一種調(diào)控鐵皮石斛懸浮細(xì)胞多糖含量增加的方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種調(diào)控鐵皮石斛懸浮細(xì)胞多糖含量增加的方法，包括無菌外植體的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)、稀土調(diào)控鐵皮石斛試管苗多糖的含量等步驟，本發(fā)明方法所制備的鐵皮石斛懸浮細(xì)胞生長好，代謝物質(zhì)多糖的含量高。本發(fā)明方法利用稀土對鐵皮石斛懸浮細(xì)胞進(jìn)行有目的的調(diào)控，可以在短期內(nèi)獲得大量多糖含量高的鐵皮石斛細(xì)胞，獲得大量的制藥原料，并能有效降低生產(chǎn)成本，益于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種調(diào)控鐵皮石斛懸浮細(xì)胞多糖含量增加的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及稀土調(diào)控鐵皮石斛懸浮細(xì)胞多糖含量增加的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵皮石斛officinale Kimura et Migo是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，主要分布于西南和江南各省，為我國傳統(tǒng)常用中藥，石斛的藥用部分是莖，具有益胃生津、滋陰清熱的功效。由于種子極小、無胚乳，自然繁殖率低，很難用實(shí)生苗栽培；而傳統(tǒng)的分株、扦插等方式的繁殖率亦極低，近些年來，人為的過度采挖和破壞其適生環(huán)境，其資源已瀕臨滅絕，是資源最為缺乏的一種，在1989年被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的藥用植物之一。鐵皮石斛主要有效成分為石斛類多糖及生物堿，另外還有酚類、菲類、芪類、倍半萜類及香豆素等，其主要藥效·成分為多糖，且含量較高，現(xiàn)代藥理研究報(bào)導(dǎo)石斛多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、降低血糖等作用。
[0003]鑭是17種稀土元素中最重要和最活潑的元素，適當(dāng)濃度La3+對幼苗的生長起積極作用，研究表明La3+與Ca2+的半徑相似，化學(xué)性質(zhì)上可能存在著競爭作用。La3+和Ca2+的作用相似，能夠取代Ca2+在細(xì)胞膜上的位置，并在一定的條件下產(chǎn)生與Ca2+相似的作用?？梢蕴岣叩鞍酌?、淀粉酶和脂肪酶的活性，可以作為植物光合作用的催化劑，促進(jìn)植株的生長，提高幼苗干重。近年來的研究發(fā)現(xiàn)稀土亦具有抗寒、抗旱等抗脅迫的能力，試驗(yàn)證明稀土元素能促進(jìn)植物細(xì)胞培養(yǎng)中次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累，鑭、鈰對東北紅豆杉懸浮細(xì)胞中紫杉醇合成與釋放具有一定作用，稀土離子可以通過不同方式與酶結(jié)合，從而影響酶的活性。稀土元素能提高植物細(xì)胞中次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量可能與它們影響多種酶的活性有關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供鐵皮石斛懸浮培養(yǎng)的快速繁殖方法，并通過稀土對其進(jìn)行調(diào)控獲得生長良好，多糖含量高的細(xì)胞，進(jìn)行工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)，可以規(guī)?；臑樗帍S提供鐵皮石斛多糖的來源。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案:
野外生長的鐵皮石斛葉片，在MS培養(yǎng)基上，附加激素NAA lmg/L, IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)30天，繼代4-5次，繼代周期20天，取繼代后的嫩綠松散的愈傷組織，加入ffhite+TDZlmg/1+IAA0.5mg/l，進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，繼代3次后，在培養(yǎng)基中加入2mg/l稀土，進(jìn)行細(xì)胞多糖含量的調(diào)控，取樣后采用水提法提取鐵皮石斛多糖含量，提取時(shí)間為7.5 h，料液比為1:20，pH為8.5，使用樹脂吸附法對多糖進(jìn)行純化。D3tllR樹脂對鐵皮石斛多糖吸附量大，氯化鈉洗脫效果最好，使用苯酚-硫酸法對純化后的多糖進(jìn)行檢測，多糖得率28%。
[0006]所述培養(yǎng)基消毒方式為在121°C下滅菌20min。
[0007]所述外植體的消毒方法為取鐵皮石斛葉片，洗衣粉浸泡4分鐘，流水沖洗50分鐘，經(jīng)次氯酸鈉消毒處理12分鐘，無菌水沖洗5遍。[0008]所述的稀土優(yōu)選是硝酸鑭稀土。
[0009]所述多糖提取方法采用水提法提取，精密度RSD%為3.12%，重現(xiàn)性RSD%值為1.83%,穩(wěn)定性RSD%值為3.8%。
[0010]所述多糖測定方法為苯酚-硫酸法對鐵皮石斛多糖進(jìn)行檢測，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入1.5mL5%的苯酚溶液，硫酸5mL，顯色溫度80°C，在水浴中加熱30min，在波長488nm下測定鐵皮石斛多糖的量，此種方法快速、顯色穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、適用于鐵皮石斛多糖含量的測定。
