專利名稱：具有高抗性淀粉低直鏈淀粉的水稻種質(zhì)的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是通過常規(guī)育種、生物技術(shù)育種以及功能成分的生理鑒定等有機(jī)結(jié)合，培育一種融合高抗性淀粉的優(yōu)良食味品質(zhì)水稻的育種方法。
背景技術(shù)：
抗性淀粉(RS)又稱為抗酶性淀粉和抗消化淀粉。研究表明，在小腸內(nèi)，RS不能被消化吸收和提供葡萄糖，在大腸可被生理性細(xì)菌發(fā)酵，產(chǎn)生短鏈脂肪酸和氣體。RS在代謝特性上類似于膳食纖維，通過降低糖尿病患者飯后血糖值、控制體重、有效防止腸道疾病及降血脂等功效，從而降低一些慢性病(如糖尿病、大腸癌及肥胖等)的發(fā)病風(fēng)險，并對防便秘、盲腸炎和痔瘡也有重要的預(yù)防作用(Robertso DM, Bickerton AS, Louise DA, etal.The American Journal of Clinical Nutrition, 2005，82(3):559-567 ；Morita T,Hayashi J, MotoiH, et al.Journal of Food Science.2005, 70S:179-185 ;Le Leu RK,Hu Y, Young GP.Gastroenterology;Digestive Disease Week and the 102nd AnnualMeeting of the American Gastroenterological Association[C], 2001, 20(5): A667 ；Birkett AM, Mathers JC, Jones GP, et al Br J Nutr 2000,84:63-72)。RS研究開發(fā)最初是通過物理化學(xué)方法(壓熱、微波輻射、脫支等)從淀粉原料中制備RS產(chǎn)品(徐丹鴻，徐紅華.抗性淀 粉制備及其性質(zhì)研究.糧食與油脂，2005, 4:9-11)，但是這種加工方法，成本高，得到的RS產(chǎn)品價格昂貴。目前國外開展的RS產(chǎn)品研究，多是以玉米、小麥和土豆作為原料，而利用水稻作為RS產(chǎn)品原料的并不多，究其原因是由于水稻雖然含70%-80%的淀粉，在3大糧食作物中淀粉含量最高，但稻米中RS含量很低，熱米飯中RS含量一般低于1，冷米飯中RS含量也僅為1.0 2.1% (趙國華.抗性淀粉.糧食與油脂，1999，(2):3-6)，特別對于以優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)為育種目標(biāo)的主推良種，RS就更低。因此，篩選高RS水稻資源是豐富RS原料的有效途徑。目前有關(guān)水稻資源篩選RS的工作已經(jīng)開展，研究表明:高RS水稻資源多來自云南，但是高RS的特色資源多是直鏈淀粉含量也比較高的秈稻，直鏈淀粉含量高達(dá)20%以上，不僅口感差，表現(xiàn)為堊白率較高、食味品質(zhì)和蒸煮品質(zhì)欠佳等嚴(yán)重地影響大米的品質(zhì)的形狀，而且多是農(nóng)家種，產(chǎn)量潛力很低，多為畝產(chǎn)IOOkg/畝，(王艷平，李華勇，方先文，林靜，不同來源水稻種質(zhì)的直鏈淀粉含量多樣性分析，金陵科技學(xué)院學(xué)報，2010，26 (3):39-42)，而且由于RS含量測定的費(fèi)用較高，批量篩選RS的工作需要大量經(jīng)費(fèi)支持，這些已經(jīng)篩選出的高RS的農(nóng)家種或地方品種，與現(xiàn)代主產(chǎn)水稻品種中，平均畝產(chǎn)500kg的產(chǎn)量相t匕，尤其畝產(chǎn)800kg的超級稻品種，均相距甚遠(yuǎn)，直接利用現(xiàn)有高RS水稻資源的可能性很小，農(nóng)民種植這些特色資源興趣也不大，上述原因?qū)е履壳案逺S水稻產(chǎn)品供應(yīng)嚴(yán)重匱乏。因此，盡快培育出RS含量高且產(chǎn)量性狀優(yōu)質(zhì)的高產(chǎn)水稻材料，將是滿足功能水稻食品需求的重要手段之一(蘇寧，萬向元，翟虎渠，等.功能型水稻研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨向.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40 ( 3): 433-439)。近幾年來，國內(nèi)外水稻育種者嘗試通過化學(xué)誘變和輻射誘變等方法，創(chuàng)制富含RS的突變體，但目前并沒有報道出生產(chǎn)上可用的材料(郭書巧，唐海娟，王州飛.秈粳雜交Fl高效花藥培養(yǎng)技術(shù)體系的建立.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2006，29(2): 1-5:M.Hofer.1n vitro androgenedsis in appIe-1mprovement of the induction phase.Plant CellReports, 2004 (22):365-370),并對RS相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行了初步研究，看出了抗性淀粉與直鏈淀粉的相關(guān)性(牟方貴，聞宗武，冉瑞林，滕建勛，陳永波，楊朝柱，李明輝，吳殿星，水稻抗性淀粉相關(guān)SSR標(biāo)記的初步研究，分子植物育種，2008，6 (3):432— 438);美國路易斯安那州南部研究中心也發(fā)明了一種以大米為基質(zhì)的RS產(chǎn)品(Darbani B, Eimanifar A,Stewart C.et al.Methods to produce marker-free transgenic plants.BiotechnolJ，2007 (2):83-90),但轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品目前還存在基因安全性的公眾認(rèn)知度不高以及基因飄逸等潛在的問題，應(yīng)用起來還有相當(dāng)距離。因此，常規(guī)育種將是當(dāng)前高RS水稻種質(zhì)培育的安全和可行的方法之一。
