專利名稱：Aad-1事件das-40278-9、相關(guān)的轉(zhuǎn)基因玉米品系及其事件特異性鑒定的制作方法
AAD-1事件DAS-40278-9、相關(guān)的轉(zhuǎn)基因玉米品系及其事件
特異性鑒定
背景技術(shù)：
aad-Ι基因(最初來(lái)自Sphingobium herbicidovorans)編碼芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶(aryloxyalkanoate dioxygenase，AAD-1)蛋白。該性狀賦予針對(duì)2，4_ 二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(一般稱作“fop”除草劑，如喹禾靈(quizalofop))除草劑的耐受性，并可在植物轉(zhuǎn)化過(guò)程中和育種苗圃中用作選擇性標(biāo)記。aad-Ι基因自身，首先在WO 2005/107437(亦參見US 2009-0093366)中公開其涉及除草劑耐受性。植物中異源或外源基因的表達(dá)受外源基因插入染色體的位置影響。這可能由于例如染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(例如異染色質(zhì))或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(例如增強(qiáng)子)與整合位點(diǎn)的靠近程度 (Weising等，Ann. Rev. Genet 22 =421-477,1988)。相同類型的轉(zhuǎn)基因植物(或其他生物) 中的相同基因可在不同事件的表達(dá)水平中呈現(xiàn)廣泛的差異。在表達(dá)的空間或時(shí)間樣式上也可能存在差異。舉例而言，在多種植物組織中轉(zhuǎn)基因的相對(duì)表達(dá)的差異可能不對(duì)應(yīng)于因?qū)氲幕驑?gòu)建體中存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件而期待的樣式。因此，常常構(gòu)建并篩選大量的事件以對(duì)于給定目的鑒定表達(dá)導(dǎo)入的感興趣的基因至令人滿意的程度的事件。對(duì)于商業(yè)目的，通常產(chǎn)生成百上千的不同事件，并就具有所需轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和樣式的單個(gè)事件對(duì)這些事件進(jìn)行篩選。具有所需的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的樣式和/ 或水平的事件可用于將所述轉(zhuǎn)基因通過(guò)使用常規(guī)育種方法的有性異型雜交(outcross)而漸滲入其他遺傳背景。此類雜交的后代保持起始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。該策略在多種良好適應(yīng)于當(dāng)?shù)厣L(zhǎng)條件的品種中用于確?？煽康幕虮磉_(dá)。美國(guó)專利申請(qǐng)20020120964 Al 和 20040009504 涉及棉花事件 PV-GHGT07 (1445)， 及其組合物和檢測(cè)方法。WO 02/100163涉及棉花事件M0NI5985，及其組合物和檢測(cè)方法。 WO 2004/011601涉及棉花事件M0N863，及其組合物和檢測(cè)方法。WO 2004/072235涉及棉花事件MON 88913，及其組合物和檢測(cè)方法。WO 2006/098952 涉及玉米事件 3272。WO 2007/142840 涉及玉米事件 MIR162。美國(guó)專利號(hào)7，179，965涉及具有cry IF事件和cry IAc事件的棉花。具有本文中公開的特定事件的AAD-I玉米之前并未公開。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及命名為DAS-40278_9(具有保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的登錄號(hào)PTA-10244的種子)的AAD-I玉米事件，及由其衍生的后代。本發(fā)明的其他方面包括玉米事件DAS-40278-9的后代和種子和植物的可再生(regenerable)部分或谷粒和種子、 后代植物，以及從任何上述所制備食物或飼料產(chǎn)品。