專利名稱：一種水稻根毛伸長(zhǎng)控制基因ksrh1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種圖位克隆技術(shù)克隆的水稻KSRHl (.Kasalath Short Root Hair 2 )基因的 cDNA 序列，該 cDNA 編碼的蛋白屬于 NADPH氧化酶，以及轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)功能試驗(yàn)鑒定該基因。
背景技術(shù)：
根毛作為植物根系的重要組成部分，是根系特化的表皮細(xì)胞外伸形成的管狀突出物，它可有效擴(kuò)大表皮細(xì)胞與根際土壤的接觸面積，有利于提高根系吸收土壤中水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的效率以及與土壤微生物的互作(Gilroy and Jones, 2000)。根毛中含有參與營(yíng)養(yǎng)吸收的酶類和養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)體，它對(duì)養(yǎng)分的吸收功能一直是植物營(yíng)養(yǎng)、生理和農(nóng)學(xué)專家的研究重點(diǎn)。土壤干旱所引起的根的形態(tài)和生理反應(yīng)，首先就是根毛萎蔫、枯死，吸收活性降低，這是干 旱造成作物減產(chǎn)的主要原因之一。同吋，由于根毛細(xì)小，其周圍更易產(chǎn)生較大的濃度梯度，對(duì)那些在土壤中濃度低、移動(dòng)性小、靠擴(kuò)散作用向根表供應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)元素(如磷、鉀、微量元素等)的吸收尤為重要(Vance et al. , 2003; Hill et al. , 2010)?；钚匝?ROS)參與植物根毛細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)。ROS的主要來(lái)源是NADPH氧化酶，植物NADPH 氧化酶被稱為Rboh (respiratory burst oxidase homologue),缺乏NADPH氧化酶的擬南芥突變體rAぬ的根系和根毛都非常短小，而且鈣離子攝入缺陷，F(xiàn)oreman等在研究該突變體時(shí)發(fā)現(xiàn)，在野生型植株的根系中抑制NAPDH氧化酶的活性可抑制ROS的積 累及根毛的伸長(zhǎng)，這與rAぬ突變體的表型是一致的。反過(guò)來(lái)將ROS加入到rAぬ突變植株中促進(jìn)了根毛的生長(zhǎng)，并且在這些植株的根系中同時(shí)發(fā)生了鈣離子的攝入增加。胞外ATP調(diào)節(jié)質(zhì)膜NADPH氧化酶AtrbohC產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致質(zhì)膜Ca2+離子通道激活，從而使胞液自由Ca2+離子濃度上升，進(jìn)而調(diào)節(jié)根毛的生(Demidchik et al.，2009)。關(guān)于水稻NAPDH氧化酶對(duì)根毛發(fā)育的調(diào)控機(jī)制目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。Plant extracellular ATP signalling by plasma membrane NADPH oxidaseand Ca2+ channels. Plant J. 2009, 158(6): 963-13
Foreman J, Demidchik V, Bothwe丄I J, et al. Reactive oxygen species producedby NADPH oxidase regulate plant cell growth. Nature 2003, 422(6930): 442-6Gilroy, S. and Jones, D.L. Through form to function: root hair developmentand nutrient uptake. Trends Plant Sci, 2000, 5: 56-60.
Hill J 0, Simpson R J, Ryan M H, et al. Root hair morphology and mycorrhizacolonisation of pasture species in response to phosphorus and nitrogennutrition[J], Crop & Pasture Sci, 2010，61(2):122 - 131. doi:10. 1071/CP09217Vance, C. P. , Uhde-Stone, C. , and Allan, D. L. Phosphorus acquisition and use critical adaptations by plants for securing a nonrenewable resource.New Phytol,2003， 157: 423-447.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種水稻根毛伸長(zhǎng)控制基因^STtH/及其編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白屬NADPH氧化酶，在氨基酸取代或缺失等情況下，能抑制水稻根毛的伸長(zhǎng)，使水稻出現(xiàn)短根毛現(xiàn)象，可以為水稻的根系改良和雜交育種或轉(zhuǎn)基因植物的開(kāi)發(fā)創(chuàng)造條件。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種水稻根毛伸長(zhǎng)控制基因^STtH/編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO :2所不的氣基酸序列。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種改進(jìn)了的蛋白質(zhì)，為氨基酸序列還包括在SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失ー個(gè)或多個(gè)氨基酸生成的衍生物。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種編碼上述蛋白的基因，其具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種改進(jìn)了的基因，為核苷酸序列還包括在SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失ー個(gè)或多個(gè)核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。 