通過雜交育種，可將高RS材料與優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的水稻材料聚合是水稻優(yōu)良性狀聚合的一種重要方法。研究表明高RS材料多為秈稻(王艷平，李華勇，方先文，林靜，不同來源水稻種質(zhì)的直鏈淀粉含量多樣性分析，金陵科技學(xué)院學(xué)報，2010，26 (3):39-42)，而優(yōu)良食味品質(zhì)的水稻多是來源于日本的粳稻，比如江蘇最好吃的大米粳稻南粳46 (嚴(yán)鳳根，丁瑞芬，余建明.粳稻新品種“南粳46”特征特性及蘇南地區(qū)高產(chǎn)栽培技術(shù).上海農(nóng)業(yè)技術(shù)，2011 (3): 36-37，39)，因此，對于聚合高RS和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)育種目標(biāo)，水稻育種工作者將面臨地理遠(yuǎn)源和秈粳雜交常遭遇的育性較低以及白化苗等世界性難題的困饒(Kumari M,Clarke H Jj Small I， Siddique KHM.Albinism in plants: a major bottleneck inwide hybridization, androgenesis and doubled haploid culture.Critical Reviewsin Plant Sciences，2009，28:393 - 409)，培育的難度非常大。特別是RS含量的篩選需要對精米進(jìn)行加熱熟化等破壞性處理才能進(jìn)行，這種破壞種子育性的鑒定方法，是在Fl代篩選出高RS的水稻材料，無法繼續(xù)選育，而導(dǎo)致常規(guī)選育工作中斷；而只能通過常規(guī)雜交高世代的分離群體以及回交育種方式選育，不僅大大地增加篩選的水稻材料的工作量，而且又大大增加了 RS含量測定的篩選成本，而經(jīng)過F2代，群體性狀嚴(yán)重分離，要想獲得穩(wěn)定的RS水稻種質(zhì)，必須再經(jīng)過多次回交等育種方法穩(wěn)定，這個過程通常需要8-10年，可見，只通過常規(guī)雜交育種方法培育高RS功能材料也有很大的局限，尤其是短期要獲得穩(wěn)定、高產(chǎn)和高RS等聚合這3個優(yōu)良性狀的水稻材料，幾乎是不可能實(shí)現(xiàn)的育種目標(biāo)。水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)是快速獲得穩(wěn)定遠(yuǎn)緣雜交Fl代的方法，它可以打破物種的界限進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，增加遺傳多樣性。利用花藥組織培養(yǎng)具有縮短育種年限優(yōu)勢，同時還可以快速獲得符合育種目標(biāo)的植株，提高育種效率。現(xiàn)階段，水稻花藥組織培養(yǎng)技術(shù)還是利用不同品種對外源激素的敏感性的不同而研制出一一對應(yīng)的花藥愈傷組織誘導(dǎo)的獨(dú)特培養(yǎng)基配方，同時不同基因型材料的花藥組織培養(yǎng)力差異巨大，愈傷組織的誘導(dǎo)率及分化率還普遍較低，特別是秈粳雜交子一代的花藥培育的再生植株中白化苗的比例也非常高(KumariM, Clarke H J, Small I,Siddique KHM.Albinism in plants: a major bottleneck inwide hybridization, androgenesis and doubled haploid culture.Critical Reviewsin Plant Sciences, 2009，28:393 - 409)，目前水稻花藥的平均再生率只有0.5% (郭書巧，唐海娟，王州飛.秈粳雜交Fl高效花藥培養(yǎng)技術(shù)體系的建立.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2006，29 (2): 1-5)。水稻花藥培養(yǎng)作為常規(guī)技術(shù) ，高效應(yīng)用到大規(guī)模水稻改良還需要技術(shù)的優(yōu)化和提高，目前應(yīng)用到高RS水稻資源的培育并未見報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于:針對了目前的高RS親本多為農(nóng)家種，且是產(chǎn)量低且口感差的秈稻，而口感好的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻多為粳稻。鑒于培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的高RS的水稻材料,將涉及地理遠(yuǎn)緣、秈粳雜交以及后代分離群體大等問題，而且秈粳雜交子一代水稻花藥再生技術(shù)仍對基因型的高度依賴(包括因花藥愈傷組織誘導(dǎo)率較低，分化率低以及白化苗較高等問題)，均對現(xiàn)有高RS水稻材料的改良不相適應(yīng)。