專利名稱：一種利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)不僅是一種植物快速繁殖的手段，同時(shí)也是植物改良、種質(zhì)保存和次生物質(zhì)生產(chǎn)的理想途徑。通常的植物組織培養(yǎng)需要經(jīng)歷愈傷組織-芽-小苗-生根的過(guò)程，如中國(guó)專利申請(qǐng)2008101469482公開(kāi)的落羽杉離體快速繁殖方法，其直接選用種子作為外植體，接著利用種子誘導(dǎo)不定芽，接著誘導(dǎo)生根培育壯苗，在誘導(dǎo)生根時(shí)直接選用了培養(yǎng)基。再如中國(guó)專利申請(qǐng)2005100298416公開(kāi)的一種蠶豆離體培養(yǎng)方法，其選用蠶豆種子培育出無(wú)菌種子苗，利用種子苗克隆3代群體后經(jīng)環(huán)境脅迫篩選后進(jìn)行誘導(dǎo)生根，誘導(dǎo)生根時(shí)也直接選用了培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)生根的過(guò)程中，如何優(yōu)化或篩選最優(yōu)的生根培養(yǎng)基是重要的，其直接影響組培苗的質(zhì)量和移栽成活率。以煙草組織培養(yǎng)為例。煙草組織培養(yǎng)快速繁殖成苗過(guò)程大致經(jīng)歷愈傷組織的形成、不定芽的誘導(dǎo)、不定芽生根成苗三個(gè)階段，其中不定芽的誘導(dǎo)生根直接影響組培苗的質(zhì)量和移栽成活率，是影響快速繁殖的重要環(huán)節(jié)，也是煙苗移栽成活和集約化育苗生產(chǎn)技術(shù)體系的關(guān)鍵技術(shù)。有關(guān)煙草組織培養(yǎng)已有不少報(bào)道，近年來(lái)在培養(yǎng)基的優(yōu)化、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞體系和原生質(zhì)體培養(yǎng)等方面也取得一些進(jìn)展。但是當(dāng)前誘導(dǎo)煙草組培苗生根過(guò)程中仍存在生根時(shí)間長(zhǎng)，根系活力低、移栽成活率低等諸多問(wèn)題，其中生根培養(yǎng)基是造成上述問(wèn)題的關(guān)鍵因素之一。同時(shí)，生根培養(yǎng)基的篩選工作繁瑣、周期長(zhǎng)、和試驗(yàn)材料的浪費(fèi)進(jìn)一步限制了生根培養(yǎng)基篩選過(guò)程及條件的優(yōu)化。為了優(yōu)化煙草組培苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基篩選方法，需要選擇合 適的生根材料和篩選方法，篩選出適合煙草不定芽生根條件的最佳培養(yǎng)基。目前，煙草組培苗生根培養(yǎng)基的篩選主要選用愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽作為生根鑒定材料，上述方法具有直接性，有效性、可靠性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但需要經(jīng)歷組培的前2個(gè)階段獲得鑒定材料才能開(kāi)展篩選，存在周期長(zhǎng)、程序復(fù)雜等缺點(diǎn)。而且，與上述現(xiàn)有技術(shù)相比，煙草種子十分小，僅有蠶豆或落羽杉種子的幾百分之一，其產(chǎn)生的無(wú)菌種子苗也非常小、通過(guò)去掉小苗的根后，小苗莖部對(duì)培養(yǎng)基十分敏感、須根據(jù)其對(duì)培養(yǎng)基的反應(yīng)程度和能否再次生根及其生根情況確定是否適合作為組培中不定芽的生根培養(yǎng)基。因此，研究一種利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法來(lái)解決這種技術(shù)問(wèn)題，一方面為縮短篩選生根培養(yǎng)基的時(shí)間和明確培養(yǎng)基因子對(duì)根系生長(zhǎng)的影響，另一方面簡(jiǎn)化篩選程序和節(jié)省試驗(yàn)材料。鑒于這種技術(shù)問(wèn)題，迫切需要形成一種工藝簡(jiǎn)單、節(jié)工省時(shí)、經(jīng)濟(jì)可靠，能夠有效縮短篩選周期、簡(jiǎn)化篩選程序、節(jié)省篩選材料的一種利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)，提供一種工藝簡(jiǎn)單、節(jié)工省時(shí)、經(jīng)濟(jì)可靠，能夠有效縮短篩選周期、簡(jiǎn)化篩選程序、節(jié)省篩選材料的一種利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法，其中，包括如下步驟A、消毒煙草種子的步驟；B、培育無(wú)菌種子苗的步驟；C、剪切無(wú)菌種子苗的步驟D、配置若干待選生根培養(yǎng)基的步驟；E、篩選最優(yōu)生根培養(yǎng)基的步驟。