膠膜菌菌株及其在促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種膠膜菌(Tulasnella)菌株（CGMCC?No.7552），其nrDNA?ITS序列提交美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，序列號(hào)為KC796463.1。膠膜菌(Tulasnella)菌株（CGMCC?No.7552）在促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)上的應(yīng)用，通過與原球莖形成共生關(guān)系，促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)并長成幼苗。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CGMCC?No.7552菌株不僅能顯著促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)(光照條件下97.92±0.51%；黑暗條件下89.34±5.89%)，且能顯著促進(jìn)原球莖的形成(光照條件下91.82±3.03%；黑暗條件下79.90±9.56%)以及顯著促進(jìn)原球莖后續(xù)發(fā)育成幼苗。
【專利說明】膠膜菌菌株及其在促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及一種能與5?唇石斛(Dendrobiumaphyllum)原球莖共生形成共生關(guān)系的真菌菌株膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7552)，及其在促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)上的應(yīng)用，具體來說涉及一種能與兜唇石斛原球莖形成共生關(guān)系并促進(jìn)其種子萌發(fā)并生長至幼苗階段的有效真菌。
【背景技術(shù)】
[0002]蘭科植物的種子非常細(xì)小，僅有發(fā)育不完全的胚，在自然條件下種子萌發(fā)需要依靠特定的共生真菌來獲取營養(yǎng)物質(zhì)。蘭科植物種子的萌發(fā)可以通過非共生萌發(fā)培養(yǎng)和共生萌發(fā)培養(yǎng)兩種方式。雖然大多數(shù)蘭科植物可通過非共生萌發(fā)培養(yǎng)，且具有較高的萌發(fā)率，但是此方式獲得的幼苗移植到自然界中，生長緩慢，抗病原微生物能力差，存活率較低，同時(shí)由于很難與后接觸的真菌建立共生關(guān)系而導(dǎo)致后繼生長嚴(yán)重受阻。共生萌發(fā)培養(yǎng)技術(shù)是指在特定的基質(zhì)(培養(yǎng)基)中同時(shí)播種植物種子和共生真菌，該方法可以提高種子的萌發(fā)率、幼苗的生長速度以及移植到自然環(huán)境后的幼苗存活率。由于蘭科植物種子與真菌的共生關(guān)系具有專一性，不同蘭科植物種子的共生真菌不同。確定能與兜唇石斛種子形成共生關(guān)系并促進(jìn)其萌發(fā)的有效真菌是培育兜唇石斛幼苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是開展兜唇石斛原生境回歸工作的基礎(chǔ)。通過種子和真菌的共生萌發(fā)獲得的幼苗在回歸到自然生境后具有較好的環(huán)境適應(yīng)性。因此獲得促進(jìn)種子萌發(fā)的有效共生真菌是進(jìn)行珍稀瀕危蘭科植物保護(hù)的第一步。利用種子遷地共生萌發(fā)技術(shù)誘導(dǎo)種子萌發(fā)成原球莖，分離原球莖中的共生真菌是獲取促進(jìn)種子萌發(fā)有效菌株最直接最高效的方法。將兜唇石斛種子和分離得到的真菌在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行共生萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，篩選能促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)有效的共生真菌，可為高效生產(chǎn)菌根化幼苗提供必要條件，為開展兜唇石斛的回歸奠定基礎(chǔ)。目前，現(xiàn)有技術(shù)中未見有膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7552)及其在促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)生長成幼苗方面的用途和方法的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種膠膜菌菌株，并提供該菌株在促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)生長成幼苗方面的用途和方法。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