本發(fā)明通過高RS親本材料與優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)親本材料的選擇，并對其秈粳稻子一代花藥培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化，尤其是通過激素和理化因子的調(diào)優(yōu)等，在2年內(nèi)提供一種適合秈粳雜交和花藥培養(yǎng)相結(jié)合的培育高RS高產(chǎn)新品種的水稻育種方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種具有高抗性淀粉低直鏈淀粉的水稻種質(zhì)的培育方法，其特征在于: a)以至少含有8%的RS的水稻材料為母本，與以直鏈淀粉含量不超過15%且單株產(chǎn)量不低于40g/株的，符合國標(biāo)二級優(yōu)質(zhì)稻谷標(biāo)準(zhǔn)的水稻材料為父本進(jìn)行雜交，獲得Fl雜種； b)將Fl雜種的單核靠邊期花穗，即取劍葉抽出0.5-1厘米的花穗，經(jīng)75%乙醇消毒后，裝入塑料袋內(nèi)，并經(jīng)2-5天4°C低溫預(yù)處理后，花藥接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行全暗培養(yǎng)，溫度為26±1°C，培養(yǎng)約14-21 d后，獲得愈傷組織； c)將花藥誘導(dǎo)出愈傷組織通過繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再通過分化培養(yǎng)基分化為植株，或直接將花藥誘導(dǎo)出的愈傷組織通過分化培養(yǎng)基分化為植株，得到穩(wěn)定的花培株系； d)花培株系的綠芽長出3葉后，轉(zhuǎn)接入幼苗壯根培養(yǎng)基中生長15d后，獲得根系發(fā)達(dá)的茁壯試管苗； e)試管苗經(jīng)7d溫室練苗，移栽至簡易大棚后，生長健壯的小苗15 d左右長出新的分蘗，用秋水仙素在莖節(jié)切口涂抹，進(jìn)行加倍處理，然后移至大田發(fā)育成熟，收獲二倍體植株結(jié)出飽滿的種子； f)將收獲的種子在田間種植，到收獲期，進(jìn)行產(chǎn)量性狀的考察，并對獲得水稻株系的精米進(jìn)行RS和直鏈淀粉含量的測定，篩選單株產(chǎn)量不低于40g/株，同時精米中RS大于5%、直鏈淀粉含量小于15.0%的穩(wěn)定水稻株系，作為高RS的水稻種質(zhì)； 所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:以N6大量元素、微量元素、有機(jī)成分和鐵鹽為基本組分，附加2,4-二氯苯氧乙酸1-1.5 mg/L +萘乙酸1.5-2.0 mg/L +激動素0.3 mg/L+脫落酸2 mg/L+脯氨酸100 mg/L+水解酪蛋白300 mg/L+白砂糖60g/L+瓊脂條8g/L ； 所述的繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)為以M8大量元素、微量元素、有機(jī)成分和鐵鹽為基本組分，白砂糖濃度為50g/L,瓊脂條8g/L,附加0.5-1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸,2-2.5 mg/L激動素，2 mg/L脫落酸； 所述的分化培養(yǎng)基為以MS大量元素、微量元素、有機(jī)成分和鐵鹽為基本組分，白砂糖濃度為30g/L，瓊脂條8g/L，設(shè)置附加0.2-0.5mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸，2-2.5mg/L激動素細(xì)胞分裂素，2 _3mg/L脫落酸； 所述的幼苗壯根培養(yǎng)基為以MS大量元素、 微量元素、有機(jī)成分和鐵鹽為基本組分，白砂糖濃度為30g/L，瓊脂條8g/L ； 上述各培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整PH值5.9。
本發(fā)明中，所述的至少含有8%的RS的水稻材料是指:扎西瑪，或白銀單，或花綠豐；所述的直鏈淀粉含量不超過15%且單株產(chǎn)量不低于40g/株的，符合國標(biāo)二級優(yōu)質(zhì)稻谷標(biāo)準(zhǔn)的水稻材料是指:南粳46,或武育粳3號,或Koshihikar。
本發(fā)明中，所述的將花藥誘導(dǎo)出愈傷組織通過繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)后再通過分化培養(yǎng)基分化為植株是指:選取長均為0.5-1 Cm、淺黃色、干燥以及顆粒狀愈傷組織，在50ml的三角瓶中接入10個愈傷組織塊，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，在20001ux的光強(qiáng)下，14h Light/D下培養(yǎng)，14-21 d后，再選取培養(yǎng)后的淺黃色、干燥且顆粒狀的愈傷組織，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，21-30d后，開始分化，長出綠芽；所述的直接將花藥誘導(dǎo)出的愈傷組織通過分化培養(yǎng)基分化為植株，得到穩(wěn)定的花培株系是指:選取長均為0.5-1 cm、淺黃色、干燥以及顆粒狀愈傷組織，在50ml的三角瓶中接入10個愈傷組織塊，接入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，21-30d后，開始分化，長出綠芽。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:克服了聚合多個基因可能帶來的費(fèi)用和沉默的不足，結(jié)合常規(guī)雜交，生理鑒定和花藥培養(yǎng)的特點(diǎn)，形成了一種快速有效的植物育種方法。