本發(fā)明還包括玉米事件DAS-40278-9 的植物部分，其包括但不限于花粉、胚珠、花、莖(shoots)、根和葉，以及營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、花粉細(xì)胞和卵細(xì)胞的細(xì)胞核。本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有對(duì)苯氧基植物生長(zhǎng)素性(phenoxy auxinic)和 /或芳氧基鏈烷酸酯除草劑具有耐受性的玉米植物，玉米事件DAS-40278-9的新穎遺傳組合物，和包含玉米事件DAS-40278-9的玉米植物的農(nóng)藝學(xué)表現(xiàn)(agronomic performance)方面。 本發(fā)明部分涉及植物育種和除草劑耐受性植物。本發(fā)明包括玉米植物中的新穎 aad-Ι轉(zhuǎn)化事件，其包含如本文中所述的多核苷酸序列插入玉米細(xì)胞的基因組內(nèi)的特異性位點(diǎn)。 在一些實(shí)施方案中，所述事件/多核苷酸序列可與其他性狀“層疊”，包括，例如其他除草劑耐受性基因和/或昆蟲抑制性蛋白。然而，本主題發(fā)明包括具有如本文中所述的單一事件的植物。其他性狀可通過(guò)含有玉米事件DAS-40278-9的轉(zhuǎn)基因植物的植物育種、重新轉(zhuǎn)化，或通過(guò)藉由同源重組的靶向整合添加新性狀來(lái)層疊入植物基因組。其他實(shí)施方案包括切出包含玉米事件DAS-40278-9的多核苷酸序列，包括例如， pat基因表達(dá)盒。當(dāng)切出多核苷酸序列之后，可將修飾的事件重新靶向特定染色體位點(diǎn)，其中其他多核苷酸序列與玉米事件DAS-40278-9層疊。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了位于在染色體2上在2008 DAS玉米連鎖圖上大約 20cM 處在 SSR 標(biāo)志物 UMCU65(參見 SEQ ID N0:30 和 SEQ ID NO 31)和 MMC0111(參見 SEQ ID N0:32和SEQ ID NO 33)之間的大約20cM處的玉米染色體靶位點(diǎn)，其中所述靶位點(diǎn)包含異源核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明涵蓋包含在如本文中所述的SEQ ID NO : 及其殘基中定義或由如本文中所述的SEQ ID NO : 及其殘基定義的位置的玉米染色體靶位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了制備轉(zhuǎn)基因玉米植物的方法，包括將異源核酸插入2008DAS玉米連鎖圖上大約20cM處的SSR標(biāo)志物UMC1265 (參見SEQ ID NO 30和SEQ ID NO 31)和 MMC0111 (參見 SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID NO :33)之間的大約 20cM 處的位置。 還在另一個(gè)實(shí)施方案中，插入的異源核酸的5’側(cè)為對(duì)于SEQ ID NO : 如本文中所定義的 5’側(cè)翼序列的全部或部分，且3’側(cè)為對(duì)于SEQ ID NO 29如本文中所定義的3’側(cè)翼序列的全部或部分。此外，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品(例如玉米粒)中本主題事件的存在的測(cè)定法。 所述測(cè)定法可基于重組構(gòu)建體的DNA序列插入玉米基因組，和基于在插入位點(diǎn)側(cè)翼的基因組序列。還提供了可用于進(jìn)行所述測(cè)定法的試劑盒和條件。因此，本主題發(fā)明部分涉及全部AAD-I插入及其邊界區(qū)(在轉(zhuǎn)基因玉米品系中) 的DNA序列的克隆和分析。這些序列是獨(dú)特的?；谶@些插入和邊界序列，生成了事件特異性引物。PCR分析闡明了可通過(guò)對(duì)用這些事件特異性引物組生成的PCR擴(kuò)增子的分析來(lái)鑒定這些事件。因此，這些和其他相關(guān)方法可用于獨(dú)特地鑒定包含本主題發(fā)明的事件的玉米品系。


圖1顯示pDAS1740的質(zhì)粒圖。圖2顯示對(duì)于DAS-40278-9 (pDAS1740)的插入的組分。圖3顯示對(duì)于DAS-40278-9 (pDAS1740)的插入的限制圖和組分。圖4顯示對(duì)于DAS-40278-9的DNA插入和邊界的擴(kuò)增子、引物和克隆策略。圖5圖示相對(duì)于DAS-40278-9的插入和邊界的引物位置。