步驟A具體為選取籽粒飽滿的未包衣的煙草種子120 150粒置于培養(yǎng)皿中，加入經(jīng)質(zhì)量百分比濃度為75%乙醇浸泡30s，用無(wú)菌 水沖洗3次；再用質(zhì)量百分比濃度為O. 1% HgCl2溶液浸泡5 7min，再用無(wú)菌水沖洗4 5次，即獲取消毒的煙草種子。步驟B具體為用無(wú)菌鑷子將步驟A所得消毒的煙草種子接種于含蔗糖1. 5 3%、瓊脂O. 3
O.5%, pH5. 6 6. O培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，種子間距O. 5 O. 7cm，培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上表面距培養(yǎng)皿上蓋的距離控制在1. 2 1. 5cm，培養(yǎng)基在121 °C濕熱滅菌15_20min ;最后將接種好的培養(yǎng)皿置于25-28°C、12h光照/d、無(wú)菌環(huán)境中培養(yǎng)7 IOd ;得無(wú)菌種子苗，直至無(wú)菌種子苗的兩片子葉觸到培養(yǎng)皿上蓋。步驟C具體為無(wú)菌種子苗的兩片子葉觸到培養(yǎng)皿上蓋時(shí)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌剪刀沿?zé)o菌種子苗莖基部剪斷，使帶子葉部分長(zhǎng)度控制在1. O 1. 2cm,然后置于干燥無(wú)菌的濾紙上備用。步驟D具體為配制若干待選的生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)基硬度以無(wú)菌種子苗莖部能順利進(jìn)入為準(zhǔn)，然后分別裝入250mL的三角瓶中，每瓶50mL，在121 °C濕熱滅菌15 20min，滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)皿置于超凈工作臺(tái)令其冷卻凝固；用無(wú)菌水濕潤(rùn)無(wú)菌槍型鑷子頂部，然后用濕潤(rùn)后鑷子的頂部吸附無(wú)菌濾紙上的無(wú)菌種子苗綠色子葉，將其夾取到三角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的正中央，使無(wú)菌種子苗的莖1/3部分浸入培養(yǎng)基中，完成后用封口膜封口，于25 28°C、12h光照/d培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)14d以上。步驟E具體為根據(jù)煙苗根是否長(zhǎng)進(jìn)生根培養(yǎng)基中，以及生根培養(yǎng)基中根的長(zhǎng)度、數(shù)量、根系活力及干物質(zhì)積累量的情況，鑒定出適合于煙草的最佳生根培養(yǎng)基。步驟B中進(jìn)一步包括配置培養(yǎng)基的步驟以配置IL培養(yǎng)基為準(zhǔn)先在燒杯中放入蒸餾水，接著稱取20 30g蔗糖倒入燒杯，攪拌溶解，再加蒸餾水用量筒定溶至IL ;用ImoI/LHCL或ImoI/L NaOH調(diào)節(jié)ρΗ5·6
6.O ;然后稱取3 5g瓊脂粉(強(qiáng)度1300g/cm2)，倒入上述配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化，稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)皿中，再裝入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基上表面距培養(yǎng)皿上蓋的距離控制在1. 2 1. 5cm，接著放入消毒滅菌鍋滅菌，在121 °C濕熱滅菌15 20min，滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)皿置于超凈工作臺(tái)令其冷卻凝固。步驟D中配置的若干待選的生根培養(yǎng)基為1/2MS、1/2MS+0. 5g 活性炭、1/2MS+1. 5g 活性炭、1/2MS+2. 5g 活性炭、MS、MS+0. 5g活性炭、MS+L 5g活性炭、MS+2. 5g活性炭。步驟D中若干待選的生根培養(yǎng)基中進(jìn)一步添加有生長(zhǎng)激素ΝΑΑ0. 1-0. 3 (mg/L)。