以水稻為例，隨著人民生活水平的提高，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的功能食品成為未來研究的重要方向，但是特殊的功能食品都是與獨(dú)特代謝機(jī)制有關(guān)，是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果，即使通過基因工程的現(xiàn)代生物技術(shù)也難以改良，而且還存在公眾對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的認(rèn)知程度，離推廣應(yīng)用還有相當(dāng)?shù)木嚯x。本方法通過單個功能特征高RS含量與優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)特征建立的對應(yīng)關(guān)系，將2個材料進(jìn)行簡單的聚合，克服了多基因?qū)肟赡軒淼某聊Ｒ?guī)單一雜交育種方法的長周期以及植物生態(tài)環(huán)境差異造成生理性狀的不穩(wěn)定等難題，通過高RS材料與優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻材料的雜交，通過花藥培養(yǎng)，優(yōu)化花藥愈傷組織誘導(dǎo)和分化等培養(yǎng)基配方，快速穩(wěn)定的獲得高RS的水稻種質(zhì)。本發(fā)明不僅花費(fèi)低，又便于育種者實(shí)施，尤其是花藥培養(yǎng)方法的優(yōu)化，在本發(fā)明使用的培養(yǎng)基配方范圍內(nèi)，使該雜交Fl的花藥得到高達(dá)32.1%出愈率以及不低于40%分化率，花藥培養(yǎng)的平均再生率達(dá)到1.2%以上，且整個培育周期只有2年，尤其對地理遠(yuǎn)源和秈粳雜交水稻Fl代材料在花藥培養(yǎng)中常遭遇的白化苗高的問題，也有很好的效果。通過本發(fā)明可以在2年內(nèi)獲得RS含量不低于5%，直鏈淀粉不高于15%，且單株產(chǎn)量不低于40g/株的水稻種質(zhì)，可見，本發(fā)明的方法提高了秈粳雜交水稻花藥組織培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)率和再生率，開拓了 RS功能產(chǎn)品的培育方法，拓寬了通過生物技術(shù)改良栽培水稻基因型的范圍，并將可能配組或育成新的聚合多個優(yōu)良性狀的優(yōu)質(zhì)水稻功能品種，從而提高了水稻生物技術(shù)育種效率。


圖1是不同基本培養(yǎng)基對雜交水稻Fl花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。
圖2是不同蔗糖濃度對供 試水稻花藥愈傷組織出愈率的影響。
圖3是不同4°C低溫預(yù)處理時間對供試水稻花藥愈傷誘導(dǎo)率的影響。
圖4是不同低溫處理條件下不同激素配比對水稻花藥出愈率的影響。
圖5是秈粳雜交Fl水稻花藥通過組織培養(yǎng)的再生體系。
圖6展示了對秈粳雜交Fl進(jìn)行花藥培養(yǎng)的再生體系，其中:a)花藥培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基山)花藥培養(yǎng)在培養(yǎng)基上約21 d誘導(dǎo)形成愈傷組織；c)愈傷組織在繼代培養(yǎng)；d)愈傷組織培養(yǎng)在再生培養(yǎng)基上約14-21 d出現(xiàn)綠點(diǎn)；e)再生培養(yǎng)基上綠點(diǎn)形成綠芽；f)再生植株。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 扎西瑪/南粳46的Fl的獲得 2011年5月在南京用扎西瑪為母本，以南粳46為父本，獲得500粒雜種Fl種子，其中扎西瑪是云南的地方品種，測定其大米的PS含量為8%，是高RS特色種質(zhì)資源；南粳46是江蘇省農(nóng)科院糧作所以優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)粳稻“武香粳14”為母本，與日本優(yōu)質(zhì)粳稻“關(guān)東194”雜交，屬中熟晚粳稻類型優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)粳稻品種，直鏈淀粉含量為15%，產(chǎn)量為50g/ /株。
實(shí)施例2對扎西瑪/南粳46的Fl使用的各培養(yǎng)基的設(shè)計 a)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的設(shè)計 基本培養(yǎng)基的選擇: 選擇以下組分:白砂糖6%，瓊脂條8g/L，附加2，4- 二氯苯氧乙酸1-3.0 mg/L，萘乙酸0.5-3.0 mg/L，激動素0.2-0.3· mg/L，設(shè)置了 30 g/L和60 g/L兩個白砂糖濃度，將它們分別與M8、N6和SK3的大量元素、微量元素、有機(jī)成分和鐵鹽成分為基本成分，組成六組分別組成花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
上述各培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值5.9。