[0005]一種膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7552)。
[0006]所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCCN0.7552)的 nrDNA ITS 序列提交美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),序列號(hào)為KC796463.1。
[0007]所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7552)的生物學(xué)特征為:在PDA平板上培養(yǎng)7天其菌落呈淺黃褐色，略顯放射狀，不規(guī)則圓形發(fā)散生長，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，中等稀疏；光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲具隔膜，粗3.5 - 5.0 μ m，多數(shù)4.0 μ m，分枝近直角，分枝處縊縮，距分枝不遠(yuǎn)處形成隔膜；老菌絲細(xì)胞壁有加厚現(xiàn)象；培養(yǎng)2周以上開始形成串珠狀的厚垣孢子，厚垣孢子數(shù)量不等。
[0008]所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7552)在促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)上的應(yīng)用。
[0009]如所述的應(yīng)用，膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7552)通過與原球莖形成共生關(guān)系，促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)并長成幼苗。
[0010]如所述的應(yīng)用，通過將兜唇石斛種子與不同種類的真菌共同培養(yǎng)于燕麥培養(yǎng)基，在人工培養(yǎng)箱內(nèi)25±2°c條件下分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養(yǎng)，使菌株與原球莖形成共生關(guān)系，從而促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)并長成幼苗。
[0011]所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7552)促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)的方法，膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7552)與原球莖形成共生關(guān)系，促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)并長成幼苗。
[0012]如所述的方法，通過兜唇石斛種子與不同種類的真菌共同培養(yǎng)于燕麥培養(yǎng)基，在人工培養(yǎng)箱內(nèi)25±2°C條件下分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養(yǎng)，使菌株與原球莖形成共生關(guān)系，從而促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)并長成幼苗。
[0013]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供的具體步驟如下:
[0014]1、本發(fā)明菌種于2013年04月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保存編號(hào):CGMCC N0.7552。本發(fā)明菌株的nrDNA ITS序列已提交美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)，其Genbank號(hào)為:KC796463.1。
[0015]2、本發(fā)明編號(hào)為CGMCC N0.7552的膠膜菌株在PDA平板上培養(yǎng)7天其菌落呈淺黃褐色，略顯放射狀，不規(guī)則圓形發(fā)散生長，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，中等稀疏。光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲具隔膜，粗3.5 - 5.0 μ m，多數(shù)4.0 μ m，分枝近直角，分枝處縊縮，距分枝不遠(yuǎn)處形成隔膜；老菌絲細(xì)胞壁有加厚現(xiàn)象；培養(yǎng)2周以上開始形成串珠狀的厚垣孢子，厚垣孢子數(shù)量不等。
