專利名稱：一株蘇云金芽孢桿菌st8及其殺蟲(chóng)基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種蘇云金芽孢桿菌ST8及其殺蟲(chóng)基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在人類生產(chǎn)過(guò)程中，蟲(chóng)害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失及影響人類健康的重要因素，據(jù)FAO 統(tǒng)計(jì)，全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年因蟲(chóng)害造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)14%，病害損失達(dá)12%，草害損失達(dá)11%。損失額高達(dá)1260億美元，相當(dāng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的一半，英國(guó)的4倍多。農(nóng)業(yè)類害蟲(chóng)主要集中在鱗翅目與同翅目之中，鞘翅目金龜甲總科內(nèi)部分昆蟲(chóng)，如蠐贈(zèng)，也是重要的世界性分布地下害蟲(chóng)，危害雙子葉和單子葉糧食作物、多種蔬菜、油料、芋、棉、牧草以及花卉和果、林等播下的種子及幼苗，并且為害期長(zhǎng)，從播種到收獲均能為害，造成缺苗斷壟，甚至絕收，還會(huì)影響品質(zhì)。大量調(diào)查表明，蠐螬在地下害蟲(chóng)中為害居首位，占總地下害蟲(chóng)量的 70-80%上。主要有暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela Motschulsky)、華北大黑鰓金龜 (Holotrichia oblita faldermann)、銅綠_金龜(Anomala carpulenta Motsch)等，在我國(guó)華北地區(qū)如河北、山東等地危害較為嚴(yán)重。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時(shí)可形成具有殺蟲(chóng)活性的由蛋白質(zhì)組成的伴胞晶體，又名殺蟲(chóng)晶體蛋白Gnsectididal crystal proteins，簡(jiǎn)稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，該蛋白對(duì)敏感昆蟲(chóng)有強(qiáng)烈毒性，而對(duì)高等動(dòng)物和人無(wú)毒性。近幾十年來(lái)，Bt已廣泛應(yīng)用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲(chóng)。此外，Bt還對(duì)膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲(chóng)及植物病原線蟲(chóng)、螨類、原生動(dòng)物有控害作用。目前在農(nóng)田害蟲(chóng)、森林害蟲(chóng)及衛(wèi)生害蟲(chóng)的防治中Bt已成為化學(xué)合成農(nóng)藥的有力替代品，Bt還是轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)工程植物重要的基因來(lái)源。自1981年khn印f從菌株HD-IDipel中克隆了第一個(gè)能表達(dá)殺蟲(chóng)活性的基因以來(lái)，人們已經(jīng)分離克隆了 470多種ICPs的基因，根據(jù)編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類。迄今發(fā)現(xiàn)的對(duì)蠐螬具有殺蟲(chóng)活性的Bt基因主要有 cry3、cry8、cryl8、cry23、cry37、cry43 等類基因(Shu C. , et al. 2009, Characterization of two novel cry8 genes from Bacillus thuringiensis strain BT185. Current Microbiology, 58 (4) :389-392.),其中研究最多的是cry8類基因，cry8類基因由 1160-1210個(gè)氨基酸組成，分子量為U8_137kDa，對(duì)金龜子科、象甲科、葉甲科等多種鞘翅
(Crickmore N. ，et al. 1998. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev, 62 :807-813). 1992年，OtAa等在世界上首次從Bt菌株中篩選出對(duì)金龜子幼蟲(chóng)具有特異殺蟲(chóng)活性的新菌株(Bt. subsp. japonensis BuiBui) (Ohba Μ.，et al. , 1992. Aunique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a high larvicidal activity specific for scarabaeid beetles, Letters in Applied Microbiology, 14 54-57)，1994 年從中克隆了一種新的殺蟲(chóng)基因 cry8Ca(Sato R.，et al. 1994. Cloning, heterologous expression, and localization of a novel crystal protein gene from Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain buibui toxic to scarabaeid insects. Curr. Microbiol. 28 :15-19)。