所述煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法在篩選其他植物的不定芽生根培養(yǎng)基中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為工藝簡(jiǎn)單、節(jié)工省時(shí)、經(jīng)濟(jì)可靠，能夠有效縮短篩選周期、簡(jiǎn)化篩選程序、節(jié)省篩選材料，具體為1、直接利用種子在培養(yǎng)皿中獲取無(wú)菌種子苗材料，直接進(jìn)入生根篩選階段，比常規(guī)篩選試驗(yàn)省略了培養(yǎng)不定芽的繁瑣，節(jié)省了人力、物力與時(shí)間。通常常規(guī)篩選試驗(yàn)需要嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)室條件和較大工作量。2、使用煙草無(wú)菌苗對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，可以與愈傷組織誘導(dǎo)同時(shí)開(kāi)展，并且在短時(shí)間內(nèi)可以完成大量培養(yǎng)基的篩選，在愈傷組織產(chǎn)生不定芽之前就能獲取最佳的生根培養(yǎng)基，加快了試驗(yàn)進(jìn)度。3、采用此種方法與不定芽篩選生根培養(yǎng)在誘導(dǎo)效果上表現(xiàn)一致。


圖1為本發(fā)明的篩選方法 的流程示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一、如圖1所示，為本發(fā)明的篩選方法的流程示意圖。其中，煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法，如下A、消毒煙草種子的步驟；B、培育無(wú)菌種子苗的步驟；C、剪切無(wú)菌種子苗的步驟D、配置若干待選生根培養(yǎng)基的步驟；E、篩選最優(yōu)生根培養(yǎng)基的步驟。步驟A具體為選取籽粒飽滿的未包衣的煙草種子150粒置于培養(yǎng)皿中，(選用凈葉黃煙種)加入經(jīng)質(zhì)量百分比濃度為75%乙醇浸泡30s，用無(wú)菌水沖洗3次；再用質(zhì)量百分比濃度為O. 1% HgCl2溶液浸泡7min，再用無(wú)菌水沖洗5次，即獲取消毒的煙草種子。步驟B具體為用無(wú)菌鑷子將步驟A所得消毒的煙草種子接種于含蔗糖3%、瓊脂
O.5%, pH6. O培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，種子間距O. 5cm，培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上表面距培養(yǎng)皿上蓋的距離控制在1. 2cm，培養(yǎng)基在121°C濕熱滅菌15min ;最后將接種好的培養(yǎng)皿置于28V、12h光照/d、無(wú)菌環(huán)境中培養(yǎng)IOd ;得無(wú)菌種子苗，直至無(wú)菌種子苗的兩片子葉觸到培養(yǎng)皿上蓋。步驟B中進(jìn)一步包括配置培養(yǎng)基的步驟以配置IL培養(yǎng)基為準(zhǔn)先在燒杯中放入蒸餾水，接著稱取30g蔗糖倒入燒杯，攪拌溶解，再加蒸餾水用量筒定溶至IL ;用lmol/LHCL或Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH6. O ;然后稱取5g瓊脂粉(強(qiáng)度1300g/cm2)，倒入上述配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化，稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)皿中，再裝入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基上表面距培養(yǎng)皿上蓋的距離控制在1. 2cm，接著放入消毒滅菌鍋滅菌，在121°C濕熱滅菌15min，滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)皿置于超凈工作臺(tái)令其冷卻凝固。步驟C具體為無(wú)菌種子苗的兩片子葉觸到培養(yǎng)皿上蓋時(shí)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌剪刀沿?zé)o菌種子苗莖基部剪斷，使帶子葉部分長(zhǎng)度控制在1. O 1. 2cm，然后置于干燥無(wú)菌的濾紙上備用。