雜交水稻的Fl代(由實(shí)施例1提供，下同) 試驗方法: 2012年3月取供試水稻單核靠邊期花穗，經(jīng)1-10天4°C低溫預(yù)處理后，花藥接種在上述7種不同的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行同步平行試驗，每瓶接種50?；ㄋ帲總€處理做20瓶，進(jìn)行全暗培養(yǎng)，溫度為26土 1°C，培養(yǎng)約30 d后，獲得愈傷組織，計算愈傷組織誘導(dǎo)率:愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生的愈傷組織花藥/接種的花藥數(shù))X 100%。
實(shí)驗結(jié)果記錄在圖廣3中，從圖1可以看出，在M8、N6作為基本培養(yǎng)基時，水稻花藥愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于SK3作為基本培養(yǎng)基的，且M8和N6在誘導(dǎo)水稻花藥愈傷組織間，沒有顯著性差異。本發(fā)明實(shí)施例中均選用N6作為基本培養(yǎng)基。
由圖2可見，比較設(shè)置30 g/L和60 g/L的2個蔗糖濃度，施加60g/L的蔗糖出愈率高，本發(fā)明實(shí)施例中均選用該濃度。
因此，花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的基本培養(yǎng)基選用N6，白砂糖濃度選擇60 g/L。
低溫處理時間的選擇: 試驗方法: 選取水稻材料的低溫處理時間是指取單核靠邊期的花穗，即將Fl雜種的單核靠邊期花穗，取劍葉抽出0.5-1厘米的花穗，經(jīng)75%乙醇消毒后裝置塑料袋內(nèi)，放入4°C冰箱低溫處理1-1Od后，分別將低溫預(yù)處理后的花藥接種在相同的花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種50?；ㄋ?，每個處理做20瓶，進(jìn)行全暗培養(yǎng)，溫度為26± 1°C，培養(yǎng)約30 d后，獲得愈傷組織，計算愈傷組織誘導(dǎo)率:愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生的愈傷組織花藥/接種的花藥數(shù))X 100%ο
由圖3可以看出，在不同低溫處理天數(shù)下，經(jīng)低溫處理2 -5 d，出愈率達(dá)到8%，其中低溫處理4 d后，出愈率達(dá)最高，即達(dá)11.82%，因此本發(fā)明選用低溫預(yù)處理天數(shù)為2 -5 d。
激素的選擇:圖4中各標(biāo)號表示不同激素組合的水稻花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其中: 誘導(dǎo)培養(yǎng)基A為:N6+1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸,3mg/L萘乙酸。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基B為:Ν6+1.5 mg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸，2mg/L萘乙酸。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基C為:N6+1.5 mg/L 2,4_ 二氯苯氧乙酸,2mg/L萘乙酸， 0.3 mg/L激動素。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基D為:N6+2 mg/L 2,4_ 二氯苯氧乙酸，lmg/L萘乙酸。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基E為:N6+2 mg/L 2,4_ 二氯苯氧乙酸，lmg/L萘乙酸， 0.3 mg/L激動素。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基F為:N6+3 mg/L 2,4_ 二氯苯氧乙酸，lmg/L萘乙酸。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基G為:N6+3 mg/L 2,4_ 二氯苯氧乙酸,0.5mg/L萘乙酸， 0.3 mg/L激動素。
各組培養(yǎng)基中添加白砂糖6%，瓊脂條8g/L，同時，各培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值5.9。
試驗方法: 將Fl雜種的單核靠邊期花穗，取劍葉抽出0.5-1厘米的花穗，經(jīng)75%乙醇消毒后裝置塑料袋內(nèi)，經(jīng)低溫預(yù)處理后，再用75%乙醇的表面消毒，除去稻穗外鞘放入滅菌的三角瓶內(nèi)。先用75%的乙醇消毒5 min,再用0.1%的HgCl2消毒15 min后,再用無菌水漂洗3遍，將消毒的水稻稻穗，剪去穎殼，用鑷子將有切口的穎殼，對準(zhǔn)三角瓶的瓶口，敲入到不同的花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶約50粒，以上操作均在超凈工作臺上無菌條件下進(jìn)行。接種好花藥的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室內(nèi)，26°C_ 28°C，黑暗條件下培養(yǎng)30 d，計算花藥的出愈率，愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生的愈傷組織花藥/接種的花藥數(shù))X 100%。
從圖4表明，培養(yǎng)基B、C，D在本發(fā)明的低溫預(yù)處理下，花藥出愈率均達(dá)到10%以上，其中培養(yǎng)基中添加2 mg/L 2，4-D、l mg/L NAA和0.3 mg/L激動素誘導(dǎo)率最高，達(dá)32.14%，本發(fā)明實(shí)施例中選用濃度范圍為1-1.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+1.5-2.0 mg/L萘乙酸+0.3 mg/L激動素。