[0016]3、所獲得的對兜唇石斛種子萌發(fā)有效共生真菌ITS片段序列在美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行BLAST比對分析,其與⑶166410.1Tulasnellacalospora相似性最高達(dá)99%。根據(jù)菌落、顯微形態(tài)特征及分子生物學(xué)手段將本發(fā)明所涉及真菌鑒定為膠膜菌屬真菌。
[0017] 4、兜唇石斛種子與膠膜菌菌株共生萌發(fā)實(shí)驗(yàn)
[0018]利用種子與真菌在培養(yǎng)基內(nèi)的共生萌發(fā)實(shí)驗(yàn)來檢測分離到的真菌是否對種子萌發(fā)階段有促進(jìn)效果以及對比不同真菌對種子萌發(fā)階段促進(jìn)效果的差異。
[0019]4.1將保存于4°C試管斜面內(nèi)的供試菌株取出，重新接種在PDA平板培養(yǎng)基上，置于人工氣候箱內(nèi)25±2°C培養(yǎng)，進(jìn)行活化。待真菌菌絲快長滿培養(yǎng)皿時(shí)(約7天)取出作為共生萌發(fā)材料。
[0020]4.2配制共生萌發(fā)培養(yǎng)基:所用培養(yǎng)基為燕麥瓊脂培養(yǎng)基(0MA，4g.L-1瓊燕麥粉+8g.L-1瓊脂，pH=5.6-5.8)。將配好的培養(yǎng)基倒在旋口瓶中，旋緊瓶蓋，滅菌(121。。，20min)后備用。 [0021]4.3種子滅菌:實(shí)驗(yàn)前將儲(chǔ)存在_20°C中的種子取出，放在室溫下10個(gè)小時(shí)，使種子溫度恢復(fù)至室溫。將少量種子放在紙質(zhì)的種子包內(nèi)，用訂書釘將紙袋封好。將裝有種子的紙袋浸泡在蒸餾水中5 - 10分鐘，輕輕的擠壓出氣泡。用鑷子將紙袋轉(zhuǎn)移到盛有次氯酸鈉溶液(有效氯離子濃度為1%)及含一滴洗滌劑的燒杯中，輕輕攪拌或搖動(dòng)燒杯。10分鐘后，將紙袋移至超凈工作臺(tái)，用無菌鑷子將紙袋轉(zhuǎn)移到盛有無菌蒸餾水的燒杯中，輕輕搖動(dòng)。重復(fù)沖洗種子3 - 4次。輕輕擠壓出紙袋內(nèi)多余的水，用無菌剪刀剪開紙袋。
[0022]4.4播種與培養(yǎng):據(jù)Dixon (1987)所用的方法稍作修改。將無菌種子與Ig *L_1無菌瓊脂溶液制作成無菌種子懸浮液。在OMA培養(yǎng)基表面平行放置兩片半徑為6cm的半圓形無菌尼龍布(孔徑為45 μ m)，用移液槍吸取150 μ I種子懸浮液均勻播種在每片尼龍布上。在培養(yǎng)基中間接種約0.5cm3 (I X 1X0.5cm)含有單一真菌純培養(yǎng)物的瓊脂塊，用封口膜將培養(yǎng)皿密封好。共分三組:一組接種從兜唇石斛原球莖中分離得到的編號(hào)為CGMCC N0.7552的菌株；另外2組設(shè)置為對照，其中一組接種從硬葉蘭(Cymbidium manni)原球莖內(nèi)分離到的膠膜菌屬(Tulasnella)真菌(編號(hào)為Fcb4);另一組為空白對照組(CK)不接菌。每組重復(fù)14個(gè)培養(yǎng)皿,在人工培養(yǎng)箱內(nèi)25±2°C下恒溫培養(yǎng),每組各7個(gè)培養(yǎng)皿分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養(yǎng)。
[0023]4.5檢測:播種后每周檢測種子萌發(fā)情況，記錄種子萌發(fā)及形成原球莖的時(shí)間。培養(yǎng)數(shù)周后，當(dāng)培養(yǎng)皿中產(chǎn)生大量處于發(fā)育初期階段的幼苗時(shí)將全部培養(yǎng)皿取出，在立體顯微鏡下觀察記錄種子萌發(fā)及原球莖發(fā)育情況。在SteWart&Zettler(2002)對種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育情況的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)之上稍作調(diào)整，對黑暗和光照條件下種子萌發(fā)情況進(jìn)行分級(jí)統(tǒng)計(jì)，篩選能有效促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)并能生長至幼苗階段的共生真菌。
[0024]上述步驟中，步驟I按照菌種保藏單位的要求提供三支試管斜面培養(yǎng)的菌種材料入庫獲取入冊登記編號(hào)；同時(shí)將測序所得的ITS堿基序列上傳至Genbank提供的軟件并提交獲取Genbank號(hào)。
[0025]步驟2所述觀察菌株顯微形態(tài)特征使用插片培養(yǎng)法，霉菌培養(yǎng)箱在25±2°C條件下培養(yǎng)7至10天，取插片按常規(guī)制片方法制片。根據(jù)觀察需要選擇不同生長時(shí)期的菌絲進(jìn)行觀察測量如:位于插片底部的菌絲體生長時(shí)間較長可見串珠狀厚垣孢子，輔助顯微鏡測微標(biāo)尺可對菌絲的粗細(xì)進(jìn)行測量。
