一種綿毛蘑菇菌株及制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及綿毛蘑菇菌株的篩選及制備方法，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的菌株AgaricusvaporariusKXJ（蘑-8）已于2013年10月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNO.8119。利用該菌株制備的液體及固體優(yōu)良菌種，應(yīng)用于綿毛蘑菇的促繁有著顯著的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種綿毛蘑菇菌株及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及綿毛蘑菇菌株KXJ(蘑-8)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]綿毛蘑燕Cfearicw1S raporariiAs入屬于傘菌目、蘑燕科、蘑燕屬，主要分布于新疆、內(nèi)蒙古等地，夏末至秋季在闊葉或混交林地上大量群生，綿毛蘑菇營(yíng)養(yǎng)豐富，富含人體必需氨基酸、礦物質(zhì)、維生素和多糖等營(yíng)養(yǎng)成分，是一種高蛋白、低脂肪的營(yíng)養(yǎng)保健食品
在綿毛蘑菇栽培技術(shù)中，優(yōu)良菌種的獲得是關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，綿毛蘑菇菌株的獲得通常是利用子實(shí)體或孢子進(jìn)行分離、純化，直接應(yīng)用于綿毛蘑菇的栽培或菌絲體生產(chǎn)，現(xiàn)有技術(shù)的不足在于其生物學(xué) 特性目前仍處于試驗(yàn)研究階段，生物轉(zhuǎn)化率較低，而且還要用熟料栽培，生產(chǎn)工藝及技術(shù)要素要求較高，因而制約了綿毛蘑菇商品經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，另外只能根據(jù)菌絲形態(tài)及分離物來(lái)初步確定是否為綿毛蘑菇純培養(yǎng)物；生產(chǎn)的菌種一般用固體菌種，目前在國(guó)內(nèi)采用液體菌種進(jìn)行綿毛蘑菇資源的保護(hù)應(yīng)用不廣泛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的主要目的就是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，利用新疆原產(chǎn)地綿毛蘑菇子實(shí)體篩選出優(yōu)良菌株，采用生物技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定，制備綿毛蘑菇液體及固體優(yōu)良菌種，為綿毛蘑菇資源保護(hù)提供優(yōu)良菌種
本發(fā)明采用的真菌是綿毛蘑vaporarius KXJ (蘑-8);保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址:中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)；保藏日期:2013年8月26日；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCC N0.8119
綿毛蘑菇的子實(shí)體由菌蓋、菌褶、菌柄三部分組成，單生、散生或簇生，其子實(shí)體中型至大型。菌蓋直徑疒20cm，新鮮時(shí)污白色、蛋殼黃色，初期半球形，后漸平展，邊緣內(nèi)卷；菌肉肥厚，白色至淺紅褐色，如遇鐵器傷害迅速變?yōu)榧t色；菌褶離生，致密而不等長(zhǎng)，初淺粉色后變黑褐色至黑色；菌柄長(zhǎng)3~10cm，粗3-5cm，上部柱形、基部近梭形，菌柄顏色近蓋色，菌柄上部表面布有銀灰色光澤的纖維質(zhì)，雙層菌幕，外菌幕在菌柄基部形成托狀；孢子印褐紅色至咖啡色；擔(dān)子四孢子梗，具棒狀囊體；孢子棕色，內(nèi)含油滴，短橢圓形，
4.988~7.254 X 5.429~8.426 μ m
本發(fā)明的技術(shù)方案:
①采集野生綿毛蘑菇子實(shí)體；
②組織分離或孢子分離；
③純化菌株及菌株鑒定；
④生物學(xué)特性比較及生產(chǎn)性狀比較；
⑤確定優(yōu)良菌株；
⑥菌種生產(chǎn)及菌種應(yīng)用；
經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選，獲得菌絲體產(chǎn)量高、抗污染的綿毛蘑菇液體菌種專(zhuān)用菌株KXJ (蘑-8)本發(fā)明真菌vaporarius KXJ (蘑_8)培養(yǎng)方法(以下為重量百分比):
菌種分離純化培養(yǎng)基:2%綿毛蘑菇下腳料、0.001%VB1、2%葡萄糖、2%瓊脂；
綿毛蘑菇菌株分離及鑒定方法:
1、將綿毛蘑菇子實(shí)體組織塊或孢子液接種到上述試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于18_24°C下培養(yǎng)5-10天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無(wú)污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得綿毛蘑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得綿毛蘑菇純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定，通過(guò)Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的綿毛蘑燕(Agaricusvaporarius) Identities=539/544 (99%), Gaps=4/544 (1%),分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為綿毛蘑菇菌絲體
本發(fā)明綿毛蘑菇菌種的制備方法分為:液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種
液體菌種制備方法:
液體培養(yǎng)基配方為:糊精3%、酵母粉0.2%、MgS047H20 0.5%, KH2PO4 0.25%，余下為水，pH
自然
1、將綿毛蘑菇的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160r/min，培養(yǎng)時(shí)間5_7天
3、將搖瓶菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線(xiàn)的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0.8ν/(ν.π?η);攪拌轉(zhuǎn)速為120-160r/min ;接種量為5-10% ;罐壓:0.04Mpa ； pH為6.0 ;溫度為20-26°C ;通氣培養(yǎng)72-96小時(shí)，獲得綿毛蘑菇液體菌種
固體菌種制備方法:
固體培養(yǎng)基配方為:棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸鈣1%、ρΗ自然
1、將綿毛蘑菇的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間5_7天
2、采用前述固體培養(yǎng)基配方。將培養(yǎng)料混合后，加水拌均勻后，裝入750ml的大口瓶中，壓緊封口后在120°C滅菌60分鐘，接入液體菌種，于20-26°C培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)
【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例一:
1、將綿毛蘑菇子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于18°C下培養(yǎng)10天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無(wú)污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得綿毛蘑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18°C下培養(yǎng)7天，獲得綿毛蘑菇純化試管種3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定，通過(guò)Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的綿毛蘑燕(Agaricusvaporarius) Identities=539/544 (99%), Gaps=4/544 (1%),分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為綿毛蘑菇菌絲體