綜合上述數(shù)據(jù)，確定愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳方案為:以N6為基本培養(yǎng)基，附加2,4-二氯苯氧乙酸1-1.5 mg/L +萘乙酸1.5-2.0 mg/L +激動素0.3 mg/L+脫落酸2mg/L+脯氨酸100 mg/L+水解酪 蛋白300 mg/L+白砂糖60g/L+瓊脂條8g/L。
b)分化培養(yǎng)基的設(shè)計 圖5中各標(biāo)號表示不同激素的分化培養(yǎng)基，其中: A為:MS+2 mg/L激動素，2mg/L脫落酸。
B 為:MS +2 mg/L 激動素，3mg/L 脫落酸。
C 為:MS +0.2 mg/L 2,4_ 二氯苯氧乙酸,2.5mg/L 激動素，2 mg/L 脫落酸。
D為:MS +0.5 mg/L 2,4_ 二氯苯氧乙酸,2mg/L激動素，2 mg/L脫落酸。
所述各組培養(yǎng)基中添加白砂糖6%，瓊脂條8g/L，同時，各培養(yǎng)基在高壓滅菌前，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值5.9。
試驗方法 將試驗組花藥誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 30天的愈傷組織，選取長均為0.5-lcm、淺黃色、干燥且顆粒狀愈傷組織，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基光下培養(yǎng)，待增殖14-21 d后，再選取淺黃色、干燥且顆粒狀愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，21-30d后，開始分化。計算愈傷組織分化率:愈傷組織分化率=(產(chǎn)生的綠芽的愈傷組織/接種的愈傷組織數(shù))X 100%。
從圖5可見，培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上愈傷接種到分化培養(yǎng)基14-20d后，帶綠芽點(diǎn)的愈傷組織在本發(fā)明的分化培養(yǎng)基上即可分化成植株，分化綠芽點(diǎn)，甚至可一步成苗，其中分化培養(yǎng)基A和C的分化率可達(dá)45.5%和46.9%。
因此，分化培養(yǎng)基的最佳選擇為:以MS大量元素、微量元素、有機(jī)成分和鐵鹽為基本組分，白砂糖濃度為30g/L，瓊脂條8g/L，設(shè)置附加0.2-0.5mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸，2-2.5mg/L激動素,2 -3mg/L脫落酸。
c)其他培養(yǎng)基的選擇: 繼代培養(yǎng)基:以M8大量元素、微量元素、有機(jī)成分和鐵鹽為基本組分，白砂糖濃度為50g/L,瓊脂條8g/L,附加0.5-1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸,2-2.5 mg/L激動素,2 mg/L脫落酸。
幼苗壯根培養(yǎng)基:以MS大量元素、微量元素、鐵鹽及有機(jī)成分為基本組分，白砂糖濃度為30g/L，瓊脂條8g/L。
各培養(yǎng)基在高壓滅菌前，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值5.9。
實(shí)施例3花藥誘導(dǎo)愈傷組織 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(由實(shí)施例2的最佳方案提供) 將Fl雜種的單核靠邊期花穗，取劍葉抽出0.5-1厘米的花穗，經(jīng)75%乙醇消毒后裝置塑料袋內(nèi)，經(jīng)低溫預(yù)處理3天后，稻穗取出。花藥的接種操作均在超凈工作臺上無菌條件下進(jìn)行:先用75%乙醇的表面消毒，除去稻穗外鞘放入滅菌的三角瓶內(nèi)。先用75%的乙醇消毒5 min,再用0.1%的HgCl2消毒15 min后再用無菌水漂洗3遍,將消毒的水稻稻穗,剪去穎殼，用鑷子將有切口的穎殼，對準(zhǔn)三角瓶的瓶口，敲入到不同的花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶約50粒。接種好的花藥的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，260C - 28°C，黑暗條件下培養(yǎng)30 d，即可獲得淺黃色、干燥和顆粒狀愈傷組織，出愈率為35%。
實(shí)施例4愈傷組織的分化培養(yǎng)，獲得試管苗 方案I 繼代培養(yǎng)基:由實(shí)施例2提供。
分化培養(yǎng)基:由實(shí)施例2的分化培養(yǎng)基最佳方案提供。
選取長均 為0.5-1 cm、淺黃色、干燥且顆粒狀愈傷組織(實(shí)施例3提供)，在50ml的三角瓶中接入10個愈傷組織塊，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基增殖，愈傷組織轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基的操作，均在超凈工作臺上無菌條件下進(jìn)行。在20001UX的光強(qiáng)下，14h Light/D下培養(yǎng)，14-21d后即可獲得大量的愈傷組織，再選取淺黃色、干燥且顆粒狀的愈傷組織，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，21-30d后，開始分化，長出綠芽，分化率為45%，并形成綠色花培株系?；ㄋ幣囵B(yǎng)的再生率約14.8%。
