專利名稱：能夠賦予環(huán)境脅迫耐受性至植物的基因和利用該基因的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及已經(jīng)將給定基因導入其中的植物或其中已經(jīng)改變了內在的該基因的表達控制區(qū)的植物，用于通過導入給定基因至植物或改變其中內在的該基因的表達控制區(qū)而賦予環(huán)境脅迫耐受性至所述植物的方法，以及用于產(chǎn)生已經(jīng)賦予了環(huán)境脅迫耐受性的植物的方法。
背景技術：
植物生長的可能性取決于不同的環(huán)境因素，如溫度、濕度和土壤中鹽的濃度。在一些情況下，以此類因素為特征的環(huán)境適合某種植物但是不適合其他植物。通常，會影響植物生長的上述因素稱作環(huán)境脅迫。給定植物在以某些環(huán)境脅迫為特征的環(huán)境中不能生長或遭受致命損害的情況被解釋為該植物缺少環(huán)境脅迫耐受性。另一方面，給定植物可以在以某些環(huán)境脅迫為特征的環(huán)境中生長的情況被解釋為該植物具有環(huán)境脅迫耐受性。將植物進行栽培，旨在使用它們的一些組織(例如，種子、根、葉或莖)或旨在產(chǎn)生多種物質如脂肪和油。目前已知的從植物產(chǎn)生的脂肪和油的實例包括大豆油、芝麻油、橄欖油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、紅花油、棕櫚油和菜籽油。此類脂肪和油廣泛地用于家居和工業(yè)應用。另外，使用從植物產(chǎn)生的脂肪和油作為生物柴油燃料或生物塑料的原料，并且其可應用性因作為石油的替代能源而日益增加。如果可以賦予環(huán)境脅迫耐受性至植物，則可能擴展植物可以生長的地區(qū)，從而允許有效使用有限的土地空間。特別地，將能量作物如甘蔗用作生物燃料的原料。因此，期望此類能量作物獲得針對多種環(huán)境脅迫的抗性。也就是說，如果可以賦予環(huán)境脅迫耐受性至上述能量作物，則所述能量作物可以在因上述環(huán)境因素而不能栽培該作物的地區(qū)栽培。專利文件1和2以及非專利文件1中描述了用于賦予環(huán)境脅迫耐受性至植物的技術。專利文件1公開了通過導入基因至植物來賦予鹽脅迫耐受性至該植物的方法，其中所述基因參與合成充當滲壓劑的甘氨酸甜菜堿。專利文件2和非專利文獻1公開了通過導入基因至植物中賦予環(huán)境脅迫耐受性至該植物的方法，其中所述基因編碼源自煙草的受體樣蛋白。此外，在專利文件2和非專利文件1中，將編碼受體樣蛋白的基因導入。然而，這些文獻沒有公開采用編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的基因或編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白激酶的基因的基因導入實例。另外，非專利文獻2和3報道了具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白激酶在針對脅迫的反應中發(fā)揮重要作用。引文表專利文獻PTL 1 日本專利公開(特開)號 8-266179A(1996)PTL 2 日本專利公開(特開)號2001-252084APTL 3 日本專利公開(特表)號2007-530063A
非專利文獻NPL 1 =Plant Physiology，2003 年 2 月，第 131 卷，第 454-462 頁NPL 2 =Plant Physiology，2007 年 4 月，第 113 卷，第 1203-1212 頁NPL 3 =Plant Cell, 2005 年 4 月，第 17 卷(4)，第 1105-1119 頁發(fā)明概述技術問題目前不可能通過將編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的基因或編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白激酶的基因導入植物中賦予環(huán)境脅迫耐受性至該植物。因此，鑒于上述情況，本發(fā)明的目的是提供用于探索基因的技術，所述基因具有賦予環(huán)境脅迫耐受性至植物或改善植物的環(huán)境脅迫耐受性的新功能，從而允許賦予環(huán)境脅迫耐受性至植物或允許改善植物環(huán)境脅迫耐受性。技術問題的解決方案為了達到上述目的，本發(fā)明人新近發(fā)現(xiàn)，通過分析具有富亮氨酸重復結構的許多蛋白質并且將編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的特定基因或編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白激酶的特定基因導入植物中或改變內在的該基因的表達控制區(qū)，可以賦予環(huán)境脅迫耐受性至植物。這已經(jīng)導致本發(fā)明的完成。