圖6圖示DAS-40278-9的連接區(qū)和插入。圖7是實(shí)施例7中提及的育種概略。序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO 1-28為本文中所述的引物。SEQ ID NO 29提供了對(duì)于本主題事件DAS-40278-9的插入和側(cè)翼序列。SEQ ID NO :30-33為用于實(shí)施例4中所述的側(cè)翼標(biāo)志物的引物。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明部分涉及植物育種和除草劑耐受性植物。本發(fā)明包括玉米植物(玉米)的新穎轉(zhuǎn)化事件，其包含如本文中所述的本主題aad-Ι多核苷酸序列插入玉米細(xì)胞的基因組內(nèi)的特異性位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸序列可與其他性狀“層疊”，(例如如其他除草劑耐受性基因和/或編碼昆蟲抑制性蛋白的基因)。在一些實(shí)施方案中，可以將所述多核苷酸序列切出，其后用別的多核苷酸序列重新靶向。然而，本主題發(fā)明包括具有如本文中所述的單一事件的植物。此外，本主題發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品中本主題事件的存在的測(cè)定法。本主題發(fā)明的諸方面包括設(shè)計(jì)和/或產(chǎn)生任何本文中例示或提出的診斷性核酸分子，特別是那些全部或部分基于本主題側(cè)翼序列的方法。更具體而言，本主題發(fā)明部分涉及轉(zhuǎn)基因玉米事件DAS-40278_9(亦稱作 PDAS1740-278)，包含這些事件的植物品系，和該插入和/或其邊界區(qū)的DNA序列的克隆和分析?？墒褂帽疚闹泄_和提出的序列檢測(cè)本主題發(fā)明的植物品系。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及除草劑耐受性玉米品系及其鑒定。本主題發(fā)明部分涉及檢測(cè)本主題事件的存在以確定有性雜交的后代是否含有感興趣的事件。此外，包括了用于檢測(cè)所述事件的方法，且其有助于例如，遵守要求來(lái)源于重組作物植物的食物的上市前批準(zhǔn)和標(biāo)記的規(guī)定?？梢酝ㄟ^(guò)任何公知的核酸檢測(cè)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCI )或使用核酸探針的DNA雜交來(lái)檢測(cè)本主題事件的存在。例如，Windels等(Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b :459462,1999)討論事件特異性PCR測(cè)定法。其涉及使用跨越插入和側(cè)翼DNA之間的連接的引物組通過(guò)PCR來(lái)鑒定草甘膦耐受性大豆事件40-3-2。更具體而言， 一個(gè)引物含有來(lái)自插入的序列，而第二引物含有來(lái)自側(cè)翼DNA的序列。通過(guò)來(lái)自Sphingobium herbicidovorans、編碼芳氧基鏈烷酸雙加氧酶(AAD-1) 蛋白的aad-Ι基因的插入來(lái)修飾玉米。該性狀賦予針對(duì)2，4_ 二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(一般稱作“fop”除草劑，如喹禾靈)除草劑的耐受性，并可在植物轉(zhuǎn)化過(guò)程中和育種苗圃中用作選擇性標(biāo)記。用來(lái)自質(zhì)粒PDAS1740的DNA片段來(lái)通過(guò)育種進(jìn)行玉米的轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生事件DAS-40278-9。從就AAD-I玉米事件DAS-40278-9的分子表征選擇的來(lái)源于事件DAS-40278-9的五個(gè)世代和每世代四株植物的二十株個(gè)體玉米植物提取基因組DNA樣品。使用AAD-I特異性快速測(cè)試條試劑盒(AAD-lspecific rapid test strip kit)測(cè)試AAD-I蛋白表達(dá)。僅選擇就AAD-I蛋白表達(dá)測(cè)試為陽(yáng)性的植物用于后續(xù)的分子表征。Southern雜交確證aad-1 基因存在于就AAD-I蛋白表達(dá)測(cè)試為陽(yáng)性的玉米植物，且所述aad-Ι基因當(dāng)與aad-Ι基因探針雜交時(shí)作為單個(gè)完整的拷貝插入這些植物。