[0011]所述純化方法采用D3tllR樹脂對多糖進(jìn)行純化，吸附液25°C，濃度5mg.mL-l,pH為7.0，吸附流度為1.8mL.min — 1時(shí)吸附較強(qiáng)。
[0012]采用本發(fā)明制備的鐵皮石斛懸浮細(xì)胞，增值速度快，多糖含量高，利于大生產(chǎn)操作，能耗小，污染小。
[0013]下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于下列實(shí)施方式。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1
野外生長的鐵皮石斛葉片，在MS培養(yǎng)基上，附加激素NAA lmg/L, IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)30天，繼代4-5次，繼代周期20天，取繼代后的嫩綠松散的愈傷組織，加入White+TDZ0.5mg/l+IAA0.3mg/l，進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)3次后，在培養(yǎng)基中加入lmg/1稀土，進(jìn)行細(xì)胞多糖含量的調(diào)控，取樣后采用水提法提取鐵皮石斛多糖含量，提取時(shí)間為7.5 h，料液比為1:20，pH為8.5，使用樹脂吸附法對多糖進(jìn)行純化，D301R樹脂對鐵皮石斛多糖吸附量大，氯化鈉洗脫效果最好，使用苯酚-硫酸法對純化后的多糖進(jìn)行檢測，多糖得率21.23%。
[0015]實(shí)施例2
野外生長的鐵皮石斛葉片，在MS培養(yǎng)基上，附加激素NAA lmg/L, IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)30天，繼代4-5次，繼代周期20天，取繼代后的嫩綠松散的愈傷組織，加入White+TDZ0.5mg/l+IAA0.5mg/l，進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)3次后，在培養(yǎng)基中加入lmg/1稀土，進(jìn)行細(xì)胞多糖含量的調(diào)控，取樣后采用水提法提取鐵皮石斛多糖含量，提取時(shí)間為7.5 h，料液比為1:20，pH為8.5，使用樹脂吸附法對多糖進(jìn)行純化，D301R樹脂對鐵皮石斛多糖吸附量大，氯化鈉洗脫效果最好，使用苯酚-硫酸法對純化后的多糖進(jìn)行檢測，多糖得率22.56%。
[0016]實(shí)施例3
野外生長的鐵皮石斛葉片，在MS培養(yǎng)基上，附加激素NAA lmg/L, IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)30天，繼代4-5次，繼代周期20天，取繼代后的嫩綠松散的愈傷組織，加入ffhite+TDZlmg/1+IAA0.3mg/l，進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)3次后，在培養(yǎng)基中加入lmg/1稀土，進(jìn)行細(xì)胞多糖含量的調(diào)控，取樣后采用水提法提取鐵皮石斛多糖含量，提取時(shí)間為7.5 h，料液比為1:20，pH為8.5，使用樹脂吸附法對多糖進(jìn)行純化，D301R樹脂對鐵皮石斛多糖吸附量大，氯化鈉洗脫效果最好，使用苯酚-硫酸法對純化后的多糖進(jìn)行檢測，多糖得率23.14%。[0017]實(shí)施例4
野外生長的鐵皮石斛葉片，在MS培養(yǎng)基上，附加激素NAA lmg/L, IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)30天，繼代4-5次，繼代周期20天，取繼代后的嫩綠松散的愈傷組織，加入ffhite+TDZlmg/1+IAA0.5mg/l，進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)3次后，在培養(yǎng)基中加入lmg/1稀土，進(jìn)行細(xì)胞多糖含量的調(diào)控，取樣后采用水提法提取鐵皮石斛多糖含量，提取時(shí)間為7.5 h，料液比為1:20，pH為8.5，使用樹脂吸附法對多糖進(jìn)行純化，D301R樹脂對鐵皮石斛多糖吸附量大，氯化鈉洗脫效果最好，使用苯酚·-硫酸法對純化后的多糖進(jìn)行檢測，多糖得率23.95%。
[0018]實(shí)施例5
野外生長的鐵皮石斛葉片，在MS培養(yǎng)基上，附加激素NAA lmg/L, IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)30天，繼代4-5次，繼代周期20天，取繼代后的嫩綠松散的愈傷組織，加入ffhite+TDZlmg/1+IAA0.3mg/l，進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)3次后，在培養(yǎng)基中加入lmg/1稀·土，進(jìn)行細(xì)胞多糖含量的調(diào)控，取樣后采用水提法提取鐵皮石斛多糖含量，提取時(shí)間為7.5 h，料液比為1:20，pH為8.5，使用樹脂吸附法對多糖進(jìn)行純化，D301R樹脂對鐵皮石斛多糖吸附量大，氯化鈉洗脫效果最好，使用苯酚-硫酸法對純化后的多糖進(jìn)行檢測，多糖得率25.79%。
[0019]實(shí)施例6
