專利名稱：正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及共生微生物培養(yǎng)的技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法。
背景技術(shù)：
菌根型食用菌指一些在其自身的生活史中，必須依賴于一些活的樹木根系，并與樹木根系形成共生關(guān)系的一類食用菌。菌根食用菌與樹木根系之間的 營養(yǎng)生理過程首先形成共生體-菌根，才能完成物質(zhì)交換的相互依賴關(guān)系。我國已知的567年野生食用菌資源中，屬于菌根型食用菌的資源就已知有352種，約占國產(chǎn)食用菌資源總量的53. 6%。許多種類的菌根型食用菌都具有較高的經(jīng)濟和營養(yǎng)，同時它們對森林的持續(xù)發(fā)展也具有重要的意義。正紅菇是目前僅知分布在中國部分地區(qū)的紅菇屬新種，是一種與殼斗科樹種共生的菌根型食用菌。正紅菇具養(yǎng)血、逐瘀、祛風，主治血虛萎黃、產(chǎn)后惡露不盡、關(guān)節(jié)酸痛等功能，它不僅美味，更是營養(yǎng)保健的野生菇，在中國及東南亞部分地區(qū)深受人們喜愛。由于其獨特的營養(yǎng)價值和保健功能，正紅菇的價值甚至超過世界某種的松茸、美味牛肝菌和松乳菇。正紅菇做為一種珍貴的藥食兩用菌，不僅具有良好的色澤和風味，并且具有增強機體免疫力、補血、降低血液膽固醇等藥用功能。近年來，隨著生活水平的提高，人們的飲食要求已經(jīng)由原來的滿足溫飽轉(zhuǎn)變?yōu)樽非蠼】岛统缟刑烊弧＿@無疑為開發(fā)利用紅菇資源提供了廣闊的市場前景。菌根菌普遍都較難分離培養(yǎng)，亦較難保存，目前國際上菌根菌一般每隔3個月左右轉(zhuǎn)管一次，且菌種的活性也易退化。目前,正紅燕菌絲體分離培養(yǎng)一般取材于子實體的燕蓋或燕柄的菌肉，分離培養(yǎng)所取的子實體均為未成熟或有7分成熟，菌傘均未打開，分離成功的概率較少或幾乎沒有萌發(fā)；分離所用的子實體材料均用升汞溶液或酒精進行表面消毒；分離培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基均為PDA培養(yǎng)基或改良的PDA培養(yǎng)基；正紅菇分離培養(yǎng)、純化及保存均采用PDA培養(yǎng)基，試管種的活性一般為3個月(黃年來等，2010 ;陳旭健等，2005 ;陳少珍等，2004)。從事食用菌研究的科研人員，普遍都深感正紅菇的分離培養(yǎng)萌發(fā)率低，純化成功率低，菌種保存時間較難持久，菌種的活性消失較快。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，有必要提供一種分離培養(yǎng)成功率高、菌種保存時間長、活性持久的正紅菇菌根型食用菌分離培養(yǎng)保存方法。一種正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法，包括以下步驟a、摘采正開傘的成熟正紅菇子實體；b、在無菌條件下取步驟a中正紅菇子實體菌柄與菌蓋交接處的菌褶部分的組織塊，放入含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA固體培養(yǎng)基中，室溫、避光培養(yǎng)3 5天，萌發(fā)得到菌絲體；C、在無菌條件下將步驟b中的菌絲體放入含乳糖的改良MN固體培養(yǎng)基中，室溫、避光培養(yǎng) 5 7天，純化菌絲體；d、在無菌條件下，將步驟c中純化的菌絲體轉(zhuǎn)接入具膠蓋的試管中，25 30°C、避光培養(yǎng)5 7天，所述試管中裝有由步驟b所述的含乳糖、維生素BI和葉酸的改良PDA培養(yǎng)基和步驟c所述的含乳糖的改良MN培養(yǎng)基組成的混合培養(yǎng)基；e、將步驟d中無污染的試管置于10 15°C保存。在其中一些實施例中，步驟b的培養(yǎng)基中所述乳糖的濃度為4 6g/L。在其中一些實施例中，步驟c的培養(yǎng)基中所述乳糖的濃度為0. 5 I. 5g/L。在其中一些實施例中，步驟d中所述含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA培養(yǎng)基與含乳糖的改良麗培養(yǎng)基的體積比為I : I 2 : I。在其中一個實施例中，步驟d中所述含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA培養(yǎng)基與含乳糖的改良麗培養(yǎng)基的體積比為2 I。在其中一個實施例中，步驟e中所述試管與膠蓋之間的銜接口用保鮮膜封包。