有競爭力且有效的大豆慢生根瘤菌菌株的制作方法
【專利摘要】根據(jù)本發(fā)明，新的細(xì)菌分離菌株已經(jīng)顯示出具有獨(dú)特的特性。這些細(xì)菌菌株是植物生長促進(jìn)菌（PGPR），在定殖豆科植物方面具有增強(qiáng)的競爭優(yōu)勢，并增強(qiáng)豆科植物生長的整體性能。此外，本發(fā)明公開了用于篩選和選擇具有上述有益特征的細(xì)菌菌株的新方法。
【專利說明】有競爭力且有效的大豆慢生根瘤菌菌株
[0001]對(duì)序列表的引用
[0002]本申請包含一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。該計(jì)算機(jī)可讀形式通過引用的方式合并入本文。
[0003]對(duì)生物材料保藏的引用
[0004]本申請包含對(duì)生物材料保藏的引用，該保藏通過引用的方式合并入本文。關(guān)于完整信息，參見表1。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明涉及分離的細(xì)菌菌株，以及用于選擇具有增強(qiáng)競爭力和性能特性的細(xì)菌菌株的方法。
【背景技術(shù)】
[0006]為保持健康生長，植物必須從它們生長的土壤中提取多種元素。這些元素包括氮和所謂的微量營養(yǎng)素(例如，銅、鐵和鋅)，但是很多土壤缺乏這些元素，或者僅以不容易被植物取得的形式含有它們(通常認(rèn)為，必需元素不能容易地被植物取得，除非它們在土壤中以溶解的形式存在)。對(duì)于大多數(shù)植物來說，氮是必需元素，因?yàn)?，它在氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸、葉綠素、輔酶的合成以及植物的整體生長和健康中起作用。為消除這些不足，通常將缺乏元素源施用至土 壤，以改善生長速率以及增加從作物中獲得的產(chǎn)量。例如，經(jīng)常將硝酸鹽和/或銨添加至土壤，以消除可得氮的缺乏。
[0007]在作物科學(xué)的領(lǐng)域中，眾所周知，很多耕種的作物需要土壤向植物提供相當(dāng)大量的氮。那些需要通過土壤獲得氮的植物的顯著例外是豆科植物。
[0008]具體地，豆科植物與非豆科植物的不同之處在于，它們能夠?qū)⒋髿獾潭榘?。將大氣氮固定為植物可用氮源的能力避免植物從土壤獲得氮的需要。然而，氮固定需要豆科植物與土壤內(nèi)天然(native)細(xì)菌的共生關(guān)系。這種共生關(guān)系中最廣泛研究的合作伙伴之一是慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)或根瘤菌屬(Rhizobium)的細(xì)菌。Gresshoff, P.(1999).1dentification of Plant Genes Involved in Plant-Microbe Interactions.Stacey G.&Keen T.(Ed.) Plant-Microbe Interactions (4th ed.) (Ch.6).St.Paul:APSPress。
[0009]通常，通過植物與微生物之間以及微生物與植物之間的復(fù)雜雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交換來達(dá)到共生。典型地，植物因素，例如黃酮類和類黃酮物質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)菌定殖到豆科植物的根系節(jié)結(jié)中(Gresshoff，1999)。一旦細(xì)菌定殖根系節(jié)結(jié)，細(xì)菌作用于植物的形態(tài)學(xué)改變，即根毛卷曲以及新的根器官-根瘤的發(fā)展。(Gresshoff，1999)。根瘤可以對(duì)于定殖植物建立起適合于使根瘤誘導(dǎo)細(xì)菌分化成固氮共生菌或類菌體的新的生理環(huán)境。(Gresshoff, 1999)。
[0010]眾所周知，根瘤菌的運(yùn)動(dòng)性和趨化性是對(duì)于菌株競爭力的重要貢獻(xiàn)。例如，Althabegoiti 等人，2008，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.282:115-123 討論了從 USDA 110 獲得自發(fā)突變體，與其野生型菌株比較時(shí)，這些自發(fā)突變體具有增加的運(yùn)動(dòng)性，增強(qiáng)結(jié)瘤。此外，Maier 等人,1990, App1.Environ.Microbiol.56 (8):2341-2346 討論了鑰在生物固氮過程中的作用。此外，Alves等人，2003，Plant and Soil252:1_9討論了在巴西使用的大豆接種菌、以及有效固氮競爭力的重要性。最后，Bloem，J.F.等人，2001，Bio Fertil.Soils33:181-189報(bào)道了競爭力在菌種選擇中的重要性。在研究中，研究者使用遺傳工程方法將報(bào)告基因(⑶S)放入目標(biāo)菌株內(nèi)，以作為確定菌株競爭力的方式。(Bloem等人.2001)。因?yàn)樗M(jìn)行的研究(Bloem等人.2001)需要大量使用化學(xué)染色和顯微鏡技術(shù)，所報(bào)道的方法仍然是對(duì)于篩選大樣本微生物為不可行的方法。