方案2 分化培養(yǎng)基:由實(shí)施例2的分化培養(yǎng)基最佳方案提供。
選取長均為0.5-1 cm、淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織，在50ml的三角瓶中接入10個愈傷組織塊，接入分化培養(yǎng)基，愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基的操作，均在超凈工作臺上無菌條件下進(jìn)行，21-30d后，開始分化，長出綠芽，形成花培株系。
花培株系的綠芽長出3葉植株后，轉(zhuǎn)接入幼苗壯根培養(yǎng)基中生長15 d后，為增加植株的生長空間，選用500ml的塑料瓶作為培養(yǎng)器皿，即長出白色健壯的根系，選取根系發(fā)達(dá)的茁壯綠色試管苗，打開瓶口，加入水沒過培養(yǎng)基，讓試管苗在培養(yǎng)室內(nèi)開放的空間內(nèi)適應(yīng)3天以上，保證培養(yǎng)基不斷水，生長正常的植株即可用于開放空氣中自然條件下種植。
實(shí)施例5獲得花培水稻的二倍體植株結(jié)出飽滿的種子 試管苗再經(jīng)7天溫室練苗，在南京水稻生長的正季-夏季即移栽至簡易大棚后，待15d天后，生長健壯的小苗即可長出新的分蘗，再用秋水仙素在莖節(jié)切口涂抹，進(jìn)行加倍處理，然后移至大田發(fā)育成熟，收獲二倍體植株結(jié)出飽滿的種子。如果是在南京冬春季節(jié)，則移入溫室，保證溫度在25度以上，或者轉(zhuǎn)移到同季海南水稻育種基地，大田常規(guī)栽培管理，成熟期收獲種子。
為了獲得穩(wěn)定的花培材料的種子，花藥誘導(dǎo)出的150株綠苗，2012年5月在南京種植，獲得48株二倍體的植株，按單株收獲種子(植株倍型是按照外部形態(tài)判定，單倍體:植株矮小，穎殼小，不結(jié)實(shí)；二倍體:結(jié)實(shí)正常；多倍體:植株較大、有芒、不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率極低)。
實(shí)施例6穩(wěn)定花藥培養(yǎng)株系的高RS的獲得 RS含量的測定:準(zhǔn)確稱取1.0g精米，加3 ml蒸餾水(確保煮后米飯中的水分含量在70%),沸水中煮30 min,室溫下冷卻10 min,按照Megazyme RS測定試劑盒方法,加入胰腺α 一淀粉酶，37°C水浴振蕩消化16 h后，測定RS含量。
試驗方法: 2012年10月將南京收獲的48株二倍體的材料，分單株系在南京種植，每個株系用3個IOL盆缽種植，15粒，每盆種5粒，在田間觀察其穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，所有的株系都是穩(wěn)定的，沒有出現(xiàn)分離，正常田間管理，在收獲期，進(jìn)行產(chǎn)量性狀的考察，并對精米進(jìn)行RS和直鏈淀粉含量的測定。
結(jié)論:將獲得的48株二倍體水稻植株，收獲水稻種子，進(jìn)行RS含量的測定，他們均在2-7%之間，證明花藥培養(yǎng)是可快速穩(wěn)定水稻的高RS特性。
進(jìn)一步考察其產(chǎn)量性狀，發(fā)現(xiàn)這些高RS材料與產(chǎn)量也有很好的相關(guān)性，最后篩選出6株株型良好、具有RS含量不低于5%，直鏈淀粉不低于19%，籽粒產(chǎn)量與高產(chǎn)親本南粳46相當(dāng)?shù)募兿担麨閆N，(ZN取分別為親本扎西瑪和南粳46的首字母縮寫組成)，5個株系為ZN-1，ZN-2, ZN-3, ZN -4, ZN-5 (結(jié)果見表I )，表明通過上述方法，快速獲得具有RS的穩(wěn)定材料。
表I高抗性淀粉花藥培養(yǎng)穩(wěn)定水稻材料的鑒定品種或組合I直鏈淀粉含量(％) |RS含量(％) I籽粒產(chǎn)量1000粒重(g) I單株產(chǎn)量(g)南粳 46 15.0±0.50.5±0.04 五.2±1.250.06±2.02扎西瑪 28.1±0.68.1±0.07 5.4±1.320.03±0.56ZN—I15.0±0.46.3±0.05 5.7±1.245.09±1.5ZN—214.3±0.76.4±0.06 .3±1.546.98±1.28ZN—314.9±0.65.1±0.05 五.9±1.640.36±1.39ZN—414.7±0.55.0±0.05 5.1±1.748.6±2.05ZN—5| 5.0±0.7|5.5±0.04 |22.3±1.2|40.9±1.59 從表I可以看出，通過本發(fā)明的方法，可以培育出RS含量3 5%、直鏈淀粉=15%，且單株產(chǎn)量3 40g/株的穩(wěn)定水稻種質(zhì)。
本發(fā)明的整個培育周期只有兩年。
以上各實(shí)施例不是 對本發(fā)明的具體限制。
權(quán)利要求