美國(guó) Mycogen 公司從 Bt 菌株 PS50C 分離的 Cry8Aal 和 Cry8Bal 對(duì)花金龜 Cotinis sp 有明顯的殺蟲(chóng)活性(US Patent 5554534) (Tracy E.Michaels, Kenneth Ε. Narva, Foncerrada,1994.Bacillus thuringiensis toxins active against scarab pests. USP5554534.)。美國(guó)從Bt 菌株中分離了兩種基因 cry8Bbl 和crySBcl基因，發(fā)現(xiàn)對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)，西方玉米根葉甲，南方玉米根葉甲具有顯著的殺蟲(chóng)效果并已用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米的開(kāi)發(fā)(Abad，et al. 2002. Genes encoding novel proteins with pesticidal activity against Coleopterans. WO 02/34774 A2)。在我國(guó)，河北省農(nóng)科院植保所和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)近年先后篩選獲得多株對(duì)黃褐麗金龜(A. exoleta)和銅綠麗金龜(A. corpulenta)的幼蟲(chóng)具有特異殺蟲(chóng)活性的Bt菌株，室內(nèi)生測(cè)死亡率均達(dá)100% (馮書(shū)亮等.2000. —株對(duì)金龜子類幼蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性的蘇云金桿菌新分離株.中國(guó)生物防治， 16(2) :74-78)。2004年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)所Btl85分離了一株對(duì)暗黑鰓金龜幼蟲(chóng)高效(LC50,0. 94cfu/ml)的菌株Btl85，并從中克隆了四個(gè)種新的cry8類基因:cry8Eal, cry8Ea2, cry8Fal, cry8Hal。目前絕大部分此類殺蟲(chóng)基因均被國(guó)外科研究機(jī)構(gòu)或種子公司進(jìn)行了專利保護(hù)；因此，對(duì)這些Bt資源進(jìn)行挖掘和開(kāi)發(fā)是一項(xiàng)緊迫而又有價(jià)值的工作，擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，對(duì)于基因克隆、工程菌構(gòu)建和抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物均具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。 自本世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌至今已有100多年的歷史，在農(nóng)作物和園藝植物害蟲(chóng)、森林害蟲(chóng)以及衛(wèi)生害蟲(chóng)的防治方面得到廣泛的應(yīng)用，也起到良好的效果。但是頻繁地使單一 Bt殺蟲(chóng)蛋白的必然結(jié)果是因害蟲(chóng)的適應(yīng)而產(chǎn)生對(duì)Cry類蛋白的抗性；目前，許多昆蟲(chóng)種群已相繼在不同程度上對(duì)殺蟲(chóng)晶體蛋白產(chǎn)生了抗性。上世紀(jì)80年中期開(kāi)始，抗性問(wèn)題不斷在實(shí)驗(yàn)室及田間試驗(yàn)中得到證實(shí)(Mc Gaugheyff. H. 1985. Insect resistance to the biological insecticide Bacillus thuringiensis. Science. 229 :193-195),原因主要是持續(xù)使用單品種及亞致劑量的Bt以及Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物的應(yīng)用造成昆蟲(chóng)種群長(zhǎng)期受到殺蟲(chóng)劑的選擇壓力。1985年，Mc Gaughey報(bào)道倉(cāng)庫(kù)谷物害蟲(chóng)印度谷螟(Plodia
subsp. kurstaik HD-1的商品制劑)的選擇壓力下，繁殖 15代后，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實(shí)大田中的小菜蛾對(duì)Bt殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了明顯的抗性(Tabashnik B. E, et al. 1994. Reversal of resistance to Bacillus thuringiensisin Plutella xylostella. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 :4120-4124)，上世紀(jì)90年代以來(lái)，在我國(guó)應(yīng)用Bt殺蟲(chóng)劑時(shí)間較長(zhǎng)的深圳、廣州、上海等地，發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲(chóng)劑對(duì)小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經(jīng)形成(馮夏.1996.廣東小菜蛾對(duì)蘇云金桿菌的抗性研究.昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，39(3) =238-244 ； Hofte H. , et al. 1988. Monoclonal antibody analysis and insecticidal spectrum of three types of lepidopteran-specific insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 54 :2010-2017)。