[0011]本發(fā)明的目的是提供用于定殖豆科植物的慢生根瘤菌屬的超級(jí)有競爭力的細(xì)菌分離株，其超過市售菌株例如市售菌株USDA 532C的定殖能力。本發(fā)明的另一目的是提供用于定殖豆科植物的慢生根瘤菌屬的超級(jí)有競爭力的細(xì)菌分離株，與菌株(例如，市售菌株USDA 532C)相比，能夠增強(qiáng)在促進(jìn)豆科植物生長方面的效力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]為改善植物的整體健康和植物可用氮源的可得性，需要在定殖植物和增強(qiáng)植物整體生長方面表現(xiàn)較好的細(xì)菌菌株。本發(fā)明的分離菌株實(shí)現(xiàn)這些益處。
[0013]本發(fā)明涉及，與市售可得菌株例如市售菌株USDA 532C相比，至少具有以下增強(qiáng)特性的細(xì)菌分離株，其中增強(qiáng)的特性包括但不限于:
[0014]a.增強(qiáng)的定殖植物的競爭力；和[0015]b.增強(qiáng)的促進(jìn)植物生長的效力。
[0016]本發(fā)明針對(duì)大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobia japonicum)菌株的生物純的培養(yǎng)物:
[0017]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50592的菌株(也保藏為NRRL B-59571)；
[0018]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50593的菌株(也保藏為NRRL B-59572)；
[0019]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50586的菌株(也保藏為NRRL B-59565)；
[0020]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50588的菌株(也保藏為NRRL B-59567)；
[0021]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50587的菌株(也保藏為NRRL B-59566)；
[0022]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50589的菌株(也保藏為NRRL B-59568)；
[0023]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50591的菌株(也保藏為NRRL B-59570)；
[0024]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50590的菌株(也保藏為NRRL B-59569)；
[0025]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50594的菌株(也保藏為NRRL B-50493)；
[0026]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50726的菌株；
[0027]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50727的菌株；
[0028]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50728的菌株；
[0029]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50729的菌株；和
[0030]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50730的菌株，或上述保藏菌株的至少兩種或更多種的組
八
口 ο
[0031]本發(fā)明還涉及，本發(fā)明的分離細(xì)菌菌株包括在16S rDNA序列同一性的基礎(chǔ)上與上述任意菌株密切相關(guān)的菌株，以及在16S rDNA序列同一性的基礎(chǔ)上與任意上述菌株為至少95%相同的菌株。[0032]本發(fā)明還包括增強(qiáng)植物生長的方法，包括將含有至少一種本發(fā)明的菌株或至少兩種或更多種上述保藏菌株的組合的組合物施用于植物、植物種子、或在植物或植物種子周圍的土壤。
[0033]本發(fā)明還包括含有一種或多種本發(fā)明菌株的組合物，具有農(nóng)藝上可接受的載體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1A是示出對(duì)USDA 532C特異的獨(dú)特引物209的PCR凝膠圖。
[0035]圖1B是示出使用USDA 532C和天然菌株時(shí)引物209的特異性的PCR凝膠圖。
[0036]圖2A是示出作為大豆結(jié)瘤的競爭優(yōu)勢菌株的大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C的PCR凝膠圖。
[0037]圖2B是示出作為大豆結(jié)瘤的競爭優(yōu)勢菌株的非大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C的菌株的PCR凝膠圖。
[0038]圖3A是分離菌株和USDA 532C的DNA指紋圖譜樹狀圖:
[0039]138-NRRL B-50589 (也保藏為 NRRL B-59568)；
[0040]13-NRRL B-50586 (也保藏為 NRRL B-59565)；
[0041]pl40-USDA 532C ；
[0042]184-NRRL B-50594 (也保藏為 NRRL B-50493)；
[0043]142-NRRL B-50590 (也保藏為 NRRL B-59569)；
