專利名稱：一株用于防治柑桔潰瘍病的枯草芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病害生物控制技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一株用于防治柑桔潰瘍病的枯草芽孢桿菌CCCQ080菌株。
背景技術(shù)：
柑桔是世界第一大水果，在巴西、中國(guó)、美國(guó)等138個(gè)國(guó)家(地區(qū))都有種植，總面積約800萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量1.2億余噸。中國(guó)是柑桔最重要的原產(chǎn)中心，目前柑桔栽培面積約190萬(wàn)hm2,年產(chǎn)量約2千萬(wàn)噸,分別居世界第一位和第二位。柑桔潰瘍病(citrus canker)是由地毪草黃單胞桿菌柑桔致病變種(Xanthomonas axonopodis pv.cirri)引起的柑桔毀滅性病害，為國(guó)內(nèi)外重大檢疫對(duì)象，主要侵染蕓香科柑桔屬、枳屬及金柑屬植物。該病害主要分布在亞洲、非洲及美洲的30多個(gè)國(guó)家，約占生產(chǎn)柑桔國(guó)家和地區(qū)的三分之一，其中以亞洲發(fā)生最為普遍。柑桔潰瘍病對(duì)我國(guó)柑桔產(chǎn)業(yè)也產(chǎn)生了重大影響，該病害在廣東、廣西、福建、浙江、海南等沿海地區(qū)一直普遍發(fā)生。江西省種植面積約15萬(wàn)hm2，柑桔潰瘍病發(fā)生面積約2.5萬(wàn)hm2 ;湖南省柑桔種植面積28萬(wàn)余hm2，柑桔潰瘍病發(fā)生面積I萬(wàn)余hm2 ;貴州省柑桔潰瘍病發(fā)生面積超過(guò)3千hm2。目前對(duì)柑桔潰瘍病的控制仍然以化學(xué)藥劑為主，從而導(dǎo)致病原菌抗藥性增強(qiáng)、環(huán)境污染等嚴(yán)重后果，最終出現(xiàn)防治效果不好、危害生態(tài)安全和人類健康等問(wèn)題。隨著科學(xué)研究的進(jìn)一步深入開展，發(fā)現(xiàn)在克服植物病害的抗藥性、減少化學(xué)殺菌劑對(duì)環(huán)境的污染、生態(tài)的破壞及農(nóng)副產(chǎn)品中化學(xué)農(nóng)藥的殘留方面，生防微生物具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，利用生防菌的次生代謝產(chǎn)物制備的生物農(nóng)藥，具有無(wú)污染、無(wú)殘留、不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性、與環(huán)境相容性高、對(duì)人畜安全等特點(diǎn)，已成為無(wú)公害綠色農(nóng)藥的主體和未來(lái)農(nóng)藥的發(fā)展方向。因此，大力開展生物防治研究是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑，具有重要的生產(chǎn)實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株用于防治柑桔潰瘍病的枯草芽孢桿菌，該菌株對(duì)柑桔潰瘍病有較強(qiáng)的控制效果。根據(jù)菌株菌落培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和生理生化性狀及16S rDNA序列比對(duì)分析，初步確定菌株CCCQ080為枯草芽孢桿菌，并對(duì)它進(jìn)行了抑菌譜測(cè)定，表明其對(duì)多種病原菌有很好的抑菌作用，抗菌譜廣。CCCQ080菌株的篩選:從重慶市土壤和健康植株葉片，分離獲得多個(gè)菌株，經(jīng)初篩和復(fù)篩，最后經(jīng)過(guò)溫室控病防效測(cè)試，確定對(duì)柑桔潰瘍病有較好防治作用的為CCCQ080菌株。CCCQ 080菌株的形態(tài)鑒定:革蘭氏陽(yáng)性菌(圖2)，周生鞭毛(圖1)，產(chǎn)生芽孢(圖3)。CCCQ080菌株的生理生化反應(yīng):在7%的NaCl中生長(zhǎng)，pH= 10生長(zhǎng)，L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖均產(chǎn)酸，V.P陽(yáng)性，酪朊水解，吲哚反應(yīng)為陽(yáng)性，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽，好氧，產(chǎn)生硫化氫等。