專利名稱：球毛殼菌素a的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新用途，具體為球毛殼菌素A在玉米大斑病、葡萄白腐病和番茄根霉菌果腐病生物防治中的新用途。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，具有促進植物生長、提高宿主植物抗性等生理生態(tài)功能，內(nèi)生菌普遍存在著抗菌活性，由于研究內(nèi)生菌中抗菌活性物質(zhì)具有十分重要的理論意義和應用前景，近年來這方面的進展十分迅速，尤其是從內(nèi)生真菌中篩選到許多具有抗菌活性的化合物。毛殼菌屬(Chaetomium)是一個大的真菌類群,主要腐生于植物殘體、紙張、土壤、 動物糞便和富含纖維素的廢舊物品，以產(chǎn)豐富的降解纖維素的酶和具有生理活性的次生代謝產(chǎn)物而著稱，被認為具有潛在生物防治能力的類群，其生物防治機理主要包括產(chǎn)生抗真菌的抗生素、酶類或其他代謝產(chǎn)物，誘導植物產(chǎn)生抗病性及對植物病原真菌重寄生作用等。球毛殼菌素A不僅具有抗腫瘤活性，同時對腐霉菌、灰霉病菌、立枯絲核菌、鐮刀菌等植物病原真菌具有優(yōu)異、廣譜的抑菌活性，所以球毛殼菌素A具備良好的發(fā)展為新型殺菌劑的開發(fā)前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供球毛殼菌素A的新用途，即在玉米大斑病、葡萄白腐病和番茄根霉菌果腐病生物防治中的新用途。本發(fā)明的銀杏內(nèi)生真菌菌株Chaetomium globosum發(fā)酵液提取物分離的球毛殼菌素A，其結(jié)構(gòu)式為
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O銀杏內(nèi)生真菌菌株Chaetomium globosum發(fā)酵液提取物分離的球毛殼菌素A對玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、葡萄白腐病菌Coniothyrium diplodiella、匍枝根霉Rhizopus stolonifer 具有拮抗活性。銀杏內(nèi)生真菌菌株Chaetomium globosum發(fā)酵液提取物分離的球毛殼菌素A在玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病生物防治中的應用。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案為球毛殼菌素A制備I)將球毛殼菌NO. 05接種于真菌液體培養(yǎng)基中發(fā)酵7-8天，過濾，發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取濃縮，收集的菌絲體用甲醇提取，而后再經(jīng)乙酸乙酯萃取濃縮，發(fā)酵液所得濃縮物和菌絲體所得濃縮物合并，即為粗提物；球毛殼菌NO. 05保藏在吉林大學植物科學學院有害生物綜合防治實驗室，保藏編號為N0. 05，保藏日期為2010年10月2日。2)發(fā)酵液乙酸乙酯提取浸膏通過硅膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析分離，提取其中的化學成分，常壓柱層析采用濕法裝柱和硅膠拌樣上柱，根據(jù)薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統(tǒng)，反相柱層析采用加壓裝置，凝膠柱層析選用SePhadexLH-20，采用甲醇以及甲醇一二氯甲烷洗脫，多次柱層析最后得到化合物球毛殼菌素A。
本發(fā)明的有益效果在于銀杏內(nèi)生真菌菌株Chaetomium globosum發(fā)酵液提取物分離的球毛殼菌素A對玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、葡萄白腐病菌Coniothyriumdiplodiella、匍枝根霉Rhizopus stolonifer具有拮抗活性,可在玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病生物防治中應用，并用于微生物源農(nóng)藥的制備。