1.一種具有高抗性淀粉低直鏈淀粉的水稻種質(zhì)的培育方法，其特征在于: a)以至少含有8%的抗性淀粉的水稻材料為母本，與以直鏈淀粉含量不超過15%且單株產(chǎn)量不低于40g/株的，符合國標(biāo)二級優(yōu)質(zhì)稻谷標(biāo)準(zhǔn)的水稻材料為父本進(jìn)行雜交，獲得Fl雜種； b)將Fl雜種的單核靠邊期花穗，即取劍葉抽出0.5-1厘米的花穗，經(jīng)75%乙醇消毒后，裝在塑料袋內(nèi)，經(jīng)2-5天4°C低溫預(yù)處理后，花藥接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行全暗培養(yǎng)，溫度為26 ± I °C，培養(yǎng)約30 d后，獲得愈傷組織； c)將花藥誘導(dǎo)出的愈傷組織通過繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再通過分化培養(yǎng)基分化為植株，或直接將花藥誘導(dǎo)出的愈傷組織通過分化培養(yǎng)基分化為植株，得到穩(wěn)定的花培株系； d)花培株系的綠芽長出3葉后，轉(zhuǎn)接入幼苗壯根培養(yǎng)基中生長15d后，獲得根系發(fā)達(dá)的茁壯試管苗植株； e)試管苗經(jīng)7d溫室練苗，移栽至簡易大棚后，生長健壯的小苗在15 d左右長出新的分蘗，用秋水仙素在莖節(jié)切口涂抹，進(jìn)行加倍處理，然后移至大田發(fā)育成熟，收獲二倍體植株結(jié)出的飽滿種子； f)將收獲的種子在田間種植，到收獲期，進(jìn)行產(chǎn)量性狀的考察，并對獲得水稻花培株系樣品的精米，進(jìn)行抗性淀粉和直鏈淀粉含量的測定，篩選單株產(chǎn)量不低于40g/株，同時精米中抗性淀粉大于5%、直鏈淀粉含量小于15.0%的穩(wěn)定水稻花培株系，作為培育的高抗性淀粉的水稻種質(zhì)； 所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:以N6大量元素、微量元素、有機(jī)成分和鐵鹽為基本組分，附加2,4-二氯苯氧乙酸1-1.5 mg/L +萘乙酸1.5-2.0 mg/L +激動素0.3 mg/L+脫落酸2 mg/L+脯氨酸100 mg/L+水解酪蛋白300 mg/L+白砂糖60g/L+瓊脂條8g/L ； 所述的繼代培養(yǎng)基為以M8大量元素、微量元素、有機(jī)成分和鐵鹽為基本組分，白砂糖濃度為50g/L，瓊脂條8g/L，附加0.5-1 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，2-2.5 mg/L激動素，2mg/L脫落酸； 所述的分化培養(yǎng)基為以MS大量元素、微量元素、有機(jī)成分和鐵鹽成分為基本組分，白砂糖濃度為30g/L，瓊脂條8g/L，設(shè)置附加0.2-0.5mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸，2-2.5mg/L激動素，2 _3mg/L脫落酸； 所述的幼苗壯根培養(yǎng)基為以MS大量元素、微量元素、有機(jī)成分和鐵鹽為基本組分，白砂糖濃度為30g/L，瓊脂條8g/L ； 上述各培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整PH值5.9。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有高抗性淀粉低直鏈淀粉的水稻種質(zhì)的培育方法，其特征在于:所述的至少含有8%抗性淀粉的水稻材料是指:扎西瑪，或白銀單，或花綠豐；所述的直鏈淀粉含量不超過15%且單株產(chǎn)量不低于40g/株的，符合國標(biāo)二級優(yōu)質(zhì)稻谷標(biāo)準(zhǔn)的水稻材料是指:南粳46,或武育粳3號,或Koshihikar。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有高抗性淀粉低直鏈淀粉的水稻種質(zhì)的培育方法，其特征在于:所述的將花藥誘導(dǎo)出愈傷組織通過繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再通過分化培養(yǎng)基分化為植株是指:選取長均為0.5-1 cm、淺黃色、干燥以及顆粒狀愈傷組織，在50ml的三角瓶中接入10個愈傷組織塊，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，在20001ux的光強(qiáng)下，14h Light/D下培養(yǎng)，14-21 d后，再選取培養(yǎng)后的淺黃色、 干燥且顆粒狀的愈傷組織，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基21-30d后，開始分化，長出綠芽；所述的直接將花藥誘導(dǎo)出愈傷組織通過分化培養(yǎng)基分化為植株，得到穩(wěn)定的花培株系是指:選取長均為0.5-1 Cm、淺黃色、干燥和顆粒狀愈傷組織，在50ml的三角瓶中接入10個愈傷組織塊于分化 培養(yǎng)基上，21-30d后，開始分化，長出綠芽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有高抗性淀粉低直鏈淀粉的水稻種質(zhì)的培育方法。是通過篩選的高抗性淀粉的水稻種質(zhì)與具有優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的水稻種質(zhì)雜交，獲得F1雜種；然后通過花藥培養(yǎng)，得到高頻的穩(wěn)定花藥培養(yǎng)株系；對花藥培養(yǎng)株系進(jìn)行加倍處理，獲得的種子進(jìn)行抗性淀粉和直鏈淀粉的鑒定，篩選后獲得聚合高抗性淀粉和低直鏈淀粉的優(yōu)良性狀的高產(chǎn)水稻種質(zhì)，該方法的培育周期只有兩年，而且使得類型的水稻材料愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到30%以上且分化率為40%，花藥培養(yǎng)的平均再生率達(dá)到1.2%以上。
文檔編號A01H1/04GK103141376SQ20131010732
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者李霞, 田親親, 魏曉東, 方先文, 陸長梅 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院