本文中亦描述了 AAD-I玉米事件DAS-40278-9中插入的DNA的分子表征。該事件是通過(guò)用質(zhì)粒PDAS1740的Fsp I片段的Whiskers轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生的。使用Southern印跡分析建立插入的DNA片段的整合樣式，并確定事件DAS-40278-9中的aad-Ι基因的插入/拷貝數(shù)。生成數(shù)據(jù)以闡明所述aad-Ι轉(zhuǎn)基因插入玉米基因組的整合和完整性。評(píng)價(jià)了非編碼區(qū)(設(shè)計(jì)用于調(diào)節(jié)編碼區(qū))如啟動(dòng)子和終止子，基質(zhì)連接區(qū)RB7 Mar v3和RB7 Mar v4的整合的表征，以及世代之間該轉(zhuǎn)基因插入的穩(wěn)定性。在植物的五個(gè)不同世代之間闡述了插入的DNA的穩(wěn)定性。此外，通過(guò)幾乎覆蓋質(zhì)粒PDAS1740的限制性位點(diǎn)(Fsp I)側(cè)翼的整個(gè)骨架區(qū)的探針闡明了不存在包括氨芐青霉素抗性基因(Ap1O區(qū)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒骨架序列?；谑录﨑AS-40278-9的這些Southern印跡分析繪制插入的具體物理圖。在玉米組織中確定AAD-I蛋白的水平。此外，對(duì)玉米草料(forage)和谷粒進(jìn)行了組成分析以調(diào)查同基因非轉(zhuǎn)化的玉米品系和轉(zhuǎn)基因玉米品系DAS-40278-9 (未噴灑的，噴灑2，4-D的，噴灑喹禾靈，以及噴灑2，4-D和喹禾靈)的等價(jià)性。亦將同基因非轉(zhuǎn)化的玉米品系的農(nóng)藝學(xué)特征與DAS-40278-9玉米相比。在同一年在位于Iowa，Illinois (2 個(gè)位置)，Indiana, Nebraska 和 Ontario, Canada的六個(gè)位置進(jìn)行非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸秃蟹佳趸溚樗犭p加氧酶_1 (AAD-I)的雜交玉米品系的田間表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)組成和農(nóng)藝學(xué)試驗(yàn)。在本文中總結(jié)了葉、花粉、根、草料、整株植物和谷粒中AAD-I蛋白的表達(dá)水平，農(nóng)藝學(xué)確定的結(jié)果，和來(lái)自對(duì)照和DAS-40278-9 AAD-I玉米的草料和谷粒樣品的組成分析。在玉米葉、花粉、根、草料、整株植物和谷粒中使用定量酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA) 方法來(lái)測(cè)量可溶性、可提取的AAD-I蛋白。如本文中更加詳細(xì)討論的，在根和花粉組織中觀察到良好的平均表達(dá)值。對(duì)于所有的噴灑處理以及對(duì)于用2，4-D和喹禾靈除草劑噴灑和未噴灑的地塊(plot)表達(dá)值是類似的。進(jìn)行組成分析，包括營(yíng)養(yǎng)成分(proximates)、礦物質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、維生素、抗?fàn)I養(yǎng)和次級(jí)代謝物，以調(diào)查DAS-40278-9 AAD-I玉米(經(jīng)或不經(jīng)除草劑處理)與對(duì)照的等價(jià)性。自對(duì)照和DAS-40278-9 AAD-I玉米地塊收集的農(nóng)藝學(xué)分析，對(duì)于DAS-40278-9 AAD-I 組合物樣品的結(jié)果均相對(duì)于對(duì)照品系和/或常規(guī)玉米一樣或更加良好(生物學(xué)上和農(nóng)藝學(xué)上)。如上文在背景部分所提及，轉(zhuǎn)基因?qū)牒驼现参锘蚪M涉及一些隨機(jī)事件(因此對(duì)于表達(dá)的給定插入使用名稱“事件”)。即，存在多種轉(zhuǎn)化技術(shù)如土壤桿菌轉(zhuǎn)化，“基因槍 (gene gun) ”，和WHISKERS的情況下，無(wú)法預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)基因會(huì)插入基因組的何處。