步驟D具體為配制若干待選的生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)基硬度以無(wú)菌種子苗莖部能順利進(jìn)入為準(zhǔn)，然后分別裝入250mL的三角瓶中，每瓶50mL，在121 °C濕熱滅菌15min，滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)皿置于超凈工作臺(tái)令其冷卻凝固；用無(wú)菌水濕潤(rùn)無(wú)菌槍型鑷子頂部，然后用濕潤(rùn)后鑷子的頂部吸附無(wú)菌濾紙上的無(wú)菌種子苗綠色子葉，將其夾取到三角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的正中央，使無(wú)菌種子苗的莖1/3部分浸入培養(yǎng)基中，完成后用封口膜封口，于25 28°〇、1211光照/(1培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)14d以上。步驟D中配置的若干待選的生根培養(yǎng)基為1/2MS、1/2MS+0. 5g 活性炭、1/2MS+1. 5g 活性炭、1/2MS+2. 5g 活性炭、MS、MS+0. 5g活性炭、MS+L 5g活性炭、MS+2. 5g活性炭。步驟D中若干待選的生根培養(yǎng)基中進(jìn)一步添加有生長(zhǎng)激素ΝΑΑ0. 1-0. 3 (mg/L)。步驟E具體為根據(jù)煙苗 根是否長(zhǎng)進(jìn)生根培養(yǎng)基中，以及生根培養(yǎng)基中根的長(zhǎng)度、數(shù)量及干物質(zhì)積累量的情況，鑒定出適合于煙草的最佳生根培養(yǎng)基。篩選結(jié)果如下表表I不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽生根的效果影響
權(quán)利要求
1.一種利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法，其特征在于，包括如下步驟 A、消毒煙草種子的步驟； B、培育無(wú)菌種子苗的步驟； C、剪切無(wú)菌種子苗的步驟 D、配置若干待選生根培養(yǎng)基的步驟； E、篩選最優(yōu)生根培養(yǎng)基的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法，其特征在于，步驟A具體為 選取籽粒飽滿的未包衣的煙草種子120 150粒置于培養(yǎng)皿中，加入經(jīng)質(zhì)量百分比濃度為75 %乙醇浸泡30s，用無(wú)菌水沖洗3次；再用質(zhì)量百分比濃度為O. 1% HgCl2溶液浸泡5 7min，再用無(wú)菌水沖洗4 5次，即獲取消毒的煙草種子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法，其特征在于，步驟B具體為 用無(wú)菌鑷子將步驟A所得消毒的煙草種子接種于含蔗糖1. 5 3%、瓊脂O. 3 O. 5%、pH5. 6 6. O培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，種子間距O. 5 O. 7cm，培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上表面距培養(yǎng)皿上蓋的距離控制在1. 2 1. 5cm，培養(yǎng)基在121 °C濕熱滅菌15_20min ;最后將接種好的培養(yǎng)皿置于25-28°C、12h光照/d、無(wú)菌環(huán)境中培養(yǎng)7 IOd ;得無(wú)菌種子苗，直至無(wú)菌種子苗的兩片子葉觸到培養(yǎng)皿上蓋。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法，其特征在于，步驟C具體為 無(wú)菌種子苗的兩片子葉觸到培養(yǎng)皿上蓋時(shí)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌剪刀沿?zé)o菌種子苗莖基部剪斷，使帶子葉部分長(zhǎng)度控制在1. O 1. 2cm，然后置于干燥無(wú)菌的濾紙上備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法，其特征在于，步驟D具體為 配制若干待選的生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)基硬度以無(wú)菌種子苗莖部能順利進(jìn)入為準(zhǔn)，然后分別裝入250mL的三角瓶中，每瓶50mL，在121°C濕熱滅菌15 20min，滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)皿置于超凈工作臺(tái)令其冷卻凝固；用無(wú)菌水濕潤(rùn)無(wú)菌槍型鑷子頂部，然后用濕潤(rùn)后鑷子的頂部吸附無(wú)菌濾紙上的無(wú)菌種子苗綠色子葉，將其夾取到三角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的正中央，使無(wú)菌種子苗的莖1/3部分浸入培養(yǎng)基中，完成后用封口膜封口，于25 