本發(fā)明還同時(shí)提供了包含上述核酸的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。本發(fā)明還同時(shí)提供了ー種對(duì)水稻根毛進(jìn)行改造的方法，包括用上述基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。本發(fā)明的蛋白是ー個(gè)NADPH氧化酶。本發(fā)明的目的是提供ー種從水稻根毛突變體中克隆的新基因心TtH/，如SEQID NO 1所示的ORF序列，也包括與SEQ ID NO 1所示的ORF序列至少有80%同源性的基因序列。本發(fā)明中的SEQ ID NO :2所示的蛋白質(zhì)屬于NADPH氧化酶，其中進(jìn)行ー個(gè)或幾個(gè)替換，插入或缺失所獲得的功能類似物。另外，也包括在SEQ ID NO :1中添加、取代、插入或缺失ー個(gè)或多個(gè)核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達(dá)到本發(fā)明的目的。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供ー種用KSRHl基因進(jìn)行高效的植物轉(zhuǎn)化的方法，具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO :1所示的序列的基因片段的載體。本發(fā)明還提供ー種利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞提高水稻根毛發(fā)生能力的方法。


圖I是7天苗齡的水稻短根毛突變體^與野生型Kasalath表型。圖I中A為全株表型；B為主根在體視鏡下的觀察結(jié)果；C為根毛在顯微鏡下的觀
察結(jié)果。圖2良KSRHl基因在水稻第I條染色體上的定位圖。圖3是功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)T1代轉(zhuǎn)基因水稻根毛的表型和RT-PCR、Southern雜交檢測(cè)圖。圖3中A為野生型和突變體轉(zhuǎn)35STf57tH/載體的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因回復(fù)株系(0V1和0V2)的主根在體視鏡下的觀察結(jié)果；B為野生型和突變體轉(zhuǎn)HKSRHl載體的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因回復(fù)株系(0V1和0V2)的葉片cDNA的RT-PCR分析；C為為野生型和突變體
轉(zhuǎn)HKSRHl載體的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因回復(fù)株系(0V1和0V2)用歷idIII酶切后的Southern雜交圖。圖4是KSRHl基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證用遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1300改的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式 以下結(jié)合附圖、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)描述。實(shí)施例I 突變體的表型及遺傳分析
從 EMS (ethyl methylsulfonate)誘變的秈稻(處ァ幼 Sativa L. ssp iflt/ica)品種Kasalath突變體庫(kù)中篩選到一個(gè)水稻短根突變體。觀察7天苗齡的突變體和野生型的地上部、根部(包括主根、不定根及側(cè)根)表型，在體視鏡下觀察發(fā)現(xiàn)左的根毛能正常發(fā)生，但是不能伸長(zhǎng)，除了根毛缺陷，其他性狀與野生型相比沒(méi)有顯著性的差異(圖I)。以突變體突變體為父本，與野生型Kasalath雜交，獲得子一代F1植株與野生型Kasalath完全一致，說(shuō)明ksrhl為隱性突變。F1代自花授粉所得的F2中，正常植株與短根植株的分離比為147/53=2. 77，卡方檢測(cè)結(jié)果為0. 24 < X 20 05, 1=3. 84，正常植株與短根植株的比例符合ー對(duì)基因控制的3 1分離比，表明該突變體是隱性單基因突變體，命名該基因?yàn)樾?( /。 實(shí)施例2んSTtH/基因的獲得
遺傳分析證明該左突變是單基因隱性突變。利用圖位克隆技術(shù)，通過(guò)配置的秈粳交F2群體，HKSRHl基因。圖位克隆(map-basedcloning),又稱定位克隆(positional cloning), 1986年首先由劍橋大學(xué)的Coulson提出。該方法可以在基因產(chǎn)物未知的情況下，根據(jù)功能基因在基因組中的位置進(jìn)行的，在利用分離群體的遺傳連鎖分析或染色體異常將基因定位到染色體的I個(gè)具體位置的基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建高密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，不斷縮小候選區(qū)域進(jìn)而克隆該基因。DKSRHl的初步定位
將突變體^和粳稻Nipponbare進(jìn)行雜交并獲得了 F2群體,利用混合分離分析法(Bulked Segregant Analysis,BSA)進(jìn)行^STtH/基因的初步定位。從F2分離群體中隨機(jī)選擇30株具有典型突變性狀的植株提取DNA，然后取等量DNA混合構(gòu)建ー個(gè)突變池。以突變池為模板，兩親本和F1 DNA為對(duì)照，用12條染色體上均勻分布的116對(duì)有多態(tài)的SSR標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)I號(hào)染色體上的分子標(biāo)記RM5389與突變位點(diǎn)在位置上具有明顯的連鎖性。根據(jù)Nipponbare和9311的基因組序列差異，在RM5389附近發(fā)展了新的STS標(biāo)記，其中，S3616在兩親本基因組DNA間檢測(cè)到多態(tài)性，且其交換單株與RM5389的不同。因此，推斷突變基因可能位于標(biāo)記RM5389和S3616之間的區(qū)域，物理距離約為435kb。
