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甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因序列的制作方法

文檔序號(hào):248813閱讀:384來(lái)源:國(guó)知局
甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BNGI基因序列;所述序列編碼SEQ?ID?NO.2所述的氨基酸序列。利用本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因,利用轉(zhuǎn)基因、基因干擾以及基因敲除等技術(shù)分析其對(duì)甘藍(lán)型油菜開(kāi)花早晚的影響。也可研究BnGI基因在響應(yīng)生物節(jié)律鐘信號(hào)上的作用機(jī)制,結(jié)合育種技術(shù)獲得適宜的早晚熟材料,為甘藍(lán)型油菜的生產(chǎn)提供理論和實(shí)踐的指導(dǎo)。
【專利說(shuō)明】甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】的基因序列,具體涉及一種甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因序列。
【背景技術(shù)】
[0002]植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)渡到生殖生長(zhǎng)所經(jīng)歷的生理變化是內(nèi)源和外源信號(hào)響應(yīng)的的結(jié)果,這些信號(hào)作用導(dǎo)致植物的開(kāi)花。開(kāi)花是植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)折點(diǎn),開(kāi)花時(shí)間與作物收獲時(shí)間、產(chǎn)量及種植適應(yīng)性有重要的關(guān)聯(lián)。調(diào)控植物開(kāi)花的基因研究從不同調(diào)控途徑展開(kāi)以模式植物擬南芥為基礎(chǔ)進(jìn)行已經(jīng)取得了較多的成果。
[0003]GI (GIGANTEA)是重要的生物節(jié)律鐘輸出基因,在光周期和生物節(jié)律鐘調(diào)節(jié)開(kāi)花途徑中有著重要的作用。GI位于開(kāi)花促進(jìn)基因CO、FT的上游,受晝夜節(jié)律的調(diào)控,上調(diào)下游開(kāi)花促進(jìn)基因,在光周期介導(dǎo)開(kāi)花的過(guò)程中有一定的調(diào)節(jié)作用。首先在擬南芥中分離出GI基因,并證明其表達(dá)由生物節(jié)律鐘調(diào)控,目前,在大豆、菊花、大麥、朵蝶蘭等植物中GI基因已被克隆和報(bào)道。
[0004]甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L )是十分重要的油料作物,是國(guó)產(chǎn)食用植物油的第一大來(lái)源,在我國(guó)食用油市場(chǎng)中具有舉足輕重的地位。有關(guān)甘藍(lán)型油菜開(kāi)花相關(guān)基因的研究主要集中于FLC、FR 1、CO、FT等少數(shù)幾個(gè)基因上,而GI基因在甘藍(lán)型油菜中未見(jiàn)有克隆的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因序列。該基因cDNA全長(zhǎng)4153bp,編碼區(qū)全長(zhǎng)為3516bp,編碼1171個(gè)氨基酸。根據(jù)BnGI基因在甘藍(lán)型油菜不同組織中的表達(dá)量分析初步探索了該基因的表達(dá)模式,為進(jìn)一步研究該基因在調(diào)控開(kāi)花中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]第一方面,本發(fā)明涉及一種甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因序列,該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]優(yōu)選地,所述基因序列如SEQ ID N0.1第I~3516位所示。
[0009]第二方面,本發(fā)明涉及一種前述BnGI基因序列的克隆方法,所述方法包括如下步驟:
[0010]I)甘藍(lán)型油菜組織總RNA的提??;
[0011]2)以白菜GI基因gi登錄號(hào)328684600作為種子序列,本地檢索甘藍(lán)型油菜EST數(shù)據(jù)包,利用電子克隆的技術(shù),將檢索到的目標(biāo)EST拼接組裝成甘藍(lán)型油菜的BnGI基因;根據(jù)該BnGI基因,設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增出全長(zhǎng)的基因特異引物:
[0012]如SEQ ID N0.4 所示的 GI_F,
[0013]如SEQ ID N0.5 所示的 GI_R ;[0014]3)以甘藍(lán)型油菜組織RNA反轉(zhuǎn)錄得到的甘藍(lán)型油菜cDNA為模板,利用所述基因特異引物GI_F、GI_R克隆出BnGI基因的全長(zhǎng)cDNA序列。
[0015]第三方面,本發(fā)明涉及一種前述甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因序列在制備甘藍(lán)型油菜品種中的用途,所述用途為采用基因工程手段或者基因干擾方法,調(diào)控所述基因序列的表達(dá)水平,進(jìn)而引起甘藍(lán)型油菜開(kāi)花調(diào)控機(jī)制的變化,獲得開(kāi)花時(shí)間不同的甘藍(lán)型油菜品種。