[0044]130-NRRL B-50587 (也保藏為 NRRL B-59566)；
[0045]65-NRRL B-50588 (也保藏為 NRRL B-59567)；
[0046]198-NRRL B-50592 (也保藏為 NRRL B-59571)；
[0047]135-NRRL B-50591 (也保藏為 NRRL B-59570);和
[0048]48-NRRL B-50593 (也保藏為 NRRL B-59572)。
[0049]圖3B是分離菌株和USDA 532C的DNA指紋圖譜樹狀圖:
[0050]138-NRRL B-50589 (也保藏為 NRRL B-59568)；
[0051]13-NRRL B-50586 (也保藏為 NRRL B-59565)；
[0052]140-USDA532C ；
[0053]184-NRRL B-50594 (也保藏為 NRRL B-50493)；
[0054]142-NRRL B-50590 (也保藏為 NRRL B-59569)；
[0055]130-NRRL B-50587 (也保藏為 NRRL B-59566)；
[0056]65-NRRL B-50588 (也保藏為 NRRL B-59567)；
[0057]198-NRRL B-50592 (也保藏為 NRRL B-59571)；
[0058]135-NRRL B-50591 (也保藏為 NRRL B-59570)；
[0059]48-NRRL B-50593 (也保藏為 NRRL B-59572)；
[0060]318-NRRL B-50727 ；
[0061]278-NRRL B-50726 ;
[0062]727-NRRL B-50730 ；
[0063]370-NRRL B-50728 ;和
[0064]518-NRRL B-50729。【具體實(shí)施方式】
[0065]本發(fā)明提供，與市售可得的菌株例如市售菌株USDA 532C相比，至少具有下列增強(qiáng)特性的細(xì)菌分離菌株，其中增強(qiáng)的特性包括但不限于:
[0066]a.增強(qiáng)的定殖植物的競爭力；和
[0067]b.增強(qiáng)的促進(jìn)植物生長的效力。
[0068]本文使用的“細(xì)菌菌株”是指固氮菌的細(xì)菌菌株。也就是說，是共生固氮細(xì)菌的細(xì)菌。用在本文中的細(xì)菌菌株的非限制性實(shí)例包括，但不限于，根瘤菌屬(例如，解纖維素根瘤菌(R.cellulosiIyticum)λ 大田市根瘤菌(R.daejeonense)、菜豆根瘤菌(R.etli)、山羊豆根瘤菌(R.galegae)、高盧根瘤菌(R.gallicum)、賈氏根瘤菌(R.giardinii )、海南根瘤菌(R.hainanense)、華特拉根瘤菌(R.huautlense)、木蘭根瘤菌(R.1ndigoferae)、豌豆根瘤菌(R.leguminosarum)、黃土根瘤菌(R.loessense)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、葡萄牙根瘤菌(R.lusitanum)、蒙古根瘤菌(R.mongolense)、泊羅江根瘤菌(R.miluonense)、冠狀巖黃耆根瘤菌(R.sullae)、熱帶根瘤菌(R.tropici)、居水根瘤菌(R.undicola)、和/或楊凌根瘤菌(R.yanglingense))、慢生根瘤菌屬(例如，B.bete、B.canariense、埃氏慢生根瘤菌(B.elkanii)、西表島慢生根瘤菌(B.1riomotense)、大豆慢生根瘤菌、B.jicamae、遼寧慢生根瘤菌(B.liaoningense)、B.pachyrhizi和/或圓明慢生根瘤菌(B.yuanmingense))、固氮根瘤菌屬(Azorhizobium spp.)(例如，莖瘤固氮根瘤菌(A.caulinodans)和/或德巴瑞納固氮根瘤菌(A.doebereinerae))、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium spp.)(例如，S.abr1、S.adhaerens、美洲中華根瘤菌(S.americanum)、木本樹中華根瘤菌(S.aboris)、費(fèi)氏中華根瘤菌(S.fredii)、S.1ndiaense、柯斯第中華根瘤菌(S.kostiense)、雞眼草中華根瘤菌(S.kummerowiae)、苜猜中華根瘤菌(S.medicae)、草木禪中華根瘤菌(S.meliloti)、墨西哥劍菌(S.mexicanus)、莫雷蘭中華根瘤菌(S.morelense)、薩赫靳中華根瘤菌(S.saheli)、多宿主中華根瘤菌(S.terangae)、和/或新疆中華根瘤菌(S.xinjiangense))、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium spp.)(駱馬它剌中慢生根瘤菌(M.albiziae)、紫槐中慢生根瘤菌(M.amorphae)、查克中慢生根瘤菌(M.chacoense)、鷹嘴豆中慢生根瘤菌(M.ciceri)、華葵中慢生根瘤菌(M.huakuii)、百脈根中慢生根瘤菌(M.loti)、地中海中慢生根瘤菌(M.mediterraneum)、M.pluifarium、北方中慢生根瘤菌(M.septentrionale)、溫帶中慢生根瘤菌(M.temperatum)、天山中慢生根瘤菌(M.tianshanense))的細(xì)菌。