具體實施例方式硅膠柱制備發(fā)酵液乙酸乙酯提取浸膏5. 7g與柱層層析硅膠(100-200目)5. 7g通過干法拌樣獲得上柱樣品，柱層層析硅膠(200-300目)100g，用二氯甲烷甲醇=100 0，二氯甲烷甲醇=50 1，二氯甲烷甲醇=30 1，二氯甲烷甲醇=20 1，二氯甲烷甲醇=10 I梯度洗脫，每份洗脫液為150ml，減壓蒸餾濃縮，薄板檢測，相似合并，得到A-F六個組分，其中C、D、E組分顯示較強的抗菌活性，所以在活性追蹤下進行連續(xù)兩次凝膠SePhadexLH-20柱層析，洗脫劑分別為二氯甲烷甲醇=6 4和甲醇，得到活性組分CZ-1，繼續(xù)硅膠柱層析，以環(huán)己烷丙酮=10 I洗脫得到活性組分CZ-1-C，然后繼續(xù)用反相RP-C18柱層析純化，以水-甲醇(30%、45%、50%、55% )洗脫得到純化合物。經(jīng)鑒定，該化合物為球毛殼菌素A。球毛殼菌素A的抗菌新活性測定準確稱取球毛殼菌素A 500ug,并加入IOOul體積的DMS0，震蕩充分溶解，最終配置成濃度為5mg/mL的母液；取上述母液2uL于無菌濾紙片上并吹干，在PDA平板中央接種直徑為9cm的玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉菌塊，距離菌塊3cm處點接球毛殼菌NO. 05的發(fā)酵液濾紙片，設(shè)置將只有DMSO并吹干的濾紙片作為陰性對照，將滴加2uL 5mg/ml潮霉素B并吹干的濾紙片作為陽性對照，28°C恒溫培養(yǎng)2-3d，觀察有無抑菌帶，并測定大小，抑菌帶越大，表示抑菌效果越強。以下列公式計算抑制率抑制率(％ )=(對照組病原菌生長半徑一處理組病原菌生長半徑)/對照組病原菌生長半徑XlOO%。測定結(jié)果表明球毛殼菌素A對玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌和匍枝根霉的抑制率分別為 71. 62%,72. 50%和 60. 13% 0球毛殼菌素A的生物防治新應用
將5mg/mL的球毛殼菌素A母液與玉米大斑病菌孢子混合,配成孢子懸浮液，使球毛殼菌素 A 的濃度分別稀釋到 lug/ml、2ug/ml、5ug/ml、IOug/ml、20ug/ml、50ug/ml,將混合的孢子懸浮液噴在4-5葉期的離體玉米葉片上，將不含球毛殼菌素A的孢子懸浮液和只接種Tween-20水(0. 1% )的玉米72小時后觀察玉米的發(fā)病情況。測定結(jié)果表明接種球毛殼菌素A為lug/ml、2ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml孢子混合懸浮液的玉米葉片病斑面積明顯減少；接種球毛殼菌素A為50ug/ml孢子混合懸浮 液的玉米葉片幾乎沒有病斑。由此可見球毛殼菌素A對玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、葡萄白腐病菌Coniothyrium diplodiella、匍枝根霉Rhizopus stolonifer具有拮抗活性,可在玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病生物防治中應用，并用于微生物源農(nóng)藥的制備。
權(quán)利要求
1.一種銀杏內(nèi)生真菌菌株Chaetomium globosum發(fā)酵液提取物分離的球毛殼菌素A,其特征在于球毛殼菌素A的結(jié)構(gòu)式為
2.按權(quán)利要求I所述的銀杏內(nèi)生真菌菌株Chaetomiumglobosum發(fā)酵液提取物分離的球毛殼菌素A,其特征在于對玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、葡萄白腐病菌Coniothyrium diplodiella、匍枝根霉 Rhizopus stolonifer 具有拮抗活性。
3.按權(quán)利要求I所述的銀杏內(nèi)生真菌菌株Chaetomiumglobosum發(fā)酵液提取物分離的球毛殼菌素A，其特征在于在玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病生物防治中的應用。
全文摘要
球毛殼菌素A的新用途具體涉及球毛殼菌素A在玉米大斑病、葡萄白腐病和番茄根霉菌果腐病生物防治中的新用途，本發(fā)明提供的銀杏內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液提取物分離的球毛殼菌素A對玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉具有拮抗活性，可在玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病生物防治中應用，并用于微生物源農(nóng)藥的制備。
文檔編號A01N43/90GK102754652SQ20121018508
公開日2012年10月31日 申請日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者張桂珍, 張雅梅, 李想, 潘洪玉, 田野, 秦建春, 程鴻, 莫華文 申請人:吉林大學