根據(jù)分類資料將該病原菌初步鑒定為枯草芽孢桿菌。分子生物學(xué)鑒定:通過(guò)提取CCCQ080基因組DNA和16S rDNA PCR擴(kuò)增，CCCQ080擴(kuò)增出的16S rDNA片段長(zhǎng)度為1470bp (圖4)，CCCQ080與芽孢桿菌屬(feci77心sp.)在遺傳上接近，結(jié)合培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、革蘭氏染色及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，將菌株CCCQ080確定為枯草芽孢桿菌iBacillus subtilis、。該菌種的活體純培養(yǎng)已于2012年06月15日保藏于‘中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心’(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼 100101，電話:010-64807355)，保藏號(hào)=CGMCC N0.6224。CCCQ080菌株代謝產(chǎn)物分析:CCCQ080不能分解含幾丁質(zhì)成分培養(yǎng)基，表明產(chǎn)物中無(wú)幾丁質(zhì)酶(圖5) ;CCCQ080在纖維素平板上產(chǎn)生了黃色透明圈，說(shuō)明其代謝產(chǎn)物中均含有纖維素酶，能分解纖維素(圖6);CCCQ080在牛乳蛋白培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯的透明圈，表明產(chǎn)物中含蛋白酶(圖7);嗜鐵素的檢測(cè)結(jié)果顯示，在平板上產(chǎn)生了黃色透明圈，表明CCCQ080有螯合Fe3+離子的能力(圖8)。CCCQ080 菌株抑菌譜測(cè)定:CCCQ080菌株對(duì)病原細(xì)菌柑桔潰瘍病菌(圖9)、煙草青枯病菌和煙草角斑病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用，抑菌圈在5.6^15.6mm之間。對(duì)煙草灰霉病菌、蘋果腐爛病菌和煙草根黑腐病菌等21種植物病原真菌均有一定的抑菌效果，抑菌帶寬度在5 22mm之間。CCCQ080菌株控病效果:CCCQ080對(duì)柑桔潰瘍病有很好的控病作用，溫室離體葉片控病表明，菌株發(fā)酵液預(yù)防噴施24h后再噴霧接種潰瘍病菌，可完全抑制病害發(fā)生(圖10)。溫室植株控病表明，菌株發(fā)酵液預(yù)防噴施24h后再針刺接種潰瘍病菌，預(yù)防效果可達(dá)43.26-61.24%，表現(xiàn)出較好的控制效果。CCCQ080菌株對(duì)柑桔潰瘍病菌生物膜損傷效果:CCCQ080菌株發(fā)酵液上清液處理病菌，可以使其菌液電導(dǎo)率和還原糖含量增加，即表明其發(fā)酵液處理可以使?jié)儾【?xì)胞破損，原生質(zhì)滲漏。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
從植株葉片表面分離獲得的枯草芽孢桿菌CCCQ080菌株，是首次發(fā)現(xiàn)并鑒定的一個(gè)新菌株，其本身在平板上對(duì)柑桔潰瘍病等多種植物病原菌有很強(qiáng)的抑制作用，其發(fā)酵液對(duì)柑桔潰瘍病有很好的防控效果。因?yàn)樵摼晔菑闹仓瓯砻娣蛛x獲得，與自然生態(tài)具有天然的和諧相融性，與化學(xué)農(nóng)藥相比對(duì)土壤生態(tài)無(wú)毒副作用、無(wú)殘留，因此，在病害的生物防治實(shí)踐中具有潛在的商業(yè)開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。


圖1為菌株CCCQ080周生鞭毛 圖2為菌株CCCQ080革蘭氏染色 圖3為菌株CCCQ080芽孢染色
圖4為CCCQ080菌株的16S rDNA堿基片段序列 圖5為菌株CCCQ080幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè) 圖6為菌株CCCQ080纖維素酶活性檢測(cè) 圖7為菌株CCCQ080蛋白質(zhì)酶活性檢測(cè)圖8為菌株CCCQ080嗜鐵素活性檢測(cè)
圖9為菌株CCCQ080對(duì)柑桔潰瘍病菌的抑制作用
圖10為菌株CCCQ080對(duì)柑桔潰瘍病的離體葉片控制作用
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實(shí)施例1.枯草芽孢桿菌CCCQ080菌株的鑒定