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的細(xì)菌菌株還包括具有保藏序列號(hào) NRRL B-50592(也保藏為 NRRL B_59571)、NRRL B-50593(也保藏為 NRRL B-59572)、NRRL B-50586 (也保藏為 NRRL B-59565)、NRRL B-50588 (也保藏為 NRRL B-59567)、NRRLB-50587(也保藏為 NRRL B_59566)、NRRL B_50589(也保藏為 NRRL B_59568)、NRRL B-50591(也保藏為 NRRL B-59570)、NRRL B-50590 (也保藏為 NRRL B_59569)、NRRL B-50594 (也保藏為 NRRL B-50493)、NRRL B-50726、NRRL B-50727、NRRL B-50728、NRRL B-50729、NRRLB-50730的大豆慢生根瘤菌菌株或上述保藏菌株的至少兩種或更多種的組合，包括兩種上述菌株、至少三種上述菌株、至少四種上述菌株、至少五種上述菌株、至少六種上述菌株、至少七種上述菌株、至少八種上述菌株、至少九種上述菌株、至少十種上述菌株、至少十一種上述菌株、至少十二種上述菌株、至少十三種上述菌株、最高包括所有上述菌株。[0069]術(shù)語“市售可得的菌株”是指市售可得的細(xì)菌菌株，例如，USDA532C、USDA110、USDA 123、USDA 127、USDA 129 等，Cregan, P.B.等人，1989，Appl.and Envir0.Microbiol.55(10):2532_2536。
[0070]本文所使用的“增強(qiáng)的競爭力”和/或“增強(qiáng)的結(jié)瘤性”定義為，細(xì)菌菌株具有優(yōu)勢百分比的占瘤率，例如，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99%、最高100 %的占瘤率。“增強(qiáng)的競爭力”根據(jù)下面描述的詳細(xì)檢定法進(jìn)行確定(參見材料和方法:“初步篩選操作指南”和“競爭研究操作指南”)。 [0071]本文所用的術(shù)語“根瘤(nodule)”定義為，包括但不意在限制于，有限生長的根瘤、無限生長的根瘤，或其組合。有限生長的根瘤和無限生長的根瘤的實(shí)例為本領(lǐng)域熟知，且在 Denison, R.F.，2000，The Amer.Naturalist.156(6):567-576 中有過記載。有限生長的根瘤發(fā)現(xiàn)在大豆(Glycine)、百脈根(Lotus)、或菜豆(Phaseolus)物種中，且形狀是圓形和球形。(Denison，2000)。有限生長的根瘤僅生長有限的時(shí)間段-通常為數(shù)周。(Denison, 2000)。與有限生長的根瘤相比,無限生長的根瘤發(fā)現(xiàn)在苜猜(Medicago)、車軸草(Trifolium)、和豌豆(Pisium)物種，具有細(xì)長的形狀且持續(xù)生長。(Denison, 2000)。
[0072]“占瘤率”是本領(lǐng)域已知的術(shù)語。McDermott T.R.&Graham, P.H., Appl.andEnviron.Microbiol.55 (10):2493_2498。本文中使用的“占瘤率”是指，除市售可得的慢生根瘤菌菌株(例如，USDA532C)外的細(xì)菌菌株所占有的根瘤百分比，和/或含有除市售可得慢生根瘤菌菌株(例如，USDA 532C)外的特定細(xì)菌菌株的根瘤數(shù)目除以含有所有細(xì)菌菌株的根瘤總數(shù)?！罢剂雎省备鶕?jù)下面描述的詳細(xì)檢定法來確定(參見材料和方法:“初步篩選操作指南”和“競爭研究操作指南”)，且可以根據(jù)溫室或田間樣本獲得的植物根瘤的分析來確定。舉例來說，占瘤百分比=A/(A+B)，其中A是含有除市售可得的慢生根瘤菌菌株(例如，USDA532C)外的特定細(xì)菌菌株的根瘤數(shù)目，B含有市售可得慢生根瘤菌菌株(例如，USDA 532C)的根瘤數(shù)目。本領(lǐng)域眾所周知的是，盡管存在很少的例外，單個(gè)根瘤將僅含有一種細(xì)菌菌株。Johnston, A.ff.B.等人，1974, J.Gen.Microbiol87:343-350 ；Dunham, D.H.&Baldwin, 1.L., 1931, Soil Science32:235-249 ；Johnson, H.ff.等人，1963，Agron0.J.55:269-271 ；Dudman, ff.F.&Brockwel I, J., 1968, J.Agricul.Res.19:739-747 ；Nicol, H.&Thorton, H.G., 1941, Proc.Roy.Soc.B130, 32-59 ；Hughes, D.Q., &Vincent, J.M.,1942, Proc.0f the Linnenan Soc.0f New South Wales67:142-152 ;和 Vincent, J.M.&ffaters, L.M., 1953, J.Gen.Microbiol.9:357_370。
[0073]本文所用的“在促進(jìn)生長方面的增強(qiáng)的效力”包括以蒲式耳/英畝為單位測量的增加的植物產(chǎn)量、增加的果實(shí)數(shù)、增加的根數(shù)、增加的根長、增加的根質(zhì)量、增加的根體積、增加的葉面積、增加的植物占地面積(s t an d )、增加的植物強(qiáng)健度、和/或增加的固氮(N2)能力中的至少一種?！霸诖龠M(jìn)生長方面的增強(qiáng)的效力”根據(jù)下面描述的詳細(xì)檢定法進(jìn)行確定(參見材料和方法:“初步篩選操作指南”和“性能研究操作指南”)，且可以經(jīng)由溫室或野外樣本獲得的植物根瘤的分析加以確定。