具體而言，本發(fā)明的植物是已經(jīng)將至少一個基因導入其中的植物，所述基因選自由以下基因組成的組選自第一組(包括At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900, At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050 和 At2g33060)的編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的基因；選自第二組(包括At3g^450、Atlg27190 和Atlg69990)的編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因；和選自第三組(包括 At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480 和 At5g39390)的編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因；或它是其中內在的該基因的表達控制區(qū)已經(jīng)改變的植物。此外，用于賦予環(huán)境脅迫耐受性至本發(fā)明植物的方法包括導入至少一個基因， 其中所述基因選自由以下基因組成的組選自第一組(包括At5g40170、At2g25440、 At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、At2g32660、 At2g33050和At2g33060)的編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的基因；選自第二組 (包括At3g^450、Atlg27190和Atlg69990)的編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因；和選自第三組(包括 At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480 和 At5g39390)的編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因；或改變內在的該基因的表達控制區(qū)。另外，用于產(chǎn)生本發(fā)明植物的方法包括步驟制備已經(jīng)將至少一個基因導入其中的轉化植物，所述基因選自由以下基因組成的組選自第一組(包括At5g40170、 At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、 At2g3^60、At2g33050和At2g33060)的編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的基因； 選自第二組(包括At3g^450、Atlg27190和Atlg69990)的編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因；和選自第三組(包括At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、 At5g20480和At5g39390)的編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因，或制備其中內在的該基因的表達控制區(qū)已經(jīng)改變的轉化植物；并且評價轉化植物的后代植物的環(huán)境脅迫耐受性并選擇具有顯著改善的環(huán)境脅迫耐受性的株系。這里，編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的選自第一組的基因實例是由 At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、 At2g33080、At2g32660, At2g33050和At2g33060所詳述的基因和功能上與其等同的基因。 特別優(yōu)選地，選自第一組的基因是選自由At2g25440、At2g32680、At3g24900, At3g25020、 At3g25010、At2g33020和At2g33080所詳述的基因中的基因和功能上與其等同的基因。進一步優(yōu)選地，選自第一組的基因是選自由At2g33020和At2g33080所詳述的基因中的基因和功能上與其等同的基因。特別優(yōu)選地，編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的選自第一組的基因編碼任一種以下(a)至(c)的蛋白質(a)包含SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列的蛋白質；(b)蛋白質，其包含相對于SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣活性，和(c)蛋白質，其由嚴格條件下雜交至包含與SEQ ID NO 1中所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸編碼并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣活性。此外，編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第二組的基因實例包括由 At3g28450、Atlg27190和Atlg69990所詳述的基因和功能上與其等同的基因。特別優(yōu)選地， 選自第二組的基因的實例包括選自由Atlg27190和Atlg69990所詳述的基因組成的組中的基因和功能上與其等同的基因。