因此，鑒定插入兩側(cè)的側(cè)翼植物基因組DNA對(duì)于鑒定具有給定插入事件的植物可為重要的。舉例而言， 可設(shè)計(jì)生成跨越插入和宿主基因組連接區(qū)的PCR擴(kuò)增子的PCR引物。該P(yáng)CR擴(kuò)增子可用于鑒定獨(dú)特或不同類型的插入事件。由于“事件”原本為隨機(jī)事件，因此作為本公開的一部分，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 (American Type Culture Collection(ATCC),10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110)保藏了包含所述事件的玉米品系的至少2500個(gè)種子，并使公眾可以不受限制的獲得(但專利權(quán)適用)。該保藏命名為ATCC保藏號(hào)PTA-10244(黃色馬齒型玉 ^ (Yellow Dent maize) 1 禾中 (Zea Mays L. ) :DAS-40278-9, Dow AgroSciences LLC保藏；ATTC接收種子/菌株的日期2009年7月10日，2009年8月17日確認(rèn)存活)。該保藏是，并會(huì)維持是為了專利程序的目的依照布達(dá)佩斯條約進(jìn)行的，并受其涉及種子保藏的條款約束。該保藏會(huì)不設(shè)限地保持在ATCC保藏機(jī)構(gòu)(其為公開保藏機(jī)構(gòu))至下述之中最晚者30年，或最后一次要求之后五年，或本專利的有效期限，并在此期間，若其不具生活力，則會(huì)加以替換。保藏的種子是本主題發(fā)明的一部分。顯然，可從這些種子培育玉米植物，且此植物是本主題發(fā)明的一部分。本主題發(fā)明還涉及這些玉米植物中所含的DNA序列，其可用于檢測(cè)這些植物及其后代。本主題發(fā)明的檢測(cè)方法和試劑盒可涉及鑒定任何一個(gè)、兩個(gè)或甚至所有三個(gè)這些事件，取決于該測(cè)試的最終目的。本文中提供的定義和實(shí)例是為了幫助描述本發(fā)明并指導(dǎo)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。除非臨行指明，應(yīng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員的常規(guī)用法來(lái)理解術(shù)語(yǔ)。使用如列于37 CFR § 1. 822的DNA堿基命名法。如用于本文，術(shù)語(yǔ)“后代”指包含AAD-I玉米事件DAS-40278-9的親本植物的任何世代的后代。轉(zhuǎn)基因“事件”是通過(guò)用異源DNA，即含有感興趣的轉(zhuǎn)基因的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，重新產(chǎn)生由將所述轉(zhuǎn)基因插入植物基因組所得的植物群體，并選擇由插入特定基因組位置所表征的特定植物來(lái)產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“事件”指起始轉(zhuǎn)化體和轉(zhuǎn)化體含有所述異源DNA的后代。術(shù)語(yǔ)“事件”還指通過(guò)轉(zhuǎn)化體和含有基因組/轉(zhuǎn)基因DNA的另一品種之間的有性異型雜交(outcross)產(chǎn)生的后代。即使在與回歸(recurrent)親本的反復(fù)回交之后，插入的轉(zhuǎn)基因DNA和來(lái)自轉(zhuǎn)化的親本的側(cè)翼基因組DNA (基因組/轉(zhuǎn)基因DNA)仍存在于雜交后代的相同染色體位置處。術(shù)語(yǔ)“事件”還指來(lái)自起始轉(zhuǎn)化體及其包含插入的DNA和直接鄰接插入的DNA的側(cè)翼基因組序列的后代的DNA，期待其會(huì)轉(zhuǎn)移至下述后代，所述后代作為一個(gè)含有所述插入的DNA的親本系(例如起始轉(zhuǎn)化體和其自交所得的后代)和不含有該插入的 DNA的親本系有性雜交的結(jié)果而接受了含有感興趣的轉(zhuǎn)基因的插入的DNA?！斑B接序列”跨越了插入基因組的DNA與來(lái)自插入點(diǎn)側(cè)翼的玉米天然基因組的DNA 連接的點(diǎn)，其中植物基因物質(zhì)中一種或其他連接序列的鑒定或檢測(cè)足以對(duì)所述事件具診斷性。