[0074]本文使用的“增加的果實(shí)數(shù)”是指，大豆植物上增加的大豆豆莢總數(shù)，和/或大豆植物上增加的大豆豆莢的總干重。[0075] 本文所用的“總干重”是指，在80°C孵育特定時(shí)間段后，例如至少4小時(shí)、至少8小時(shí)、至少12小時(shí)、至少24小時(shí)、至少48小時(shí)等，或在需要用來干燥植物質(zhì)的任何時(shí)間段后，植物質(zhì)(例如，植物果實(shí)、植物豆莢、植物根系、植物根瘤、整個(gè)植物、部分植物等)的重量。應(yīng)該理解的是，確定“總干重”的干燥時(shí)間取決于很多因素?？梢杂绊懜稍飼r(shí)間的非限制性因素包括所要干燥的材料、所要干燥的材料的質(zhì)量、所要干燥的材料的量，和/或其組合。孵育可以在本領(lǐng)域使用的任何溫度控制設(shè)備中進(jìn)行。出于本發(fā)明的目的，使用Eppendorf Innova? 42R孵育箱來確定“總干重”。
[0076]本文所用的術(shù)語“增加的固氮(N2)能力”是指，分離的菌株可以增加氮(N2)的固定。根據(jù)下文提供的“性能研究操作指南”(材料和方法)，可以通過使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)氮量化方法(例如，凱氏定氮法等)來測量植物的總氮含量，從而量化細(xì)菌的相對(duì)固氮(N2)能力。參見 Takahashi, M.等人，2007.Uptake, Assimilation, andNovel Metabolism of Nitrogen Dioxide in Plants, p.109 — 118。N.Willey(ed.), Phytoremediation:Methods and Reviews, vol.23.Humana Press, NewYork 中，Bremner, J.M.1965.Total nitrogen, p.1149-1178。C.A.Black (ed.), Methodsof soil analysis, vol.2.American Society for Agronomy, Madison 中，Schank, S.C.等人,1981, App.and Envir0.Microbiol., 41(2):342_345。
[0077]在本發(fā)明的另一方面，分離的細(xì)菌菌株具有增強(qiáng)的溫度耐受性?！霸鰪?qiáng)的溫度耐受性”是指所分離的細(xì)菌菌株能夠生長的溫度范圍，例如分離的慢生根瘤菌菌株能夠生長的最大和最小溫度。在一個(gè)方面，根據(jù)下文討論的(材料和方法)“溫度分布操作指南”來確定“增強(qiáng)的溫度耐受性”。
[0078]在本發(fā)明的另一方面，分離的細(xì)菌菌株天然耐受于草甘膦。在一個(gè)方面，根據(jù)下文討論的(材料和方法)“耐草甘膦情況操作指南”來確定“增強(qiáng)的溫度耐受性”。
[0079]在另一個(gè)方面，本發(fā)明的分離細(xì)菌菌株包括在16S rDNA序列同一性的基礎(chǔ)上與任意上述菌株密切相關(guān)的菌株。關(guān)于使用16S rDNA序列同一性以確定細(xì)菌關(guān)聯(lián)性，參見 Stackebrandt E 等人,“Report of the ad hoc committee for the re-evaluationof the species definition in bacteriology,，，Int J Syst Evol Microbiol.52 (3):1043-7(2002)。在實(shí)施方式中，至少一種菌株在16S rDNA序列同一性的基礎(chǔ)上與任意上述菌株為至少95 %相同，在16S rDNA序列同一性的基礎(chǔ)上與任意上述菌株為至少96 %相同，在16S rDNA序列同一性的基礎(chǔ)上與任意上述菌株為至少97%相同，在16S rDNA序列同一性的基礎(chǔ)上與任意上述菌株為至少98%相同，在16S rDNA序列同一性的基礎(chǔ)上與任意上述菌株為至少98.5%相同，在16S rDNA序列同一性的基礎(chǔ)上與任意上述菌株為至少99%相同，或在16S rDNA序列同一性的基礎(chǔ)上與任意上述菌株為至少99.5%相同。
[0080]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括用于分離具有增強(qiáng)的占據(jù)豆科植物根瘤的競爭力以及增強(qiáng)的促進(jìn)豆科植物生長的效力的細(xì)菌菌株的方法。本文所用的術(shù)語“分離、分離株和/或分離的等等”是指，所涉及的材料從其通常發(fā)現(xiàn)的環(huán)境去除。除其他方面外，本方法還包括，
[0081]a.從土壤樣本獲得細(xì)菌菌株；
[0082]b.使細(xì)菌菌株和市售可得菌株接觸豆科植物；
[0083]c.選擇比市售可得菌株在占據(jù)豆科植物根瘤方面更有競爭力的細(xì)菌菌株；[0084]d.對(duì)于比市售可得菌株在占據(jù)豆科植物根瘤方面更有競爭力的所選擇細(xì)菌菌株，分析出在促進(jìn)豆科植物生長方面具有增強(qiáng)的效力的那些細(xì)菌菌株；以及
[0085]e.分離出在促進(jìn)豆科植物生長方面具有增強(qiáng)的效力的細(xì)菌菌株。
[0086]在一個(gè)方面，分離的細(xì)菌菌株是慢生根瘤菌屬的菌株。在另一方面，方法還包括，針對(duì)對(duì)市售可得慢生根瘤菌例如市售菌株USDA532C特定的特異性引物來篩選慢生根瘤菌菌株的步驟。
[0087]在另一個(gè)方面，方法包括分離出選自以下的大豆慢生根瘤菌的培養(yǎng)物:
[0088]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50592的菌株(也保藏為NRRL B-59571)；