特別優(yōu)選地，編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第二組的基因是編碼以下蛋白質(a)至(c)中任一種的基因(a)包含SEQ ID NO 4中所示氨基酸序列的蛋白質；(b)蛋白質，其包含相對于SEQ ID NO :4中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性，和(c)蛋白質，其由嚴格條件下雜交至包含與SEQ ID NO :3中所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸編碼并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性。另外，編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第三組的基因實例包括由 At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480 和 At5g39390 所詳述的基因和功能上與其等同的基因。選自第三組的基因的特別優(yōu)選的實例包括由At3g47110、At5g20480 和At5g39390所詳述的基因和功能上與其等同的基因。選自第三組的基因的進一步優(yōu)選的實例包括由At5g20480和At5g39390所詳述的基因和功能上與其等同的基因。特別優(yōu)選地，編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第三組的基因是編碼以下蛋白質(a)至(c)中任一種的基因(a)包含SEQ ID NO 6中所示氨基酸序列的蛋白質；(b)蛋白質，其包含相對于SEQ ID NO :6中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性，和
(c)蛋白質，其由嚴格條件下雜交至包含與SEQ ID NO :5中所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸編碼并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性。本發(fā)明的植物的實例包括雙子葉植物如十字花科(Brassicaceae)的植物。十字花科植物的實例包括擬南芥(Arabidopsis thaliana)和油籽油菜。本發(fā)明的植物的其他實例包括單子葉植物如禾本科(Gramineae)的植物。禾本科植物的實例包括稻和甘蔗。發(fā)明的有利效果本發(fā)明的植物是就環(huán)境脅迫(如鹽脅迫)耐受性而言顯示出勝過野生型植物的顯著改善的植物。此外，根據(jù)用于賦予環(huán)境脅迫的本發(fā)明方法，目的植物可以就環(huán)境脅迫耐受性而言顯示出勝過野生型植物的顯著改善。另外，根據(jù)用于產(chǎn)生本發(fā)明植物的方法，可以產(chǎn)生就環(huán)境脅迫耐受性而言顯示出勝過野生型植物的顯著改善的植物。因此，例如，在使用本發(fā)明的情況下，可以顯著地擴展植物栽培條件，在生產(chǎn)植物本身時，可以增加生產(chǎn)量，并且可以降低植物生產(chǎn)的成本。附圖簡述[


圖1]
圖1是轉化植物和野生型植物(在具有高鹽濃度的培養(yǎng)基中)的發(fā)芽或生長狀態(tài)的照片，其中含有Atlg69990的ORF的片段已經(jīng)導入所述轉化植物中。[圖2]圖2是轉化植物和野生型植物(在具有高鹽濃度的培養(yǎng)基中)的發(fā)芽或生長狀態(tài)的照片，其中含有At5g39390的ORF的片段已經(jīng)導入所述轉化植物中。[圖3]圖3是轉化植物和野生型植物(在具有高鹽濃度的培養(yǎng)基中)的發(fā)芽或生長狀態(tài)的照片，其中含有At3g05650的ORF的片段已經(jīng)導入所述轉化植物中。[圖4]圖4是轉化植物和野生型植物(在具有高鹽濃度的培養(yǎng)基中)的發(fā)芽或生長狀態(tài)的照片，其中含有At2g33080的ORF的片段已經(jīng)導入所述轉化植物中。[圖5]圖5是轉化植物和野生型植物(在具有高鹽濃度的培養(yǎng)基中)的發(fā)芽或生長狀態(tài)的照片，其中含有Atlg71830的ORF的片段已經(jīng)導入所述轉化植物中。實施方案描述以下，進一步詳細描述本發(fā)明。本發(fā)明的植物是已經(jīng)將下述基因導入其中的植物編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白(下文縮寫為LRR-RLP)的基因；編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶(下文縮寫為LRR-RLK)的基因或功能上與LRR-RLP基因或LRR-RLK基因等同的基因；或是其中內在的該基因的表達控制區(qū)已經(jīng)改變的植物。這種植物就環(huán)境脅迫耐受性而言顯示出勝過野生型植物的改善。本文所用的術語“環(huán)境脅迫”指鹽脅迫、高溫脅迫、干旱脅迫等。特別優(yōu)選地，賦予本發(fā)明植物的環(huán)境脅迫耐受性的類型是鹽脅迫耐受性。即，優(yōu)選地，本發(fā)明的植物就鹽脅迫耐受性而言顯示出勝過野生型植物的顯著改善。