(1)形態(tài)學(xué)觀察與鑒定:將菌株CCCQ080在NA培養(yǎng)平板上于28°C下培養(yǎng)l_3d，觀察其菌落形態(tài)(形狀、顏色光澤、表面是否隆起或凹陷、邊緣形狀等);
(2)生理生化反應(yīng)觀察:將菌株CCCQ080接種于溫度、酸堿度、耐鹽性、糖醇發(fā)酵、檸檬酸鹽利用、氮素化合物利用、淀粉等大分子化合物分解和產(chǎn)酶等測(cè)試培養(yǎng)基中，觀察反應(yīng)情況；
(3)分子生物學(xué)鑒定:提取菌株的基因組DNA，以細(xì)菌通用引物fDl:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’，rPl:5’ -ACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3’，以菌株 CCCQ080的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增后經(jīng)電泳檢測(cè)，測(cè)序；利用NCBI網(wǎng)站上的Blast軟件和BioEdit軟件進(jìn)行序列同源性分析,采用Mega 4.0軟件的鄰近法(Neighbor -Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，由此確證CCCQ080的種級(jí)分類階元名稱。確定該菌的分類地位。實(shí)施例2.枯草芽孢桿菌CCCQ080菌株控病效果
2.1 CCCQ080菌株抑菌效果:將菌株點(diǎn)接種在NA平板中，28°C恒溫培養(yǎng)2天后，再用猴頭噴霧器將3乂108(^11/1^的柑桔潰瘍病菌懸液噴于平板上(約100 μ L/皿)，重復(fù)3次。28°C恒溫條件下培養(yǎng)3天后，測(cè)量抑菌圈的直徑。確定CCCQ080菌株對(duì)柑桔潰瘍病的抑制效果。2.2 CCCQ080菌株控病效果
離體葉片法:取健康的甜橙類柑橘葉片若干，用蒸餾水將其表面洗凈，晾干。75%乙醇溶液浸泡30 s,然后用無(wú)菌水洗凈,晾干。將葉片隨機(jī)均勻分成A、B、C和D 4個(gè)處理。A處理葉面只噴灑滅菌水，B只噴灑拮抗菌的發(fā)酵液，C處理葉面先噴灑拮抗菌的發(fā)酵液后噴灑柑橘潰瘍病菌菌懸液，D處理葉面只噴灑潰瘍病菌的菌懸液。噴霧處理后裝入滅菌的密封的托盤內(nèi)，26°C保濕培養(yǎng)。每處理3次重復(fù)。7天后觀察。確定CCCQ080菌株對(duì)柑桔潰瘍病的離體葉片上控制效果?；铙w植株法:選取合適的甜橙植株，噴施拮抗菌I天后針刺接種柑橘潰瘍病菌，以無(wú)菌水代替拮抗菌處理和只接種潰瘍病菌為對(duì)照。每處理5片葉，3次重復(fù)，每片葉片在主脈的兩側(cè)對(duì)稱針刺接種6個(gè)點(diǎn)。再將樣品置于26°C 28°C，相對(duì)濕度80%的智能人工氣候箱中培養(yǎng)25天后觀察。確定CCCQ080菌株對(duì)柑桔潰瘍病的溫室植株上控制效果。實(shí)施例3.CCCQ080菌株代謝產(chǎn)物分析
3.1幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)
唯一碳源培養(yǎng)基(Ch1-Ayers):磷酸二氫銨1.0g、硫酸鎂0.2g、氯化鉀0.2g、瓊脂20g、l%膠體狀幾丁質(zhì)定容至lOOOmL，pH -J.0。膠體狀幾丁質(zhì)的制備:20g甲殼素溶于350mL濃鹽酸，在4°C放置24h，經(jīng)玻璃棉過(guò)濾，濾液加入_20°C過(guò)夜的冰無(wú)水 乙醇2L，10000 r/min離心20min，自來(lái)水沖洗沉淀至中性pH，冷凍干燥，_20°C密封保存。使用膠體狀幾丁質(zhì)時(shí)，用手動(dòng)勻漿器研磨5次以上。將拮抗菌接在上述培養(yǎng)基制成的平板上，28°C培養(yǎng)7-10天，觀察透明圈有無(wú)及測(cè)量透明圈的大小，如有透明圈則表明菌株產(chǎn)生了幾丁質(zhì)酶。以此確定CCCQ080產(chǎn)幾丁質(zhì)酶情況。3.2纖維素酶檢測(cè)
纖維素剛果紅培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀0.5g/L、硫酸鎂0.25g/L、羧甲基纖維素鈉1.88 g/L、明膠 2.0g/L、剛果紅 0.2g/L、瓊脂 20g/L, pH:7.0