4、將vaporariusKXJ (蘑_8)的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，18°C下培養(yǎng)7天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為糊精3%、酵母粉0.2%、MgS047H20 0.5%，KH2PO4 0.25%，余下為水，pH自然。于20°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120rpm，培養(yǎng)時(shí)間7天，獲得一級(jí)液體菌種
將一級(jí)液體菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線(xiàn)的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0.8v/(v *min)；攪拌轉(zhuǎn)速為120r/min ;接種量為5% ;罐壓:0.04Mpa ； pH為6.0 ;溫度為20°C ;通氣培養(yǎng)96小時(shí)，獲得綿毛蘑菇液體菌種
實(shí)施例二:
菌種制備的步驟與實(shí)施例一相同 1、將綿毛蘑菇子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于20°C下培養(yǎng)6天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無(wú)污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得綿毛蘑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于20°C下培養(yǎng)6天，獲得綿毛蘑菇純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定，通過(guò)Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的綿毛蘑燕(Agaricusvaporarius) Identities=539/544 (99%), Gaps=4/544 (1%),分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為綿毛蘑菇菌絲體
4、將vaporariusKXJ (蘑_8)的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，20°C下培養(yǎng)6天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為糊精3%、酵母粉0.2%、MgS047H20 0.5%，KH2PO4 0.25%，余下為水，pH自然。于22°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，培養(yǎng)時(shí)間6天，獲得一級(jí)液體菌種
將一級(jí)液體菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線(xiàn)的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0.8v/(v *min)；攪拌轉(zhuǎn)速為140r/min ;接種量為8% ;罐壓:0.04Mpa ； pH為6.0 ;溫度為22°C ;通氣培養(yǎng)84小時(shí)，獲得綿毛蘑菇液體菌種
實(shí)施例三:
1、將綿毛蘑菇子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于22°C下培養(yǎng)5天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無(wú)污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得綿毛蘑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于22°C下培養(yǎng)5天，獲得綿毛蘑菇純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定，通過(guò)Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的綿毛蘑燕Agaricusvaporarius) Identities=539/544 (99%), Gaps=4/544 (1%),分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為綿毛蘑菇菌絲體
4、將vaporariusKXJ (蘑_8)的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，22°C下培養(yǎng)5天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為糊精3%、酵母粉0.2%、MgS047H20 0.5%，KH2PO4 0.25%，余下為水，pH自然。于24°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160rpm，培養(yǎng)時(shí)間5天，獲得一級(jí)液體菌種
將一級(jí)液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸|丐1%、PH自然。將各原料按比例稱(chēng)量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml, 120°C滅菌60分鐘后，接種后置于24°C培養(yǎng)15天，獲得綿毛蘑菇固體菌種
實(shí)施例四:
1、將綿毛蘑菇子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無(wú)污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得綿毛蘑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，獲得綿毛蘑菇純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定，通過(guò)Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的綿毛蘑燕(Agaricusvaporarius) Identities=539/544 (99%), Gaps=4/544 (1%),分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為綿毛蘑菇菌絲體
4、將vaporariusKXJ (蘑_8)的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，24°C下培養(yǎng)5天，獲得試管種
5、將試管種接種到 500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為糊精3%、酵母粉0.2%、MgS047H20 0.5%，KH2PO4 0.25%，余下為水，pH自然。于26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160rpm，培養(yǎng)時(shí)間5天，獲得一級(jí)液體菌種
將一級(jí)液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸|丐1%、PH自然。將各原料按比例稱(chēng)量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml, 120°C滅菌60分鐘后，接種后置于26°C培養(yǎng)20天，獲得綿毛蘑菇固體菌種。
【權(quán)利要求】
1.一種綿毛蘑燕菌株，其特征在于所述菌株為Cfearicw1S vaporarius) KXJ (蘑-8),該菌株的保藏號(hào)為CGMCCN0.8119。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綿毛蘑菇菌株的制備方法，所述菌株是經(jīng)過(guò)常規(guī)的液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的，其特征在于所述液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:(1)液體培養(yǎng)基配方為:糊精3%-5%、酵母粉 0.2%-0.4%、MgSO4.7Η20 0.5%，KH2PO4，0.25%，余下為水，pH自然； (2)固體培養(yǎng)基配 方為:棉籽殼75-87%、麩皮15-9%、石膏1%、腐殖土3%，含水量60%、pH自然。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103858668SQ201310620805
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】張微思, 羅孝坤, 郭永紅, 徐丕曦, 何容 申請(qǐng)人:昆明菌苑食品有限公司