環(huán)境脅迫(如鹽脅迫)抗性的改善表明植物可以在其中存在造成野生型植物不可能或難以生長的環(huán)境脅迫的條件下生長。隨著外源靶基因導入植物中或改變目的植物中內在的該基因的表達控制區(qū)，可以顯著地增加靶基因的表達水平至比野生型植物更高的水平。此外，上文所述的LRR-RLP基因、LRR-RLK基因等可以在本發(fā)明植物的全部植物組織中表達。它也可以在至少一些植物組織中表達。這里，術語“植物組織”指植物器官如葉、莖、種子、根和花。此外，術語“表達控制區(qū)”在其含義上包括用于RNA聚合酶結合的啟動子區(qū)和用于不同轉錄因子結合的區(qū)域。為改變轉錄性控制區(qū)，優(yōu)選的是將例如內源轉錄性控制區(qū)中的啟動子區(qū)替換為可以比所述內源啟動子區(qū)更高表達的啟動子區(qū)。LRR-RLP 基因根據(jù)本發(fā)明，LRR-RLP基因包含編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的基因，其選自包括由At5g40170所述的基因(稱作At5g40170基因(這同樣適用于以下基因))、At2g25440 基因、At2g32680 基因、At3g24900 基因、At3g25020 基因、At3g25010 基因、 At2g33020 基因、At2g33080 基因、At2g3^60 基因、At2g33050 基因和 At2g33060 基因的第一組。本文中，術語“第一組”指由可以被評價為與At2g33080基因在功能上等同或相同的基因的組構成的組，其中所述基因以如以下實施例中所述的方式導入植物中，從而改善植物中的鹽脅迫耐受性?？梢允褂美鏢ALAD數(shù)據(jù)庫搜索或鑒定可以被評價為與At2g33080 基因在功能上等同或相同的基因的組。更具體地，對于擬南芥而言，第一組中所包括的LRR-RLP基因的實例是At5g40170 基因、At2g25440 基因、At2g32680 基因、At3g24900 基因、At3g25020 基因、At3g25010 基因、At2g33020 基因、At2g33080 基因、At2g32660 基因、At2g33050 基因和 At2g33060 基因。根據(jù)本發(fā)明，導入選自以上組的基因中的至少一個基因或改變內在的該基因的表達控制區(qū)。特別地，用于基因導入或改變表達控制區(qū)的本發(fā)明靶基因優(yōu)選地是At2g25440基因、At2g32680 基因、At3g24900 基因、At3g25020 基因、At3g25010 基因、At2g33020 基因或 At2g33080基因，并且更優(yōu)選地是At2g33020基因或At2g33080基因。根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選導入At2g33080基因或改變內源性At2g33080基因的表達控制區(qū)。作為實例，At2g33080基因的編碼區(qū)的核苷酸序列在SEQ ID NO 1中顯示并且由At2g33080基因編碼的蛋白質的氨基酸序列在SEQ ID NO :2中顯示。此外，在SEQ ID NOS :24、26、28、30、32、34、36、38、40和42中分別顯示以下基因的編碼區(qū)的核苷酸序列 At5g40170 基因、At2g25440 基因、At2g32680 基因、At3g24900 基因、At3g25020 基因、 At3g25010 基因、At2g33020 基因、At2g32660 基因、At2g33050 基因和 At2g33060 基因。在 SEQ ID NOS :25、27、四、31、33、35、37、39、41和43中顯示所編碼蛋白質的氨基酸序列。此外，根據(jù)本發(fā)明，可以導入功能上與擬南芥來源的上述LRR-RLP基因如 At2g33080基因等同的基因或可以改變內在的該基因的表達控制區(qū)。這里，術語“功能上等同的基因”指編碼LRR-RLP的基因，其包含于所述第一組中并且從非擬南芥屬生物獲得。不具體地限制功能上等同的上述基因。可以通過檢索含有多種生物的基因序列的數(shù)據(jù)庫鑒定這種基因。具體而言，例如，使用SEQ ID NO :1中所示的核苷酸序列或SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列作為查詢序列，檢索DDBJ/EMBL/GenBank國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫或SWISS-PR0T數(shù)據(jù)庫。因而，可以在數(shù)據(jù)庫中輕易地檢索到或鑒定靶基因。這里，不限制非擬南芥屬生物。然而，其一個實例是稻。具體而言，功能上等同的基因的一個實例是來自稻的0s01g0132100基因。此外，來自非擬南芥屬或非稻植物的功能上等同的基因的實例是源自卷心菜(甘藍(Brassica oleracea))的基因(UniProt數(shù)據(jù)庫登錄號ACB59218)。在SEQ ID NO :7中顯示0s01g0132100基因的編碼區(qū)的核苷酸序列。在SEQ ID NO :8中顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。在SEQ ID NO :9中顯示 ACB59218基因的編碼區(qū)的核苷酸序列。在SEQ ID NO :10中顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。