包括了跨越本文中所述的玉米事件中的插入和類似長(zhǎng)度的側(cè)翼DNA的DNA序列。本文中提供了此類診斷性序列的具體實(shí)例；然而，其他與插入的連接處或插入和基因組序列的連接處重疊的序列也具診斷性，并可根據(jù)本發(fā)明使用。本主題發(fā)明涉及此類側(cè)翼、連接處和插入序列的鑒定。本發(fā)明包括相關(guān)的PCR引物和擴(kuò)增子。根據(jù)本主題發(fā)明，使用跨越插入的DNA及其邊界的擴(kuò)增子的PCR分析方法可用于檢測(cè)或鑒定商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因玉米品種或來(lái)源于本主題專利的轉(zhuǎn)基因玉米品系的品系。這些插入的每一個(gè)的整個(gè)序列，以及相應(yīng)的側(cè)翼序列的部分，在本文中提供為SEQ ID N0:29。相對(duì)于SEQ ID NO :29 (總共8557堿基對(duì))的本事件的插入和側(cè)翼序列的坐標(biāo)列于下表。例如，這在實(shí)施例3. 8中更加詳細(xì)地討論。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因玉米植物，其包含基因組，所述基因組包含SEQ ID N0:29。
2.—種玉米種子，其包含基因組，所述基因組包含如以登錄號(hào)PTA-10244保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的種子中存在的AAD-I事件DAS-40278-9。
3.一種玉米種子，其包含基因組，所述基因組包含SEQ ID N0:29。
4.一種玉米植物，其通過(guò)培育權(quán)利要求2的種子產(chǎn)生，所述植物包含SEQ ID NO 29
5.一種權(quán)利要求4的玉米植物的后代植物，所述后代植物包含AAD-I事件 DAS-40278-9。
6.一種權(quán)利要求1的玉米植物的除草劑耐受后代植物，所述后代植物包含SEQ ID NO29。
7.一種轉(zhuǎn)基因玉米植物，其包含在位于染色體2上SSR標(biāo)志物UMC1265和MMCOl 11之間的大約20cM的玉米染色體靶位點(diǎn)中的轉(zhuǎn)基因插入，其中UMC1265可通過(guò)SEQ ID NO 30 和SEQ ID NO 31部分?jǐn)U增，MMCOl 11可通過(guò)SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 33部分?jǐn)U增，其中所述靶位點(diǎn)包含異源核酸。
8.一種制備轉(zhuǎn)基因玉米植物的方法，包括將異源核酸插入于染色體2上SSR標(biāo)志物 UMC1265和MMC0111之間的大約20cM處的位置，其中UMC1265可通過(guò)SEQ ID NO :30和SEQ ID NO 31部分?jǐn)U增，且MMCOl 11可通過(guò)SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 33部分?jǐn)U增。
9.權(quán)利要求4的植物的部分，其中所述部分選自下組花粉、胚珠、花、莢殼(boll)、絨毛(lint)、莖(shoot)、根和葉，所述部分包含SEQ ID NO :29。
10.一種轉(zhuǎn)基因玉米植物，其包含轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因插入或側(cè)翼為選自下組的基因組序列SEQ ID NO 29 的殘基 1-1873 和 SEQ ID NO 1 的殘基 6690-8557。
11.一種分離的多核苷酸分子，其中所述分子包含至少15個(gè)核苷酸，并在嚴(yán)格洗滌條件下維持與選自下組的核酸序列的雜交SEQ ID NO : 的殘基1-1873，SEQ ID NO : 的殘基6690-8557，及其互補(bǔ)物。
12.—種分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選自下組的核苷酸序列SEQ ID NO 1-28 和 30-33。
13.一種分離的多核苷酸，其在嚴(yán)格洗滌條件下與選自下組的核苷酸序列雜交SEQ ID NO 29的殘基1863至1875，SEQ ID NO 29的殘基6679至6700，及其互補(bǔ)物。
14.權(quán)利要求13的多核苷酸，其中所述多核苷酸是由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生成的擴(kuò)增子。