目前發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室及田間至少有十幾種昆蟲(chóng)對(duì)Bt及其殺蟲(chóng)晶體蛋白產(chǎn)生了抗性，用選擇壓力數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)到，在 Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物選擇壓力的條件下，昆蟲(chóng)將會(huì)產(chǎn)生抗性Gchn印f，Ε.，et al. 1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal Crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65(3) :775-806)。為避免抗性昆蟲(chóng)所造成的損失，尋找新的高毒力Bt菌株及基因資源是解決這個(gè)問(wèn)題的有效途徑，這對(duì)我國(guó)的生物防治也有著十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有殺蟲(chóng)活性的蘇云金芽孢桿菌及其殺蟲(chóng)基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株為蘇云金芽孢桿菌ST8，該菌株已于2010年6月12日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，保藏號(hào)為 CGMCC No. 3923。該菌株ST8細(xì)胞呈桿狀，兩端鈍圓，能形成芽胞，同時(shí)能形成球形伴胞晶體，見(jiàn)附圖1。菌株大小為(1.2-1.5) μ mX (3. 5-4. 4) μ m，通常單個(gè)、或兩個(gè)、或短鏈細(xì)胞存在，一個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為一個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊內(nèi)含有一個(gè)芽孢，次端生，另一端有一個(gè)伴孢晶體，孢子囊不膨大。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)該菌含有3種抗蟲(chóng)基因cry8Kbl、cry8PaU cry8Qal，其核苷酸序列分別如 SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03 所示。本發(fā)明提供了含有蘇云金芽孢桿菌ST8的菌劑。本發(fā)明提供了蘇云金芽孢桿菌ST8或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有蘇云金芽孢桿菌ST8的菌劑在提高植物抗蟲(chóng)性中的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的菌株對(duì)鞘翅目昆蟲(chóng)具有較高的殺蟲(chóng)活性，其中對(duì)暗黑鰓金龜殺蟲(chóng)活性的LC50為3. 06X 108cfu/g，對(duì)華北大黑鰓金龜?shù)腖C50為1. 14X 108cfu/g。本發(fā)明提供了蘇云金芽孢桿菌ST8或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有該菌菌劑的殺蟲(chóng)劑。本發(fā)明提供了蘇云金芽孢桿菌ST8或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有該菌的菌劑在制備殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用。所述的殺蟲(chóng)劑為殺鞘翅目金龜科類昆蟲(chóng)的殺蟲(chóng)劑。本發(fā)明提供了蘇云金芽孢桿菌ST8或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有該菌的菌劑在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所述的轉(zhuǎn)基因植物可以是轉(zhuǎn)基因棉花、油料作物、蔬菜、花卉和/或草。本發(fā)明還提供了以蘇云金芽孢桿菌ST8為有效成分的制劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。本發(fā)明提供的蘇云金芽孢桿菌ST8是一種新發(fā)現(xiàn)的Bt資源，含有抗蟲(chóng)基因，具有較好的殺鞘翅目金龜科昆蟲(chóng)的活性，將其用于制備轉(zhuǎn)基因植物，能夠特異性殺滅害蟲(chóng)，并降低農(nóng)藥的使用量，降低成本，減少環(huán)境污染。目前還沒(méi)有害蟲(chóng)或昆蟲(chóng)對(duì)該菌株產(chǎn)生抗性的報(bào)道，因此，本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌ST8具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景，適合大規(guī)模應(yīng)用于提高植物的抗蟲(chóng)性中，可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣使用。


圖1為蘇云金芽孢桿菌ST8菌株的圓形伴孢晶體、芽孢(5000X)；