此外，根據(jù)本發(fā)明，LRR-RLP基因不限于包含SEQ ID NOS :1、7、9、24、26、28、30、
32、34、36、38、40和 42 中所示的核苷酸序列并且編碼 SEQ ID NOS :2、8、10、25、27、29、31、
33、35、37、39、41和43中所示氨基酸序列的上述LRR-RLP基因。因而，LRR-RLP基因可以是這樣的基因，其含有相對于 SEQ ID NOS :2、8、10、25、27、29、31、33、35、37、39、41 和 43 中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入并且作為LRR-RLP基因發(fā)揮作用。這里，術語“多個氨基酸”指例如1至20個、優(yōu)選地1至10個、更優(yōu)選地1至7 個、進一步優(yōu)選地1至5個并且特別優(yōu)選地1至3個氨基酸。此外，可以通過用本領域已知的技術改變編碼上述LRR-RLP基因的核苷酸序列開展氨基酸缺失、置換或添加?？梢酝ㄟ^已知的技術如Kunkel法或缺口雙鏈體法(Gapped duplex method)或基于其的方法，將突變導入核苷酸序列中。例如，以使用位點定向誘變(例如，Mutant-K或Mutant-G ( 二者均為TAKARA Bio的商標名稱)等的誘變試劑盒或LA PCR體外誘變系列試劑盒(商品名稱， TAKARA Bio)導入突變。另外，誘變方法可以是使用由EMS(甲磺酸乙酯)、5_溴尿嘧啶、 2-氨基嘌呤、羥胺、N-甲基-N’ -硝基-N亞硝基胍或其他致癌性化合物代表的化學突變劑的方法，或包括通常使用X射線、α射線、β射線、Y射線、離子束等的輻射處理或紫外 (UV)處理的方法。另外，LRR-RLP基因可以是與包含SEQ ID NOS :1、7和9中所示核苷酸序列并且編碼 SEQ ID NOS :2、8、10、25、27、29、31、33、35、37、39、41 和 43 中所示氨基酸序列的 LRR-RLP 基因同源的基因。這里，術語“同源基因”通常指已經(jīng)從共同祖先基因進化上分化的基因， 包括2個類型物種的同源基因(直向同源物)和因相同物種內部發(fā)生的重疊分支所產(chǎn)生的同源基因(旁系同源物)。換句話說，以上術語“功能上等同的基因”指同源基因如直向同源物或旁系同源物。另外，以上術語“功能上等同的基因”也可以指不從共同基因進化，但是單純具有類似功能的基因。功能與包含SEQ ID NOS :1、7、9、24、洸、28、30、32、34、36、38、40 和 42 中所示核苷酸序列并且編碼SEQ ID NOS :2、8、10、25、27、四、31、33、35、37、39、41和43中所示氨基酸序列的LRR-RLP基因相似的基因的實例包括編碼具有與上述這些氨基酸序列具有70%或更多、優(yōu)選80%或更多、更優(yōu)選90%或更多并且最優(yōu)選95%或更多的相似性的氨基酸序列并且具有LRR-RLP活性的蛋白質的基因。這里，相似性的值指可以基于默認設置，使用安裝有 BLAST (基本局部比對檢索工具)程序的計算機和含有基因序列信息的數(shù)據(jù)庫找到的值。另外，當植物基因組信息仍未闡明時，可以通過以下方式鑒定具有與包含SEQ ID NOS :1、7、9、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42 中所示核苷酸序列并且編碼 SEQ ID NOS 2、8、10、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43中所示氨基酸序列的LRR-RLP基因相似的功能的基因從目的植物提取基因組或構建目的植物的cDNA文庫并且隨后分離在嚴格條件下與包含SEQ ID NOS :1、7、9、24、洸、28、30、32、34、36、38、40和42中所示核苷酸序列的 LRR-RLP基因的至少某些部分雜交的基因組區(qū)域或cDNA。這里，術語“嚴格條件”指特異性雜合體形成，但是非特異性雜合體從不形成的條件。例如，此類條件包括在45°C用6x SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)雜交，隨后在50°C至65°C用0. 2-lx SSC和0. 1 % SDS洗滌。備選地，此類條件包括在65°C至70°C用Ix SSC雜交，隨后在65°C至70°C用0. 3xSSC洗滌。雜交可以通過常規(guī)的已知方法如 J. Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual, 第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory (1989)中所述的方法進行。