本發(fā)明正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法，組織塊菌絲體的萌發(fā)率高達50%以上，菌種保存時間一次分轉(zhuǎn)可達I年，菌種活性持續(xù)3年不退化。本發(fā)明方法不需要消毒子實體，配制培養(yǎng)基所用試劑均是常用品，整個操作過程較簡練，使正紅菇菌根食用菌的菌種分離培養(yǎng)保存方法簡便化，為菌根食用菌行業(yè)提供了新的操作方法和技術(shù)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。實施例I一種正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法，其步驟如下(I)配制含葉酸、維生素B1和乳糖的改良PDA培養(yǎng)基。改良PDA培養(yǎng)基的成分是馬鈴薯汁200g/L，葡萄糖20g/L，乳糖5g/L，葉酸50 u g/L、維生素 B1IOO u g/L，瓊脂粉 8g/L。(2)將步驟(I)配制好的培養(yǎng)基裝入三角瓶中于121°C滅菌20分鐘，取出待溫度降至50°C左右，在潔凈工作臺下，按30ml/皿裝入無菌培養(yǎng)皿(2 X 9cm)中，置工作臺中冷卻成平板固體培養(yǎng)基，待用。(3)在潔凈工作臺下，用無菌鑷子取一小塊正紅菇剛開傘子實體菌柄與菌蓋交接處的菌褶塊，迅速放入步驟(2)備好的培養(yǎng)皿中，菌褶塊在培養(yǎng)皿中呈三角形擺放，用寬3cm的保鮮膜封包培養(yǎng)皿套口。(4)將培養(yǎng)皿置于25_35°C的溫室條件下，遮光培養(yǎng)3天，萌發(fā)得到菌絲體，菌絲體的萌發(fā)率為52%。(5)配制含乳糖I g/L的改良麗固體培養(yǎng)基。配方為=CaCl20. 05g/L, NaCl 0. 025g/L, KH2PO4 0. 5g/L, (NH4) HPO4 0. 25g/L,MgSO4 7H20 0. 15g/L，DETA-Fe3 0. 02g/L,維生素 B1 100 u g/L,葡萄糖 2. 5g/L，麥芽糊精3.Og/L，乳糖 lg/L，瓊脂粉 8. 5g/L。(6)將步驟(5)配制好的培養(yǎng)基按步驟(2)進行裝瓶滅菌備用。(7)步驟(4)培養(yǎng)3天后，挑取一小塊萌發(fā)的菌絲體轉(zhuǎn)入步驟￠)的培養(yǎng)皿中，操作方法同步驟(3)。(8)將培養(yǎng)皿置于25_35°C的溫室條件下，遮光培養(yǎng)I天，純化菌絲體。(9)將步驟⑴和步驟(5)配制好的兩種培養(yǎng)基按2 I的比例混合，使其溶化成液體，按9ml/管裝入試管(1.8X7cm)中，用塑膠蓋擰緊試管口，將試管置于121°C滅菌20分鐘，取出斜置冷卻至室溫，試管中的培養(yǎng)基成固體斜面狀。(10)將步驟(8)培養(yǎng)7天后純化的菌絲體挑一小塊放入步驟(9)的試管中，用塑膠蓋擰緊試管口，于25-35°C的溫室條件下，遮光培養(yǎng)7天。 (11)培養(yǎng)7天后，挑選沒有污染的試管種用寬Icm的保鮮膜封包塑膠蓋與試管的銜接口，于10-15°C溫度條件保存。采用實施例I的條件，正紅菇菌種分離成功率達52%，純化率達80%，菌種保存12個月后試管內(nèi)的培養(yǎng)基基本保持原樣，菌種活性達90% ;保存24個月后試管內(nèi)的培養(yǎng)基減少10%，菌種活性達80 %。實施例2除了步驟⑴的培養(yǎng)基中乳糖的濃度為4g/L，步驟(5)的培養(yǎng)基中乳糖的濃度為
0.5g/L，步驟(9)中兩種培養(yǎng)基按I : I的比例混合外，其他操作均與實施例I相同。采用實施例2的條件，正紅菇菌種分離成功率達40 %，純化率達60 %，菌種保存12個月后試管內(nèi)的培養(yǎng)基基本保持原樣，菌種活性達70% ;保存24個月后試管內(nèi)的培養(yǎng)基減少9%，菌種活性達50%。實施例3除了步驟⑴的培養(yǎng)基中乳糖的濃度為6g/L，步驟(5)的培養(yǎng)基中乳糖的濃度為1.5g/L，步驟(9)中兩種培養(yǎng)基按I : I的比例混合外，其他操作均與實施例I相同。采用實施例3的條件，正紅菇菌種分離成功率達50 %，純化率達50 %，菌種保存12個月后試管內(nèi)的培養(yǎng)基減少10%，菌種活性達80% ;保存24個月后試管內(nèi)的培養(yǎng)基減少20%，菌種活性達70 %。實施例4除了步驟(3)中挑取一小塊正紅菇未開傘子實體菌柄與菌蓋接種處的菌褶塊外，其他操作均與實施例I相同。采用實施例4的條件下做了 6個菌株分離培養(yǎng)，每個菌株采用10個培養(yǎng)皿共挑取30小塊進行試驗，分離成功率只達8. 3%。實施例5除了步驟(5)中所用培養(yǎng)基為步驟⑴的培養(yǎng)基外，其他操作均與實施例I相同。采用實施例5的條件下做了 6個菌株純化培養(yǎng)，每個菌株采用10個培養(yǎng)皿共挑取30小塊進行試驗，分離成功率只達33. 