[0089]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50593的菌株(也保藏為NRRL B-59572)；
[0090]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50586的菌株(也保藏為NRRL B-59565)；
[0091]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50588的菌株(也保藏為NRRL B-59567)；
[0092]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50587的菌株(也保藏為NRRL B-59566)；
[0093]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50589的菌株(也保藏為NRRL B-59568)；
[0094]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50591的菌株(也保藏為NRRL B-59570)；
[0095]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50590的菌株(也保藏為NRRL B-59569)；
[0096]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50594的菌株(也保藏為NRRL B-50493)；
[0097]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50726的菌株；
[0098]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50727的菌株；
[0099]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50728的菌株；
[0100]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50729的菌株；和
[0101]具有保藏序列號(hào)NRRL B-50730的菌株，或至少兩種或更多種上述保藏菌株的組合，包含超過兩種，例如至少三種上述菌株、至少四種上述菌株、至少五種上述菌株、至少六種上述菌株、至少七種上述菌株、至少八種上述菌株、至少九種上述菌株、至少十種上述菌株、至少十一種上述菌株、至少十二種上述菌株、至少十三種上述菌株，最高包括所有上述菌株。
[0102]在另一個(gè)方面，方法包括分離出具有增強(qiáng)的溫度耐受性的細(xì)菌菌株。參見材料和方法:“溫度分布操作指南”。
[0103]此外，方法包括分離出具有天然的耐草甘膦的細(xì)菌菌株。參見材料和方法:“耐草甘膦情況操作指南?！?br> [0104]在另一個(gè)優(yōu)選方面，方法包括分離出選自能夠增強(qiáng)對(duì)豆科植物結(jié)瘤的根瘤菌屬和慢生根瘤菌屬中的細(xì)菌菌株。
[0105]鉬合物
[0106]本發(fā)明包括組合物，其含有至少一種本發(fā)明的分離細(xì)菌菌株或至少兩種或更多種上述保藏菌株的組合以及農(nóng)藝學(xué)上可接受的載體，菌株組合包括超過兩種，例如至少三種上述菌株、至少四種上述菌株、至少五種上述菌株、至少六種上述菌株、至少七種上述菌株、至少八種上述菌株、至少九種上述菌株、至少十種上述菌株、至少十一種上述菌株、至少十二種上述菌株、至少十三種上述菌株，最高包括所有上述菌株。
[0107]在一些實(shí)施方式中，組合物可以是接種物組合物。本文和本領(lǐng)域使用的術(shù)語“接種物組合物”通常是指，將相容的細(xì)菌菌株引至種子的外表面或引入犁溝內(nèi)的組合物或材料。[0108]組合物可以包含一種或更多種農(nóng)藝學(xué)上可接受的載體。在使用多個(gè)農(nóng)藝學(xué)上可接受的載體的實(shí)例中，農(nóng)藝學(xué)上可接受的載體可以是相同的或不同的。本文中與“載體”聯(lián)合使用的術(shù)語“農(nóng)藝學(xué)上可接受的”是指，任何能夠用于將活性物遞送至種子、土壤或植物的材料，優(yōu)選為能夠添加至(種子、土壤或植物)而對(duì)植物生長、土壤結(jié)構(gòu)、土壤排水等沒有不利作用的材料。適當(dāng)?shù)妮d體包括，但不限于，麥殼、糠、磨碎的麥秸、泥炭類粉末或顆粒、石膏類顆粒、和黏土 (例如，高嶺土、斑脫土、蒙脫石)。作為液體、泥炭、或可濕性粉劑的配方將適合于種子的涂覆。當(dāng)用于涂覆種子時(shí)，材料可以與水混合，施用于種子，且使其干燥。其他載體的實(shí)例包括弄濕的糠，在用粘合劑(例如，阿拉伯樹膠)涂覆之前，使其干燥，過篩，施用于種子。在活性物配方必需的實(shí)施方式中，農(nóng)藝學(xué)上可接受的載體可以是含水的。如果使用液體載體，液體(例如，水)載體將通常包含生長介質(zhì)，以培養(yǎng)細(xì)菌菌株。用于細(xì)菌菌株的合適生長介質(zhì)的非限制性實(shí)例包括甘露醇酵母提取物、丙三醇酵母提取物、或任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與細(xì)菌菌株相容和/或向細(xì)菌菌株提供生長營養(yǎng)素的介質(zhì)。
[0109]本發(fā)明的組合物也包括，含有一種或更多種信號(hào)分子的組合物。植物信號(hào)分子的非限制性實(shí)例包括結(jié)瘤因子(即，脂殼寡糖)、殼寡糖、殼質(zhì)化合物、黃酮類、茉莉酸或其衍生物、亞油酸或其衍生物、亞麻酸或其衍生物、煙中化合物(karrikin)或其組合。