表I用于定位的分子標(biāo)記序列
標(biāo)記引物序列(5’-3’)產(chǎn)物大小
Marker_Primer sequence (5 ~3 )_Product size in
Nipponpare/bp
RM5389 F TCTTGCATGAGAGCCAACAC132R
GCTATTGCGCGAGATTATCC
S3616 F CCATTTGCACCTGCATGC84 R
GCAAAGTGATCTCGCCTTG
S3576 F AACGTATGCAGTCTGCAT99 R GTTTGGTGTCAGTATGTAG
S3578 F AGTGGAGTGTGAATGAAT93 R
CGGATCGAATCGAATCAT
S3585 F TCCTCCCTTCTCGTTGAC103 R
GTGAACGAGAACGACGAG
2)KSRHl精細(xì)定位
進(jìn)ー步擴(kuò)大突變體和粳稻Nipponbare的雜交組合,獲得了包含1335株突變單株的F2分離群體，在RM5389和S3616之間又發(fā)展3個(gè)有多態(tài)性的分子標(biāo)記對(duì)該基因進(jìn)行了精細(xì)定位。結(jié)果S3576和S3578檢測(cè)到I個(gè)交換單株，S3585檢測(cè)到5個(gè)交換單株，通 過(guò)比較交換單株發(fā)現(xiàn)，S3576和S3578的I個(gè)交換單株相同，與S3585都不相同。綜上結(jié)果表明KSRHl基因最終被限定在水稻I號(hào)染色體P0506B12 BAC的STS標(biāo)記S3578和S3585之間，這兩個(gè)標(biāo)記之間的物理距離約67kb(圖2)。利用水稻基因組注解數(shù)據(jù)庫(kù)RiceGAAS(http://ricegaas. dna. affrc. go. jp/rgadb/)分析表明，67kb 區(qū)域內(nèi)共有 11 個(gè)基因，分別為預(yù)測(cè)蛋白3個(gè)，未知蛋白3個(gè)，NADPH氧化酶基因I個(gè)，AT-hook家族基因I個(gè)，C0NSTANS(CO)-Iike鋅指蛋白基因I個(gè)，激酶互作蛋白家族基因I個(gè)，SAC3/GANP家族基因I個(gè)。3)KSRHl基因的確定
通過(guò)上述的基因精細(xì)定位及生物信息學(xué)方面的分析，目的基因鎖定為NADPH氧化酶基因。利用DNA序列測(cè)定的方法，分別將突變體基因組DNA和野生型基因組DNA中的NADPH氧化酶基因進(jìn)行了序列分析，結(jié)果表明在該基因的第9個(gè)外顯子上有一個(gè)堿基發(fā)生了由G變成A的替換，從而導(dǎo)致該蛋白的第676個(gè)氨基酸發(fā)生了變化，由絲氨酸(Ser )變成了天冬氨酸(Asp)。因此，將NADPH氧化酶基因確定為目標(biāo)基因，命名為必TtH/。利用水稻基因組注解數(shù)據(jù)庫(kù)RiceGAAS信息表明，該基因從起始密碼子到終止密碼子的基因組全長(zhǎng)為4169bp，共有13個(gè)外顯子，12個(gè)內(nèi)含子，mRNA全長(zhǎng)為2532bp，共編碼843個(gè)氨基酸。A)KSRHl基因全長(zhǎng)ORF的獲得
水稻kasalash葉片總RNA的提取采用上海生エRNA提取試劑盒(SK1321 )，以O(shè)ligo (dt)-18為引物，以所提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以此cDNA 為模板，用引物 primer I (5，- TCTCCCTCTCCCCTTCTCATC -3，)和 primer 2 (5，-CCCAATGCTATCGTATTTCTT -3’ )進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下
反應(yīng)體積20ul，其中含有
模板(cDNA)Iul (2ng)
primer I 和 primer 2終濃度各 0. 2 u M
dNTP終濃度各200 u M
LA Taq DNA 聚合酶IU
10*Taq DNA聚合酶緩沖液 2 U I 用雙蒸水補(bǔ)足至20 ill體積。反應(yīng)程序如下
940C，變性5分鐘；然后94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸2. 5分鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后在72°C下延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒(BBI，BS354)按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行純化，然后與口]\ 19-1'載體(131^1^，010認(rèn))在16°C下連接8小時(shí)，構(gòu)建重組載體pMDlOT-^STffi/。42°C熱激90秒將重組載體pMD19TTf57tH/轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，轉(zhuǎn)化物在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，挑取克隆，提取質(zhì)粒，送交上海生エ測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增到的片段的核苷酸序列如序列表I所示，將該片段命名為^STffi/，全長(zhǎng)2532bp，其編碼的氨基酸序列見(jiàn)序列表中序列2。實(shí)施例3 KSRHl功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn) 互補(bǔ)表達(dá)載體HKSRHl的構(gòu)建