把待測(cè)菌接到上述培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7-10天后，用剛果紅(lg/mL)染色lh，倒掉剛果紅染液后，再用氯化鈉(IM)浸泡lh，觀察透明圈的有無(wú)，如有透明圈則表明菌株產(chǎn)生了纖維素酶。以此確定CCCQ080產(chǎn)纖維素酶情況。3.3蛋白酶的檢測(cè)
蛋白培養(yǎng)基:脫脂奶粉40g，瓊脂16g，定容至400mL。將待測(cè)菌接種于上述蛋白培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng):T5天，觀察菌落周圍有無(wú)透明圈。如有透明圈則表明菌株產(chǎn)生了蛋白酶。以此確定CCCQ080產(chǎn)幾丁質(zhì)酶情況。3.4嗜鐵素的檢測(cè)
嗜鐵素培養(yǎng)基:A:a.60.5mg鉻天青S溶于50mL去離子水；b.1OmL三價(jià)鐵溶液(ImM六水三氯化鐵、IOmM鹽酸為溶劑)；c.72.9mg溴化十六碳燒基三甲銨溶于40mL去離子水。上述a、b、c三種溶液混合后定容至IOOmL,調(diào)pH至中性，121°C滅菌20min。B =IOOOmL NA培養(yǎng)液，用NaOH溶液將培養(yǎng)液pH調(diào)至6.8，121 °C滅菌20min。滅菌結(jié)束后混合A，B液后制成平板，接種待測(cè)菌，28°C培養(yǎng)7-10天觀察顏色變化，如有暈圈則表明菌株產(chǎn)生了嗜鐵素。以此確定CCCQ080產(chǎn)嗜鐵素情況。實(shí)施例4.CCCQ080菌株對(duì)柑桔潰瘍病菌生物膜損傷效果
4.1將菌株CCCQ080進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后離心并過(guò)濾，取上清液稀釋0倍(原液)、2倍、5倍、10倍和20倍，取各處理ImL分別加入到20mL NB培養(yǎng)液中，再加入濃度為3 X IO8Cfu/mL柑橘潰瘍病菌菌懸液400uL。另設(shè)置一組未加柑桔潰瘍病菌處理作為平行對(duì)照，以NB液加ImL無(wú)菌去離子水作為空白對(duì)照。每處理3次重復(fù)。然后分別在0h、12h、24h和36h測(cè)定溶液電導(dǎo)率。4.2將菌株CCCQ080分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48h，然后離心并過(guò)濾，取上清液稀釋0倍(原液)、2倍、5倍、10倍和20倍，取各處理ImL分別加入到20mL NB培養(yǎng)液中，以加ImL無(wú)菌水作為空白對(duì)照，再加入濃度為3 X 108Cfu/mL柑橘潰瘍病菌菌懸液400uL。發(fā)酵培養(yǎng)48h后離心并過(guò)濾,取上清液測(cè)定還原糖含量。每處理3次重復(fù)。以此測(cè)定CCCQ080 菌株對(duì)柑桔潰瘍病菌生物膜損傷作用。
權(quán)利要求
1.一株用于防治柑桔潰瘍病的枯草芽孢桿菌)CCCQ080,其保藏號(hào)為 CGMCC N0.6224。`
全文摘要
一株對(duì)柑桔潰瘍病具有較強(qiáng)生防活性的枯草芽孢桿菌株CCCQ080，屬農(nóng)業(yè)病害生物防治領(lǐng)域。此菌從自然環(huán)境寄主葉片上分離獲得，根據(jù)形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。該菌對(duì)柑桔潰瘍病菌有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)柑桔潰瘍病有很好的控制效果。同時(shí)，該菌株還具有廣譜拮抗活性，對(duì)柑桔潰瘍病菌和煙草角斑病菌等病原細(xì)菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用，也對(duì)煙草灰霉病菌、蘋果腐爛病菌和煙草根黑腐病菌等病原真菌有很好的抑菌效果。該菌株次生代謝產(chǎn)物中有纖維素酶，蛋白酶和嗜鐵素等。其發(fā)酵濾液可破壞潰瘍病菌的生物膜，經(jīng)發(fā)酵菌體或次生代謝產(chǎn)物提取技術(shù)可生產(chǎn)環(huán)境友好型生物農(nóng)藥，具有重要的商業(yè)開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01P1/00GK103173394SQ201310091068
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月21日
發(fā)明者馬冠華, 肖崇剛, 董國(guó)菊, 陳國(guó)康 申請(qǐng)人:西南大學(xué)