[0026]步驟3所述的分子鑒定中，采用CTAB法提取真菌DNA，PCR擴(kuò)增所用引物為ITSl和 ITS4 ;PCR 反應(yīng)體系(25 μ I)包括:2.5 μ 110 XPCR 緩沖液，0.4 μ I dNTP, 1.5 μ I Mg2+，
1.5μ I ITS1,1.5μ I ITS4,0.2μ I Taq 酶，15.4μ I ddH20, 2 μ I DNA 模板。擴(kuò)增反應(yīng)在 PCR儀Perkin Elmer上進(jìn)行,如下PCR循環(huán):94°C預(yù)變性3min,循環(huán)I次；94°C變性Imin, 5TC退火lmin，72°C延伸lmin，30次循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。對所測序列提交美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，初步確認(rèn)其分類下地位。
[0027]步驟(4.4)所述的150微升的懸浮液約含150粒兜唇石斛種子，所述的培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為2000 - 3000Lx，溫度25±2°C，光周期12h/12h L/D。
[0028]步驟(4.5)所述的培養(yǎng)數(shù)周要根據(jù)種子萌發(fā)情況確定，本項(xiàng)發(fā)明中選擇8至10周，因種子大部分已萌發(fā)且有些已達(dá)到幼苗階段；所述的種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育情況參照Stewart&Zettler(2002)的方法對種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育情況進(jìn)行分級(jí)，分為5個(gè)階段:階段O描述為種胚透明，種皮完好，種子未萌發(fā)；階段I描述為種胚吸水膨脹；階段2描述為種胚繼續(xù)膨大，突破種皮，視為萌發(fā)；階段3描述為出現(xiàn)原生分生組織，即發(fā)育成原球莖；階段4描述為長出第一片葉片；階段5描述為第一片葉片繼續(xù)生長，變長。
[0029]參考文獻(xiàn)為:DixonK.1987.Modern orchid growing for pleasure andprofit, orchid club of south Australia:1nc., Adelaide.；
[0030]Stewart SLjZettler LW.2002.Symbiotic germination of three sem1-aquaticrein orchids (Habenaria repens, H-quinquiseta，H-macroceratitis)from Florida.Aquatic Botany72:25-35.。
[0031]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下顯著優(yōu)益性:
[0032]蘭科植物種子的萌發(fā)可以通過非共生萌發(fā)培養(yǎng)和共生萌發(fā)培養(yǎng)兩種方式。雖然大多數(shù)蘭科植物可通過非共生萌發(fā)培養(yǎng)，且具有較高的萌發(fā)率，但是此方式獲得的幼苗移植到自然界中，生長緩慢，抗病原微生物能力差，存活率較低，同時(shí)由于很難與后接觸的真菌建立共生關(guān)系而導(dǎo)致后繼生長嚴(yán)重受阻。共生萌發(fā)培養(yǎng)技術(shù)是指在特定的基質(zhì)(培養(yǎng)基)中同時(shí)播種植物種子和共生真菌，該方法可以提高種子的萌發(fā)率、幼苗的生長速度以及移植到自然環(huán)境后的幼苗存活率。由于蘭科植物種子與真菌的共生關(guān)系具有專一性，不同蘭科植物種子的共生真菌不同。確定能與兜唇石斛種子形成共生關(guān)系并促進(jìn)其萌發(fā)的有效真菌是培育兜唇石斛幼苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是開展兜唇石斛原生境回歸工作的基礎(chǔ)。本發(fā)明的菌株通過共生萌發(fā)實(shí)驗(yàn)將兜唇石斛種子和不同的真菌及對照分別在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過種子萌發(fā)率的比較成功的獲得促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)的有效菌株，從而為利用兜唇石斛種子和真菌共生萌發(fā)來高效培育種苗開辟了一條新的途徑。