[0016]本發(fā)明根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),運(yùn)用生物信息學(xué)手段,通過(guò)同源序列比對(duì)設(shè)計(jì)出基因特異引物,用分子克隆的方法,克隆出甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因;經(jīng)過(guò)序列分析,確定是甘藍(lán)型油菜BnGI基因;組織表達(dá)分析表明,BnGI在不同組織中均有表達(dá),但表達(dá)量具有組織差異性。
[0017]本發(fā)明具有的有益效果為:在BnGI基因的研究上,還可以繼續(xù)利用相關(guān)序列信息擴(kuò)增出BnGI基因的全長(zhǎng)DNA序列,利用轉(zhuǎn)基因、基因干擾以及基因敲除等技術(shù)分析其對(duì)油菜開(kāi)花早晚的影響。也可以研究BnGI基因在響應(yīng)生物節(jié)律鐘信號(hào)上的作用機(jī)制,同時(shí)結(jié)合育種技術(shù)獲得適宜的早晚熟材料,為甘藍(lán)型油菜的生產(chǎn)提供理論和實(shí)踐的指導(dǎo)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述,本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯:
[0019]圖1為本發(fā)明BnGI基因cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增的凝膠電泳圖;其中,a為BnGI基因的克隆,b為PCR鑒定大腸桿菌DH5 α轉(zhuǎn)化子;圖中BnGI =BNGI基因cDNA全長(zhǎng);1_4 =BnGI基因cDNA 全長(zhǎng) DH5 α 轉(zhuǎn)化子的 PCR 產(chǎn)物;M:DL5000Maker ;
[0020]圖2為本發(fā)明BnGI基因在甘藍(lán)型油菜植株不同組織中表達(dá)量示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明,但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是,對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022]下列實(shí)施例涉及的UNIQ-10總RNA抽提試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒Taq DNA聚合酶等通過(guò)公開(kāi)市售的商業(yè)渠道獲得,購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司,地址:上海市松江區(qū)香閔路698號(hào)。實(shí)驗(yàn)所用的反轉(zhuǎn)錄PrimeScript RT-PCRKit、高保真的 PrimeSTARi Max DNA 聚合酶、pMD19_T Vector CloningKit、SYBR8 Premix Ex Taq?熒光半定量試劑盒等購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司,公司地址:遼寧省大連市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)東北二街19號(hào)。
[0023]下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如Sambrook等(1989)編著的分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0024]實(shí)施例1、甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因的克隆和表達(dá)特性分析
[0025] 1、甘藍(lán)型油菜實(shí)驗(yàn)材料取材[0026]本實(shí)驗(yàn)所用甘藍(lán)型油菜為利用上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院自選早熟、園葉的自交系‘10-4544’母本與復(fù)交組合[(中雙2號(hào)X滬油15)X(滬油15X花葉)]中選育的自交系的父本材料雜交后F1進(jìn)行小孢子培養(yǎng)所得DH系材料。
[0027]2、提取甘藍(lán)型油菜組織總RNA
[0028]取甘藍(lán)型油菜各組織樣品用于RNA提取,按照UNIQ-10總RNA抽提試劑盒要求,具體操作步驟如下:
[0029](1)各取甘藍(lán)型油菜組織材料0.2-0.4g左右,利用液氮將材料速凍然后快速碾磨至粉狀;
[0030](2)將上述研磨樣品轉(zhuǎn)移到一個(gè)沒(méi)有RNA酶的2ml EP管中,用移液槍吸取450 μ IRLT溶液溶解粉狀試驗(yàn)材料,使用渦旋混合器將溶液與粉狀物在外力幫助下混合均勻,放入離心機(jī)12000轉(zhuǎn),5min,然后將不含沉淀的液體轉(zhuǎn)入沒(méi)有使用過(guò)的不含RNA酶的
1.5ml EP 管中;
[0031](3)向轉(zhuǎn)出的不含沉淀的液體中中加入其I / 2體積的無(wú)水乙醇并上下翻轉(zhuǎn)使其混合均勻,放置Imin ;
[0032](4)將試劑盒中吸附柱放入對(duì)應(yīng)編號(hào)的的回收管中,用移液槍吸取上一步驟中混勻溶液懸空注入組裝后的收集管,放置3min后使其充分反應(yīng)后放入離心機(jī),8000轉(zhuǎn),Imin后取出收集管,將吸附柱下面的液體棄掉;
[0033](5)向上一步驟中的收集管中加入500μ I RW溶液,放置幾十秒后放入離心機(jī)10000轉(zhuǎn),Imin后取出收集管,吸附柱下面的液體仍棄掉;
[0034](6)再向上述處理后的收集管中加入500 μ I RPE溶液,放置2min,再次放入離心機(jī)10000轉(zhuǎn),Imin后取出收集管;
[0035](7)重復(fù)上述處理;
[0036](8)取出收集管后,將兩次處理離心后產(chǎn)生的廢液棄掉,將沒(méi)有液體的吸附柱和收集管組裝后再次放入離心機(jī),10000轉(zhuǎn),2min后拿出收集管,用移液槍將管壁上殘余的液體吸干;