野外生長的鐵皮石斛葉片，在MS培養(yǎng)基上，附加激素NAA lmg/L, IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)30天，繼代4-5次，繼代周期20天，取繼代后的嫩綠松散的愈傷組織，加入White+TDZl.5mg/l+IAAl.0mg/1，進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)3次后，在培養(yǎng)基中加入lmg/1稀土，進(jìn)行細(xì)胞多糖含量的調(diào)控，取樣后采用水提法提取鐵皮石斛多糖含量，提取時(shí)間為7.5 h，料液比為1:20，pH為8.5，使用樹脂吸附法對多糖進(jìn)行純化，D301R樹脂對鐵皮石斛多糖吸附量大，氯化鈉洗脫效果最好，使用苯酚-硫酸法對純化后的多糖進(jìn)行檢測，多糖得率27.61%。
[0020]實(shí)施例7
野外生長的鐵皮石斛葉片，在MS培養(yǎng)基上，附加激素NAA lmg/L, IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)30天，繼代4-5次，繼代周期20天，取繼代后的嫩綠松散的愈傷組織，加入White+TDZl.5mg/l+IAAl.0mg/1，進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)3次后，在培養(yǎng)基中加入3mg/l稀土，進(jìn)行細(xì)胞多糖含量的調(diào)控，取樣后采用水提法提取鐵皮石斛多糖含量，提取時(shí)間為7.5 h，料液比為1:20，pH為8.5，使用樹脂吸附法對多糖進(jìn)行純化，D301R樹脂對鐵皮石斛多糖吸附量大，氯化鈉洗脫效果最好，使用苯酚-硫酸法對純化后的多糖進(jìn)行檢測，多糖得率27.52%。
【權(quán)利要求】
1.一種調(diào)控鐵皮石斛懸浮細(xì)胞多糖含量增加的方法，其特征在于所述的方法由下列步驟組成:野外生長的鐵皮石斛葉片，在MS培養(yǎng)基上，附加激素NAA lmg/L, IBA 2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)30天，繼代4-5次，繼代周期20天，取繼代后的嫩綠松散的愈傷組織，加入White液體培養(yǎng)基中，附加激素TDZ0.1-0.5mg/l+IAA0.3-1.0mg/1,進(jìn)行鐵皮石斛懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)30天后，在培養(yǎng)基中加入l_3mg/l稀土，進(jìn)行懸浮細(xì)胞和多糖含量的調(diào)控，取樣后采用水提法提取鐵皮石斛多糖含量，提取時(shí)間為7.5 h，料液比為1:20，pH為8.5，使用樹脂吸附法對多糖進(jìn)行純化，D301R樹脂對鐵皮石斛多糖吸附量大，氯化鈉洗脫效果最好，使用苯酚-硫酸法對純化后的多糖進(jìn)行檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:所述無菌的石斛外植體葉片和芽按照下述方法得到:取野生鐵皮石斛葉片和芽，洗衣粉浸泡3分鐘，流水沖洗1-2小時(shí)，經(jīng)酒精消毒處理30s，氯化汞消毒處理8分鐘，無菌水沖洗5遍，用吸水紙吸去無菌外植體表面的水分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:培養(yǎng)條件溫度25°C，濕度70%，光照2000-40001x，光期 14h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:鐵皮石斛懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)選擇的培養(yǎng)基為White培養(yǎng)基，附 加激素TDZ和IAA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:調(diào)控鐵皮石斛多糖的的稀土優(yōu)選為硝酸鑭。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:在培養(yǎng)基中加入的稀土為過濾滅菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:本發(fā)明采用水提法提取，精密度RSD%S3.12%，重現(xiàn)性RSD%值為1.83%，穩(wěn)定性RSD%值為3.8%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:本發(fā)明采用D3tllR樹脂對多糖進(jìn)行純化，吸附液25°C，濃度5mg ? mL — S pH為7.0，吸附流度為1.8mL ? min — 1時(shí)吸附較強(qiáng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:本發(fā)明采用氯化鈉進(jìn)行洗脫，最佳洗脫濃度 0.5mol ? L — 1，洗脫率達(dá) 89.72%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:本發(fā)明采用苯酚-硫酸法對鐵皮石斛多糖進(jìn)行檢測，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入1.5mL5%的苯酚溶液，硫酸5mL，顯色溫度80°C，在水浴中加熱30min，在波長488nm下測定鐵皮石斛多糖的含量，此種方法快速、顯色穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、適用于鐵皮石斛多糖含量的測定。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103430852SQ201310412811
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】蘇劉花 申請人:南京澤朗農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司