15.一種在包含玉米DNA的樣品中檢測(cè)玉米事件的方法，其中所述方法包括將所述樣品與至少一種對(duì)AAD-I玉米事件DAS-40278-9具診斷性的多核苷酸相接觸，所述AAD-I玉米事件DAS-40278-9存在于以登錄號(hào)PTA-10244保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) 的種子中。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述方法包括將所述樣品與下述相接觸a.第一引物，其結(jié)合于選自下組的側(cè)翼序列=SEQID NO J9的殘基1-1873，SEQ ID N0 29的殘基6690-8557，及其互補(bǔ)物；和b.第二引物，其結(jié)合于包含SEQID NO 1的殘基1874-6689的插入序列或其互補(bǔ)物；對(duì)所述樣品進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并測(cè)定由所述引物生成的擴(kuò)增子。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述引物選自下組=SEQID NO :1_28。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述多核苷酸包含至少30個(gè)核苷酸，并在嚴(yán)格條件下與選自下組的序列雜交SEQ ID NO 29的殘基1863至1875，SEQ ID NO 29的殘基6679至 6700，及其互補(bǔ)物；其中所述方法進(jìn)一步包括將所述樣品和所述多核苷酸置于嚴(yán)格雜交條件下；并就所述多核苷酸對(duì)所述DNA的雜交測(cè)定所述樣品。
19.一種DNA檢測(cè)試劑盒，其包含權(quán)利要求17的第一引物和第二引物。
20.一種用于進(jìn)行權(quán)利要求18的方法的DNA檢測(cè)試劑盒。
21.—種DNA檢測(cè)試劑盒，其包含如SEQ ID NO :13中限定的多核苷酸。
22.—種多核苷酸，其包含SEQ ID N0:29。
23.—種產(chǎn)生權(quán)利要求22的多核苷酸的方法。
24.—種將轉(zhuǎn)基因插入玉米基因組的DNA區(qū)段的方法，所述DNA區(qū)段包含5’端和3’ 端，所述5，端包含SEQ ID NO 29的核苷酸殘基1_1873，且所述3，端包含SEQ ID NO=I的核苷酸殘基6690-8557。
25.—種對(duì)玉米植物進(jìn)行育種的方法，所述方法包括將包含SEQ ID N0:29的第一玉米植物與第二玉米植物雜交以產(chǎn)生包含基因組的第三玉米植物，和就所述基因組中SEQ ID NO 29的存在測(cè)定所述第三玉米植物。
26.一種將除草劑耐受性狀漸滲入玉米植物中的方法，所述方法包括將包含SEQ ID NO 29的第一玉米植物與第二玉米植物雜交以產(chǎn)生包含基因組的第三玉米植物，和就所述基因組中SEQ ID NO 29的存在測(cè)定所述第三玉米植物。
全文摘要
本發(fā)明部分涉及植物育種和除草劑耐受植物。本發(fā)明包括玉米植物中的新穎aad-1轉(zhuǎn)化事件，所述事件包含如本文中所述的多核苷酸序列，其插入玉米細(xì)胞的基因組內(nèi)的特定位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述事件/多核苷酸序列可與其他性狀包括，例如其他除草劑耐受基因和/或昆蟲抑制性蛋白相“層疊”。此外，本主題發(fā)明提供了用于檢測(cè)(例如玉米粒的)樣品中本主題事件的存在的測(cè)定法。所述測(cè)定法可基于插入玉米基因組的重組構(gòu)建體的DNA序列，和基于所述插入位點(diǎn)側(cè)翼的基因組序列。亦提供了可用于進(jìn)行所述測(cè)定的試劑盒和條件。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102573452SQ201080047187
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月19日
發(fā)明者D.莫姆, G.吉爾斯, J.布賴恩, J.漢米爾頓, N.周, N.瓦諾普多普, N.阿諾德, T.凱澤, T.賴特, Y.C.崔 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司