[0037](9)將吸附柱放入處理過(guò)不含RNA酶的1.5ml EP管中,吸取40 μ I DEPC處理過(guò)的無(wú)菌水,緩慢加至吸附柱膜中間位置,放置5min,在離心機(jī)中12000轉(zhuǎn)離心。兩分鐘后拿出EP管,在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的樣品RNA的質(zhì)量后保存于_20°C或超低溫冰箱保存以備后用。
[0038]3、甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因的克隆
[0039]以擬南芥GIGANTEA基因?yàn)榉N子序列,在NCBI檢索非冗余蛋白庫(kù),將檢索到的在種間關(guān)系上更接近甘藍(lán)型油菜的白菜GI基因gi登錄號(hào)328684600作為種子序列,本地檢索甘藍(lán)型油菜EST數(shù)據(jù)包。利用電子克隆的技術(shù),將檢索到的目標(biāo)EST進(jìn)行拼接組裝成甘藍(lán)型油菜的BnGI基因。通過(guò)對(duì)電子克隆的BnGI基因的ORF進(jìn)行分析,設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增出全長(zhǎng)的基因特異引物(表1)。將甘藍(lán)型油菜組織RNA利用PrimeScript RT-PCRKit試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到甘藍(lán)型油菜cDNA,以此為模板,以GI_F / R為引物,采用PrimeSTARs MaxDNA高保真酶反應(yīng)體系,進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)為:94°C預(yù)變性4min ;98°C變性10s,55°C退火15s,72°C延伸4min共35個(gè)循環(huán);72°C延伸20min ;4°C結(jié)束反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)如圖1a可知經(jīng)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增所得產(chǎn)物片段大小約為4000bp左右,與電子克隆技術(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果相同,即所得為BnGI基因目的片段。
[0040]將符合目的片段大小的PCR產(chǎn)物純化后克隆至pMD-19T vector (Takara),導(dǎo)入大腸桿菌菌株,經(jīng)d互補(bǔ)和M13通用引物進(jìn)行檢測(cè),利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌液PCR產(chǎn)物,如圖1b中所示片段大小正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送Life technology公司測(cè)序。通過(guò)結(jié)合電子克隆技術(shù)的同源克隆方法得到甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因cDNA全長(zhǎng)序列,編碼區(qū)長(zhǎng)度為3516bp,推導(dǎo)編碼1171個(gè)氨基酸,cDNA編碼區(qū)序列和推導(dǎo)蛋白序列見(jiàn)SEQID.N0.1 幣口 SEQ ID.N0.2。
[0041]表1本發(fā)明基因克隆所用引物
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因序列,其特征在于,該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的BnGI基因序列,其特征在于,所述基因序列如SEQID N0.1第I~3516位所示。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的BnGI基因序列的克隆方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟: 1)甘藍(lán)型油菜組織總RNA的提取; 2)以白菜GI基因gi登錄號(hào)328684600作為種子序列,本地檢索甘藍(lán)型油菜EST數(shù)據(jù)包,利用電子克隆的技術(shù),將檢索到的目標(biāo)EST拼接組裝成甘藍(lán)型油菜的BnGI基因;根據(jù)該BnGI基因,設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增出全長(zhǎng)的基因特異引物:
如 SEQ ID N0.4 所示的 GI_F,
如 SEQ ID N0.5 所示的 GI_R ; 3)以甘藍(lán)型油菜組織RNA反轉(zhuǎn)錄得到的甘藍(lán)型油菜cDNA為模板,利用所述基因特異引物GI_F、GI_R克隆出BnGI基因的全長(zhǎng)cDNA序列。
4.一種如權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)型油菜控制開(kāi)花相關(guān)的BnGI基因序列在制備甘藍(lán)型油菜品種中的用途,其特征在于,所述用途為采用基因工程手段或者基因干擾方法,調(diào)控所述基因序列的表達(dá)水平,進(jìn)而引起甘藍(lán)型油菜開(kāi)花調(diào)控機(jī)制的變化,獲得開(kāi)花時(shí)間不同的甘藍(lán)型油菜品種。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103923929SQ201410100829
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】劉楊, 周曉晨, 韓洪強(qiáng), 劉暢, 趙越 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)
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