[0033]本發(fā)明從原地共生萌發(fā)產(chǎn)生的原球莖中分離到的CGMCC N0.7552菌株，即將兜唇石斛的種子放入特制的種子袋中，將種子袋放置在有兜唇石斛植株生長的原生地，誘導(dǎo)種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖，將獲得的原球莖表面滅菌后在無菌條件下用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)原球莖中的內(nèi)生真菌生長，待長出菌絲時(shí)，進(jìn)行真菌的純化，獲得純菌落，并進(jìn)行真菌的分子鑒定和保存。此菌株不僅能顯著促進(jìn)兜唇石 斛種子萌發(fā)(光照條件下97.92±0.51%;黑暗條件下89.34±5.89%)，且能顯著促進(jìn)原球莖的形成(光照條件下91.82±3.03% ;黑暗條件下79.90±9.56%)以及顯著促進(jìn)原球莖后續(xù)發(fā)育成幼苗。說明只有接種菌株CGMCCN0.7552在光照條件下才能有效促進(jìn)兜唇石斛種子生長發(fā)育到幼苗階段。
【具體實(shí)施方式】
[0034]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下通過實(shí)施例及試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0035]實(shí)施例1:
[0036]利用種子與真菌在培養(yǎng)基內(nèi)的共生萌發(fā)實(shí)驗(yàn)來檢測分離到的真菌是否對種子萌發(fā)階段有促進(jìn)效果以及對比不同真菌對種子萌發(fā)階段促進(jìn)效果的差異:
[0037]1、首先獲取膠膜菌菌株(保存編號(hào)=CGMCC N0.7552):
[0038]將兜唇石斛的種子放入種子袋中，將種子袋放置在有兜唇石斛植株生長的原生地，誘導(dǎo)種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖，將獲得的原球莖表面滅菌后在無菌條件下用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)原球莖中的內(nèi)生真菌生長，待長出菌絲時(shí)，進(jìn)行真菌的純化，獲得純菌落。
[0039]通過將5?唇石斛種子與不同種類的真菌共同培養(yǎng)于燕麥培養(yǎng)基,在人工培養(yǎng)箱內(nèi)25±2°C條件下分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養(yǎng)，結(jié)果顯示此菌株能與原球莖形成共生關(guān)系并顯著促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)并長成幼苗；同時(shí)通過菌落特征、顯微形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)手段確定此真菌的分類學(xué)地位并保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0040]真菌分類學(xué)地位的確定:
[0041]形態(tài)特征觀察:上述編號(hào)為CGMCC N0.7552的膠膜菌株在PDA平板上培養(yǎng)7天其菌落呈淺黃褐色，略顯放射狀，不規(guī)則圓形發(fā)散生長，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，中等稀疏。光學(xué)顯微鏡特征:菌絲具隔膜，粗3.5 - 5.0 μ m，多數(shù)4.0 μ m,分枝近直角，分枝處縊縮，距分枝不遠(yuǎn)處形成隔膜；老菌絲細(xì)胞壁有加厚現(xiàn)象；培養(yǎng)2周以上開始形成串珠狀的厚垣孢子，厚垣孢子數(shù)量不等。
[0042]分子生物學(xué)鑒定:取出保存的真菌菌株，在超凈工作臺(tái)上用無菌接種針挑取菌絲接入滅菌后的液體馬鈴薯葡萄糖O3DB)培養(yǎng)基中。放入震蕩搖床內(nèi)25±2°C震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間視真菌的生長速度而定，一般為3 - 6天。抽濾約IOOmg的菌絲體，采用常規(guī)CTAB法提取DNA，選擇ISl和IS4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。對檢測含有目標(biāo)片段的樣品進(jìn)行測序。將得到的ITS片段序列提交美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),并進(jìn)行BLAST對比分析，獲取GenBank號(hào)為:KC796463.1。所得到的IS序列與登錄號(hào)為⑶166410.1的真菌(Tulasnellacalospora)最為相似,最大相似度達(dá)到99%,結(jié)合形態(tài)學(xué)分類特征將該菌株鑒定為膠膜菌屬真菌。該菌種已采用試管斜面法于2013年04月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保存編號(hào)=CGMCC N0.7552，保存期限:30年。同時(shí)本 申請人:在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將菌株接種于若干支試管斜面，于25±2°C霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)14d后置于4°C冰箱保藏備用。