[0110]脂殼寡糖化合物(LC0)，在本領(lǐng)域中也被稱為共生結(jié)瘤(Nod)信號(hào)或結(jié)瘤因子，由β -1, 4-連接的N-乙?；?D-葡萄糖胺(“GlcNAc”)殘基的寡糖骨架組成，在非還原端具有縮合的N-連接的脂肪酰鏈。LCO骨架中的GIcNAc殘基數(shù)目、脂肪酰鏈的長度和飽和度、以及還原和非還原糖殘基的取代將會(huì)不同。LCO的實(shí)例在以下呈現(xiàn)為式1:
[0111]
【權(quán)利要求】
1.一種大豆慢生根瘤菌的生物純的培養(yǎng)物,選自: 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50592的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50593的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50586的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50588的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50587的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50589的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50591的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50590的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50594的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50726的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50727的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50728的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50729的菌株；和 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50730的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述菌株能夠促進(jìn)植物中的氮固定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1~2中任意項(xiàng)所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述菌株在大致35°C的溫度耐受生長。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任意一項(xiàng)所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述菌株選自: 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50591的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50589的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50586的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL 50594的菌株；以及至少兩種或更多種菌株的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任意項(xiàng)所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述慢生根瘤菌菌株天然耐草甘膦。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述菌株選自: 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50590的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50594的菌株；以及至少兩種或更多種菌株的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6中任意項(xiàng)所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述菌株對(duì)于定殖植物具有增強(qiáng)的競爭力。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7中任意項(xiàng)所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述菌株在促進(jìn)植物生長方面具有增強(qiáng)的效力。