LRR-RLK 基因根據(jù)本發(fā)明，LRR-RLK基因包括編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因，并且選自包含At3g28450基因、Atlg27190基因和Atlg69990基因的第二組或包含 At3g47570 基因、At3g47580 基因、At3g47090 基因、At3g47110 基因、At5g20480 基因和 At5g39390基因的第三組。這里，術語“第二組”指由可以被評價為與Atlg69990基因在功能上等同或相同的基因的組構成的組，其中所述基因以如以下實施例中所述的方式導入植物中，從而可以改善植物中的鹽脅迫耐受性。此外，術語“第三組”指由可以被評價為與Ag5g39390基因在功能上等同或相同的基因的組構成的組，其中所述基因以如以下實施例中所述的方式導入植物中，從而改善植物中的鹽脅迫耐受性。可以使用例如SALAD數(shù)據(jù)庫搜索或鑒定可以被評價為與Atlg69990基因或Ag5g39390基因在功能上等同或相同的基因的組。更具體地，包含于第二組中的擬南芥LRR-RLK基因的實例是At3g^450基因、 Atlg27190基因和Atlg69990基因。根據(jù)本發(fā)明，導入選自以上組的基因中的至少一個基因或改變內在的該基因的表達控制區(qū)。特別地，用于基因導入或改變表達控制區(qū)的靶基因優(yōu)選地是Atlg27190基因或Atlg69990基因。根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選導入Atlg69990基因或改變內源性Atlg69990基因的表達控制區(qū)。作為實例，Atlg69990基因的編碼區(qū)的核苷酸序列在SEQ ID NO 3中顯示并且由 Atlg69990基因編碼的蛋白質的氨基酸序列在SEQ ID NO 4中顯示。更具體地，包含于第三組中的擬南芥LRR-RLP基因的實例是At3g47570基因、 At3g47580 基因、At3g47090 基因、At3g47110 基因、At5g20480 基因和 At5g39390 基因。根據(jù)本發(fā)明，導入選自以上組的基因中的至少一個基因或改變內在的該基因的表達控制區(qū)。 特別地，用于基因導入或改變表達控制區(qū)的靶基因優(yōu)選地是At3g47110基因、At5g20480基因或At5g39390基因，并且更優(yōu)選地是At5g20480基因或At5g39390基因。根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選導入At5g39390基因或改變內源性At5g39390基因的表達控制區(qū)。作為實例，At5g39390基因的編碼區(qū)的核苷酸序列在SEQ ID NO 5中顯示并且由 At5g39390基因編碼的蛋白質的氨基酸序列在SEQ ID NO 6中顯示。此外，根據(jù)本發(fā)明，可以導入功能上與擬南芥來源的上述LRR-RLK基因如 Atlg69990基因或At5g39390基因等同的基因或可以改變內在的該基因的表達控制區(qū)。這里，術語“功能上等同的基因”指編碼LRR-RLK的基因，其包含于所述第二或第三組中并且從非擬南芥屬生物獲得。不具體地限制功能上等同的上述基因?？梢酝ㄟ^檢索含有多種生物的基因序列的數(shù)據(jù)庫鑒定這種基因。具體而言，例如，使用SEQ ID NO :3或5中所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :4或6中所示的氨基酸序列作為查詢序列，檢索DDBJ/EMBL/GenBank國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫或SWISS-PR0T數(shù)據(jù)庫。因而，可以在數(shù)據(jù)庫中輕易地檢索到或鑒定靶基因。這里，不限制非擬南芥屬生物。然而，其一個實例是稻。具體而言，Atlg69990基因的功能上等同的基因的一個實例是來自稻的0s04g0487200基因。此外，來自非擬南芥屬或非稻植物的Atlg69990基因的功能上等同基因的實例包括源自西加云杉(Sitka Spruce) (北美云杉(Picea sitchensis))的基因(UniProt數(shù)據(jù)庫登錄號ABR16721)和源自歐洲葡萄(Vitis vinifera)的基因(UniProt 數(shù)據(jù)庫登錄號 CA014859)。
12
在SEQ ID NO :11中顯示0s04g0487200基因的編碼區(qū)的核苷酸序列。在SEQ ID NO 12中顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。在SEQ ID NO 13中顯示ABR16721基因的編碼區(qū)的核苷酸序列。在SEQ ID NO :14中顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。 在SEQ ID NO 15中顯示由CA014859基因的編碼區(qū)編碼的蛋白質的氨基酸序列。此外，At5g39390基因的上述功能上等同基因的實例包括來自稻的0s02g0215700 基因和02g0215500基因。另外，來自非擬南芥屬或非稻植物的At5g39390基因的功能上等同基因的實例包括源自歐洲葡萄的基因(UniProt數(shù)據(jù)庫登錄號CAN83822和CA041339)。在SEQ ID NO 16中顯示0s02g0215700基因的編碼區(qū)的核苷酸序列。