[0043]2、共生萌發(fā)培養(yǎng)基
[0044]所用培養(yǎng)基為燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OMA，4g -1燕麥粉+8g -1瓊脂，PH=5.6 - 5.8)。將配好的培養(yǎng)基倒在旋口瓶中，旋緊瓶蓋，滅菌(121°C，20min)后備用。
[0045]3、供試菌株重培養(yǎng)
[0046]將步驟1存于4°C試管斜面內(nèi)的供試菌株取出，重新接種在PDA培養(yǎng)基上，置于人工氣候箱內(nèi)25±2°C培養(yǎng)，進(jìn)行活化。待真菌菌絲快長滿培養(yǎng)皿時(shí)取出作為共生萌發(fā)材料。
[0047]4、種子滅菌
[0048]實(shí)驗(yàn)前將儲(chǔ)存在_20°C中的種子取出，放在室溫下10個(gè)小時(shí)，使種子溫度恢復(fù)至室溫。將少量種子放在紙質(zhì)的種子包內(nèi)，用訂書釘將紙袋封好。將裝有種子的紙袋浸泡在蒸餾水中5 - 10分鐘，輕輕的擠壓出氣泡。用鑷子將紙袋轉(zhuǎn)移到盛有次氯酸鈉溶液(有效氯離子濃度為1%)及一滴洗滌劑的燒杯中，輕輕攪拌或搖動(dòng)燒杯。10分鐘后，將紙袋移至超凈工作臺(tái)，用無菌鑷子將紙袋轉(zhuǎn)移到盛有無菌蒸餾水的燒杯中，輕輕搖動(dòng)。重復(fù)沖洗種子3 - 4次。輕輕擠壓出紙袋內(nèi)多余的水，用無菌剪刀剪開紙袋獲得滅菌種子。
[0049]5、播種與培養(yǎng)[0050]在Dixon (1987)所用的方法上稍作修改。將無菌種子與1g.L-1無菌瓊脂溶液制作成無菌種子懸浮液。在OMA培養(yǎng)基表面平行放置兩片半徑為6 cm的半圓形無菌尼龍布(孔徑為45 μ m)，用移液槍吸取150 μ l種子懸浮液(約含150粒種子)均勻播種在每片尼龍布上。在培養(yǎng)基中間接種約0.5cm3(lXlX0.5cm)含有單一真菌純培養(yǎng)物的瓊脂塊，用封口膜將培養(yǎng)皿密封好。一組接種從兜唇石斛原球莖內(nèi)分離到的編號(hào)為CGMCC N0.7552的菌株，一組接種從硬葉蘭原球莖中分離得到的編號(hào)為Fcb4的菌株(Tulasnella sp.)，對照組(CK)為不接菌。每組重復(fù)14個(gè)培養(yǎng)皿，在人工培養(yǎng)箱內(nèi)25±2°C下恒溫培養(yǎng)，每組各7個(gè)培養(yǎng)皿分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養(yǎng)。用封口膜密封后置于人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為2000 - 3000Lx，溫度 25±2°C，光周期 12h/12h L/D。
[0051]6、檢測
[0052]播種后每周檢測種子萌發(fā)情況，記錄種子萌發(fā)及形成原球莖的時(shí)間。培養(yǎng)數(shù)周后當(dāng)有培養(yǎng)皿中產(chǎn)生大量處于發(fā)育初期階段的幼苗時(shí)將全部培養(yǎng)皿取出，在顯微鏡下觀察記錄種子萌發(fā)及原球莖發(fā)育情況。在SteWart&Zettler(2002)對種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育情況的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)之上稍作調(diào)整，對種子萌發(fā)情況進(jìn)行分級(jí)，統(tǒng)計(jì)各處理下的種子萌發(fā)率(G)、形成原球莖比率(C)以及處于各萌發(fā)階段的種子、原球莖或幼苗的比率(K)。G=mean (g/t) 土SE, C=mean (c/1) 土SE,K=mean(k/t) 土SE。其中，g 為每種處理下的各培養(yǎng)皿中萌發(fā)的種子數(shù)；c為每種處理下的各培養(yǎng)皿中形成原球莖的種子數(shù)(階段2、3、4之和)，k為每種處理下的各培養(yǎng)皿中處于各萌發(fā)階段的種子、原球莖或幼苗的數(shù)量；t為各培養(yǎng)皿中播種的種子數(shù)；SE為標(biāo)準(zhǔn)誤。
[0053] 在R 軟件(version2.14.2)中利用非參數(shù)檢驗(yàn)方法 Kruskal-Wallis test (Kff)和Mann-Whitney U-test (U)對不同處理的種子萌發(fā)率、形成原球莖比率及各階段種子數(shù)比率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，α=0.05。