圖2為蘇云金芽孢桿菌ST8菌株SDS-PAGE電泳分析，其中M為蛋白質(zhì)Marker ；圖3為蘇云金芽孢桿菌ST8菌株中cry基因型的PCR鑒定，其中M為DNA Marker IOObp, 1為cry8類基因擴(kuò)增產(chǎn)物；圖4為蘇云金芽孢桿菌ST8中cry8全長(zhǎng)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中M為DNA Marker IOObp, 1為cry8全長(zhǎng)基因的PCR產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本實(shí)施例中所用的土樣，來(lái)自各地不同植物根基土壤。實(shí)施例1蘇云金芽孢桿菌ST8菌株的分離培養(yǎng)和鑒定(1)菌株的分離培養(yǎng)土壤采自四川省成都溫江地區(qū)。采用醋酸鈉-抗生素分離法，稱取IOg 土樣放入裝有50ml醋酸鈉培養(yǎng)基的搖瓶中，分別加入青霉素鈉鹽和硫酸慶大霉素各400μ g/ml，搖床培養(yǎng)(200r/min，3(TC )4h。培養(yǎng)結(jié)束后取土壤懸液10ml，加入無(wú)菌的離心管3000r/min 離心15min，取上層混濁液2ml于65°C水浴15min，取熱處理后的混濁液0. Iml涂平板，將平板置30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 后從平板上挑取類似Bt的菌株涂片。發(fā)現(xiàn)一株含有球狀晶體形態(tài)的Bt菌株(見(jiàn)附圖1)。經(jīng)用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，該菌株細(xì)胞呈桿狀，兩端鈍圓，菌株大小為1. 2-1. 5 μ mX 3. 5_4. 4 μ m，通常單個(gè)、或兩個(gè)、或短鏈細(xì)胞存在，一個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為一個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊內(nèi)含有一個(gè)芽孢，次端生，另一端有一個(gè)伴孢晶體，孢子囊不膨大。(2)菌株的鑒定SDS-PAGE電泳表明，菌株ST8主要產(chǎn)生約130KD左右大小的蛋白(見(jiàn)附圖2)。根據(jù)cry8類基因保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)通用引物5’ -GTCCGAATAATCAGAATGAATATG-3’5’ -CGTTTTGCCTCTCTCACTGCATC-3’擴(kuò)增體系IOx PCR buffer:2.5μLMgCl2 (2.5mM):dNTP ( 2.5mM):引物1:IpL引物2:IpL模板DNA:Taq DNA聚合酶0.2μLdH20補(bǔ)足至25pL擴(kuò)增條件 cry8基因的擴(kuò)增
權(quán)利要求
1.蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)菌株ST8，其保藏編號(hào)為CGMCC No.3923。
2.如權(quán)利要求1所述蘇云金芽孢桿菌ST8，其特征在于，含有3種抗蟲(chóng)基因crySKbl、 cry8Pal、cry8Qal，其核苷酸序列分別如 SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID N03 所示。
3.含有權(quán)利要求1所述蘇云金芽孢桿菌ST8的菌劑。
4.權(quán)利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌ST8或其發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求3所述的菌劑在提高植物抗蟲(chóng)性中的應(yīng)用。
5.含有權(quán)利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌ST8或其發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求3所述的菌劑的殺蟲(chóng)劑。
6.權(quán)利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌ST8或其發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求3所述的菌劑在制備殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求5所述的殺蟲(chóng)劑或權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的殺蟲(chóng)劑為殺鞘翅目金龜科類昆蟲(chóng)的殺蟲(chóng)劑。
8.權(quán)利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌ST8或其發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求3所述的菌劑在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物包括棉花、油料作物、蔬菜、花卉和/或草。
10.以權(quán)利要求1所述蘇云金芽孢桿菌ST8為有效成分的制劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株具有殺蟲(chóng)活性的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)菌株ST8，其保藏編號(hào)為CGMCC No.3923。它具有3個(gè)抗蟲(chóng)基因，分別是cry8Kb1、cry8Pal、cry8Qal，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3所示。本發(fā)明提供的菌株ST8對(duì)為害糧食、棉花、油料、蔬菜，以及其他經(jīng)濟(jì)作物、花卉、草坪等多種植物的鞘翅目地下害蟲(chóng)具有較高的殺滅活性。本發(fā)明還提供了菌株ST8在制備植物殺蟲(chóng)劑、提高植物抗蟲(chóng)活性和培育轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01N63/00GK102363760SQ20111035207
公開(kāi)日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者劉懷年, 尹傳春, 朱軍, 李雙成, 李平, 王世全, 王玲霞, 鄧其明, 鄭愛(ài)萍 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)