用Trizol法提取水稻kasalash葉片總RNA,以O(shè)ligo (dt)_18為引物，以所提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以此cDNA為模板，用引物primer 3 (5’- AAAGAGCTCGGCATTGCGTGTTCCGGGATG-3’,下劃線為 Sac I 識(shí)別位點(diǎn))，primer 4 (5，- AAAGTCGACTTTAGACGTCCTTTGGTACGG-3 ’，下劃線為Sal I識(shí)別位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件和反應(yīng)程序如實(shí)施例2。擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒純化后與pMD19-T Simple載體在16°C下連接8 小時(shí)，構(gòu)建重組載體pMD19TSTf57tH/。42°C熱激90秒將重組載體pMDIOTS-ISTtH/轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，轉(zhuǎn)化物在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，挑取克隆，提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的pMD19TSTf57tH/質(zhì)粒用Sac I/Sal I雙酶切，回收2574bp片段，將該片段連接到用Sacl/Sall雙酶切的pCAMBIA1300改(以pCAMBIA1300為出發(fā)載體，在多克隆位點(diǎn)插入35S啟動(dòng)子和Nos終止子而得到的增強(qiáng)表達(dá)載體，圖4)載體上，即構(gòu)建成了互補(bǔ)表達(dá)載體，命名為HKSRHしI)功能互補(bǔ)
互補(bǔ)表達(dá)載體HKSRHl和pCAMBIA1300改載體(空載體)通過(guò)電擊的方法分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105中，利用農(nóng)桿菌的介導(dǎo)法分別將35STf57tH/和空載體轉(zhuǎn)入短根毛突變體中。轉(zhuǎn)化的具體方法如下將突變體成熟胚種子脫殼滅菌，接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10天后，挑選生長(zhǎng)旺盛，顔色淺黃，比較松散的胚性愈傷組織用作轉(zhuǎn)化的受體，用含有HKSRHl和空載體質(zhì)粒的EHA105菌株分別水稻愈傷組織；在黑暗處25°C培養(yǎng)3天后，在含有50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織，將潮霉素抗性愈傷組織在分化培養(yǎng)基中成苗后做生根培養(yǎng)，觀察根毛的恢復(fù)情況。KSRHl功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)HKSRHl載體的水稻65株中有42株恢復(fù)短根毛表型為野生型表型，而轉(zhuǎn)空載體的水稻53株中沒(méi)有一株恢復(fù)短根毛表型為野生型表型，為了檢測(cè)根毛得到回復(fù)的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株是否超表達(dá)了^基因，采用Trizol法分別提取Kasalath和2個(gè)轉(zhuǎn)基因回復(fù)株系葉片的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。半定量反應(yīng)時(shí)，各樣品的cDNA模板量先通過(guò)OsActin基因的表達(dá)量調(diào)成一致(擴(kuò)增條件58°C，26個(gè)循環(huán))，再擴(kuò)增目的基因。目的基因的上游引物序列(5’ -3’ )為CTCGCCTACGTCCTCCT ;下游引物序列(5，-3’)為CGCCACAACTGTAGITTCAAG。目的基因長(zhǎng)度為450bp，擴(kuò)增條件為55°C，28個(gè)循環(huán)。半定量RT-PCR結(jié)果如圖3B。為了檢測(cè)這兩個(gè)回復(fù)的轉(zhuǎn)基因株系是不是獨(dú)立株系，進(jìn)行了 Southern雜交檢測(cè)，剪取葉片按CTAB法提取總DNA，分別用Hindlll酶切后，進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用600bp潮霉素基因片段作為探針，使用Roche公司的DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit II試劑盒進(jìn)行探針的標(biāo)記和雜交檢測(cè)。結(jié)果如圖3C。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)
明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容
直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種水稻根毛伸長(zhǎng)控制基因^STffi/編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述氨基酸序列還包括在SEQID NO2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失ー個(gè)或多個(gè)氨基酸生成的衍生物。
3.ー種編碼權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)的基因，其特征在于，其具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，所述核苷酸序列還包·括在SEQID N0:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失ー個(gè)或多個(gè)核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
5.ー種包含權(quán)利要求3或4所述核酸的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
6.ー種對(duì)水稻根毛進(jìn)行改造的方法，其特征在于包含權(quán)利要求3或4所述的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻根毛伸長(zhǎng)控制基因KSRH1編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了編碼上述蛋白質(zhì)的基因，其具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了一種對(duì)水稻根毛進(jìn)行改造的方法，包括用上述基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。
文檔編號(hào)A01H5/06GK102796711SQ20121030227
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者丁沃娜, 朱世華, 史俊穎 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)