[0054]結(jié)果表明不接菌對照組光照和黑暗培養(yǎng)條件下都沒有種子萌發(fā)，種子只吸水膨脹達(dá)到階段I沒有形成原球莖；而從原地共生萌發(fā)產(chǎn)生的原球莖中分離到的CGMCCN0.7552菌株不僅能顯著促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)(光照條件下97.92±0.51% ;黑暗條件下89.34±5.89%)，且能顯著促進(jìn)原球莖的形成(光照條件下91.82±3.03% ;黑暗條件下79.90 ±9.56%)以及顯著促進(jìn)原球莖后續(xù)發(fā)育成幼苗。雖然FCb4菌株在有光照條件下能顯著促進(jìn)種子萌發(fā)形成原球莖(43.79±20.45%)，但形成原球莖后表現(xiàn)出生長停滯，無法繼續(xù)生長發(fā)育成幼苗。說明只有接種菌株CGMCC N0.7552在光照條件下才能有效促進(jìn)兜唇石斛種子生長發(fā)育到幼苗階段。
【權(quán)利要求】
1.一種膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7552)。
2.如權(quán)利要求1所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCCN0.7552)，其特征在于所述菌株(CGMCC N0.7552)的nrDNA ITS序列提交美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),序列號(hào)為 KC796463.1。
3.如權(quán)利要求1所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCCN0.7552)，其特征在于所述菌株(CGMCC N0.7552)的生物學(xué)特征為:在PDA平板上培養(yǎng)7天其菌落呈淺黃褐色，略顯放射狀，不規(guī)則圓形發(fā)散生長，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，中等稀疏；光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲具隔膜，粗3.5 - 5.0 μ m，多數(shù)4.0 μ m,分枝近直角，分枝處縊縮，距分枝不遠(yuǎn)處形成隔膜；老菌絲細(xì)胞壁有加厚現(xiàn)象；培養(yǎng)2周以上開始形成串珠狀的厚垣孢子，厚垣孢子數(shù)量不等。
4.權(quán)利要求1所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCCN0.7552)在促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)上的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCCN0.7552)通過與原球莖形成共生關(guān)系，促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)并長成幼苗。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于通過兜唇石斛種子與不同種類的真菌共同培養(yǎng)于燕麥培養(yǎng)基，在人工培養(yǎng)箱內(nèi)25 ±2°C條件下分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養(yǎng)，使菌株與原球莖形成共生關(guān)系，從而促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)并長成幼苗。
7.權(quán)利要求1所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCCN0.7552)促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)的方法，其特征在于膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7552)與原球莖形成共生關(guān)系，促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)并長成幼苗。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于通過兜唇石斛種子與不同種類的真菌共同培養(yǎng)于燕麥培養(yǎng)基，在人工培養(yǎng)箱.內(nèi)25 ±2°C條件下分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養(yǎng)，使菌株與原球莖形成共生關(guān)系，從而促進(jìn)兜唇石斛種子萌發(fā)并長成幼苗。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103468588SQ201310424790
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】高江云, 邵士成, 盛春玲 申請人:中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園