9.根據(jù)權(quán)利要求1~8中任意項(xiàng)所述的慢生根瘤菌菌株，其中增強(qiáng)的競爭力包括至少51%的占瘤率，例如至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98 %、至少99%、或100%的占瘤率。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~9中任意項(xiàng)所述的慢生根瘤菌菌株，其中在促進(jìn)植物生長方面的增強(qiáng)的效力包括:與市售可得菌株例如USDA532C相比時(shí)，以蒲式耳/英畝為單位測量的增加的植物產(chǎn)量、增加的果實(shí)數(shù)、增加的根數(shù)、增加的根長、增加的根質(zhì)量、增加的根體積、增加的葉面積、增加的植物占地面積、增加的植物強(qiáng)健度和/或增加的固氮(N2)能力中的至少一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求1~10中任意項(xiàng)所述的慢生根瘤菌菌株，其中在促進(jìn)大豆生長方面的增強(qiáng)的效力包括:當(dāng)大豆豆莢的總干重與市售可得菌株例如市售菌株USDA 532C的大豆植物上的大豆豆莢總干重相比時(shí)，該大豆植物上大豆豆莢總干重的增加。
12.—種組合物，包含大豆慢生根瘤菌的菌株和農(nóng)藝學(xué)上合適的載體，所述大豆慢生根瘤菌的菌株選自: 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50592的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50593的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50586的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50588的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50587的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50589的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50591的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50590的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50594的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50726的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50727的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50728的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50729的菌株； 具有保藏序列號(hào)NRRL B-50730的菌株；以及至少兩種或更多種菌株的組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述組合物包含一種或更多種信號(hào)分子。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述植物信號(hào)分子是脂殼寡糖、殼質(zhì)化合物、黃酮類或煙中化合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述植物信號(hào)分子是茉莉酸、亞油酸、亞麻酸或其衍生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求12~15中任意項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含至少一種農(nóng)藝學(xué)上有益的試劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述農(nóng)藝學(xué)上有益的試劑是至少一種磷酸鹽增溶微生物。
18.一種增強(qiáng)植物生長的方法，包括使用權(quán)利要求1~17中任意項(xiàng)所述的組合物來處理種子、幼苗、根系、植物、土壤或其組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述種子、幼苗、根系、或植物是豆科的。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述種子、幼苗、根系或植物是大豆種子、大豆幼苗、大豆根系或大豆植物。
21.根據(jù)權(quán)利要求18~20中任意項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物以每公頃IXIO8至I X IO13菌落形成單位、優(yōu)選為每公頃為2X IO11至6X IO11菌落形成單位的量施加至土壤。
22.根據(jù)權(quán)利要求18~21中任意項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物作為含有每個(gè)種子IX IO2至IX IO8菌落形成單位、優(yōu)選為IX IO4至IX IO5菌落形成單位的種子涂覆物而引入。
【文檔編號(hào)】A01N63/00GK103648284SQ201280017004
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月31日
【發(fā)明者】康耀衛(wèi), J·史密斯, S·西蒙斯, K·伍茲 申請人:諾維信生物股份有限公司