28°C、12h光照/d培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)14d以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法，其特征在于，步驟E具體為 根據(jù)煙苗根是否長(zhǎng)進(jìn)生根培養(yǎng)基中，以及生根培養(yǎng)基中根的長(zhǎng)度、數(shù)量、根系活力及干物質(zhì)積累量的情況，鑒定出適合于煙草的最佳生根培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法，其特征在于，步驟B中進(jìn)一步包括配置培養(yǎng)基的步驟 以配置IL培養(yǎng)基為準(zhǔn)先在燒杯中放入蒸餾水，接著稱取20 30g蔗糖倒入燒杯，攪拌溶解，再加蒸餾水用量筒定溶至IL ;用lmol/LHCL或lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH5. 6 6. O ;然后稱取3 5g瓊脂粉(強(qiáng)度1300g/cm2)，倒入上述配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化，稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)皿中，再裝入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基上表面距培養(yǎng)皿上蓋的距離控制在1. 2 1. 5cm,接著放入消毒滅菌鍋滅菌,在121 °C濕熱滅菌15 20min,滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)皿置于超凈工作臺(tái)令其冷卻凝固。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法，其特征在于，步驟D中配置的若干待選的生根培養(yǎng)基為 1/2MS、1/2MS+0. 5g 活性炭、1/2MS+1. 5g 活性炭、1/2MS+2. 5g 活性炭、MS、MS+O. 5g 活性炭、MS+1. 5g活性炭、MS+2. 5g活性炭。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法，其特征在于，步驟D中若干待選的生根培養(yǎng)基中進(jìn)一步添加有生長(zhǎng)激素NAAO. 1-0. 3 (mg/L)。
10.一種如權(quán)利要求1-9任一所述煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法在篩選其他植物的不定芽生根培養(yǎng)基中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用煙草無(wú)菌種子苗篩選生根培養(yǎng)基的方法，其中，包括如下步驟A、消毒煙草種子的步驟；B、培育無(wú)菌種子苗的步驟；C、剪切無(wú)菌種子苗的步驟D、配置若干待選生根培養(yǎng)基的步驟；E、篩選最優(yōu)生根培養(yǎng)基的步驟。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、節(jié)工省時(shí)、經(jīng)濟(jì)可靠，能夠有效縮短篩選周期、簡(jiǎn)化篩選程序、節(jié)省篩選材料，直接利用種子在培養(yǎng)皿中獲取無(wú)菌種子苗材料，直接進(jìn)入生根篩選階段，比常規(guī)篩選試驗(yàn)省略了培養(yǎng)不定芽的繁瑣，節(jié)省了人力、物力與時(shí)間。且使用煙草無(wú)菌苗對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，可以與愈傷組織誘導(dǎo)同時(shí)開(kāi)展，加快了試驗(yàn)進(jìn)度。此外，采用此種方法與不定芽篩選生根培養(yǎng)在誘導(dǎo)效果上表現(xiàn)一致。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103053419SQ20121059714
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者張建慧, 殷英, 余祥文, 屈建康, 趙宇, 廖華, 李方樓, 徐偉 申請(qǐng)人:四川省煙草技術(shù)中心