3%。實施例6除了步驟(9)中所用培養(yǎng)基為步驟(I)的培養(yǎng)基外，其他操作均與實施例I相同。采用實施例6的條件下做了 6個菌株的保存試驗，每個菌株有7支試管種，保存6個月后菌種活性達60%，且分轉(zhuǎn)污染率較高，明顯菌種活性退化。實施例7除了步驟(11)中沒用用寬Icm的保鮮膜封包塑膠蓋與試管的銜接口外，其他操作均與實施例I相同。采用實施例7的條件下做了 6個菌株的保存期試驗，每個菌株有7支試管種，保存12個月后試管內(nèi)的培養(yǎng)基縮水率達70%，菌種活性只達43%。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。
權(quán)利要求
1.一種正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法，其特征在于，包括以下步驟 a、摘采正開傘的成熟正紅菇子實體； b、在無菌條件下取步驟a中正紅菇子實體菌柄與菌蓋交接處的菌褶部分的組織塊，放入含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA固體培養(yǎng)基中，室溫、避光培養(yǎng)3 5天，萌發(fā)得到菌絲體； C、在無菌條件下將步驟b中的菌絲體放入含乳糖的改良MN固體培養(yǎng)基中，室溫、避光培養(yǎng)5 7天，純化菌絲體； d、在無菌條件下，將步驟c中純化的菌絲體轉(zhuǎn)接入具膠蓋的試管中，室溫、避光培養(yǎng)5 7天，所述試管中裝有由步驟b所述的含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA培養(yǎng)基和步驟c所述的含乳糖的改良MN培養(yǎng)基組成的混合培養(yǎng)基； e、將步驟d中無污染的試管置于10 15°C保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法，其特征在于，步驟b的培養(yǎng)基中所述乳糖的濃度為4 6g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法，其特征在于，步驟b的培養(yǎng)基中所述維生素B1的濃度為100±10ii g/L ;所述葉酸的濃度為50±5ii g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法，其特征在于，步驟c的培養(yǎng)基中所述乳糖的濃度為0. 5 I. 5g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法，其特征在于，步驟d中所述含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA培養(yǎng)基與含乳糖的改良麗培養(yǎng)基的體積比為I : I 2 : I。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法，其特征在于，步驟d中所述含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA培養(yǎng)基與含乳糖的改良麗培養(yǎng)基的體積比為2:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法，其特征在于，步驟e中所述試管與膠蓋之間的銜接口用保鮮膜封包。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法，包括以下步驟摘采正開傘的成熟正紅菇子實體；取正紅菇子實體菌柄與菌蓋交接處的菌褶部分的組織塊，放入含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA固體培養(yǎng)基中，室溫、避光培養(yǎng)3～5天，萌發(fā)得到菌絲體；將菌絲體放入含乳糖的改良MN固體培養(yǎng)基中，室溫、避光培養(yǎng)5～7天，純化菌絲體；將純化的菌絲體轉(zhuǎn)接入具膠蓋的試管中，室溫、避光培養(yǎng)5～7天；將無污染的試管置于10～15℃保存。這種正紅菇菌根型食用菌的分離培養(yǎng)保存方法，組織塊菌絲體的萌發(fā)率高達50％以上，菌種保存時間一次分轉(zhuǎn)可達1年，菌種活性持續(xù)3年不退化。
文檔編號A01G1/04GK102715016SQ20121023817
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者仲崇祿, 姜清彬, 張勇, 陳珍, 陳羽 申請人:中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所