn)行培養(yǎng)，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗； (2)誘導(dǎo)鐵皮石斛的多糖積累:用0.1 %的無水乙醇溶液溶解水楊酸，配制成濃度為5mmol/L的水楊酸母液,將水楊酸母液添加到1/2MS培養(yǎng)基中至水楊酸終濃度為98~102ymol/L ;然后將石斛組培苗轉(zhuǎn)苗到上述添加了水楊酸母液的1/2MS培養(yǎng)基，在26~28°C、相對濕度66~68%、光強(qiáng)1800~20001x、光暗比為12h/12h條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)29~31天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用水楊酸誘導(dǎo)鐵皮石斛生產(chǎn)石斛多糖的方法，其特征在于:步驟(1)中，采用添加30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基，石斛種子采用浙江雁蕩山鐵皮石斛種子。
【文檔編號】A01H4/00GK104012414SQ201410276836
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】張建勇, 袁佐清, 劉濤, 叢高遠(yuǎn) 申請人:山東理工大學(xué)