在SEQ ID NO 17中顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。在SEQ ID NO :18中顯示0s02g0215500 基因的編碼區(qū)的核苷酸序列。在SEQ ID NO :19中顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。在SEQ ID NO :20中顯示CAN83822基因的編碼區(qū)的核苷酸序列。在SEQ ID NO :21中顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。在SEQ ID N0:22中顯示CA041339基因的編碼區(qū)的核苷酸序列。在SEQ ID NO :23中顯示由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。此外，根據(jù)本發(fā)明，LRR-RLK基因不限于包含SEQ ID NOS :3、5、11、13、16、18、20和 22中所示的核苷酸序列并且編碼SEQ ID NOS :4、6、12、14、15、17、19、21和23中所示氨基酸序列的上述LRR-RLK基因。因而，LRR-RLK基因可以是這樣的基因，其含有相對于SEQ ID NOS :4、6、12、14、15、17、19、21和23中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入并且作為LRR-RLK基因發(fā)揮作用。這里，術語“多個氨基酸”指例如1至20 個、優(yōu)選地1至10個、更優(yōu)選地1至7個、進一步優(yōu)選地1至5個并且特別優(yōu)選地1至3個氨基酸。此外，可以通過用本領域已知的技術改變編碼上述LRR-RLK基因的核苷酸序列開展氨基酸缺失、置換或添加。也就是說，可以使用在關于上述“LRR-RLP基因”的段落中描述的方法。此外，LRR-RLK基因可以是在關于“LRR-RLP基因”的上文段落中描述的同源基因。 LRR-RLK基因的實例包括編碼具有與SEQ ID NOS :4、6、12、14、15、17、19、21和23中所示的氨基酸序列具有70 %或更多、優(yōu)選80 %或更多、更優(yōu)選90 %或更多并且最優(yōu)選95 %或更多的相似性的氨基酸序列并且具有LRR-RLK活性的蛋白質的基因。本文中，術語“相似性”具有在關于“LRR-RLP基因”的上文段落中描述的相同含義。另外，如關于“LRR-RLP基因”的上文段落中所述，可以通過以下方式鑒定LRR-RLK 基因從目的植物提取基因組或構建目的植物的eDNA文庫并且分離在嚴格條件下與包含 SEQ ID NOS :3、5、11、13、16、18、20和22中所示核苷酸序列的LRR-RLK基因的至少某些部分雜交的基因組區(qū)域或eDNA。這里，術語“嚴格條件”具有在關于“LRR-RLP基因”的上文段落中描述的相同含義。隨著導入第一組所包括的LRR-RLP基因、第二組所包括的LRR-RLK基因或第三組所包括的LRR-RLK基因或者改變內在的該基因的表達控制區(qū)，本發(fā)明的植物是就環(huán)境脅迫 (如鹽脅迫)抗性而言顯示出勝過野生型植物的顯著改善的植物。用于將這種基因導入植物中的技術的實例是用于導入表達載體的技術，在所述表達載體中將上述外源基因置于能夠在該植物中引起表達的啟動子的控制下。用于改變內在的基因的表達控制區(qū)的技術的實例是用于改變目的植物中內源基因的啟動子的技術。優(yōu)選的實例是用于用于導入表達載體的技術，在所述表達載體中將以上基因置于能夠在目的植物中引起表達的啟動子的控制下。表汰載體構建表達載體以含有能夠在植物內部引起表達的啟動子和上述LRR-RLP基因或 LRR-RLK基因。就充當表達載體母體的載體而言，可以使用常規(guī)已知的多種載體。例如，可以使用質粒、噬菌體、粘粒等，并且可以根據(jù)所述載體導入的植物細胞和導入方法適當?shù)剡x擇這種載體。此類載體的具體的實例包括PBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、 pBluescriptSK和pBI載體。具體地，當用于將載體導入植物中的方法使用農(nóng)桿菌時，優(yōu)選地使用PBI雙元載體。此類pBI雙元載體的具體實例包括pBIG、pBmi9、pBI101、pBI121和 PBI221。不具體地限制本文待使用的啟動子，只要它能夠使上述基因在植物內部表達即可?？梢赃m宜地使用任何已知的啟動子。此類啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)、多種肌動蛋白基因啟動子、多種遍在蛋白基因啟動子、胭脂堿合酶基因啟動子、煙草raia基因啟動子、番茄核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶-氧化酶小亞基基因啟動子和油菜籽蛋白基因啟動子。這些啟動子當中，可以更優(yōu)選地使用花椰菜花葉病毒35S啟動子、 肌動蛋白基因啟動子或遍在蛋白基因啟動子。每種上述啟動子的使用能夠使任何基因在其導入植物細胞中時強烈表達。另外，也可以在本文使用具有在植物中引起部位特異性表達的功能的啟動子。就此類啟動子而言，可以使用常規(guī)已知的任何啟動子。當上述基因使用此類啟動子以部位特異性方式表達時，在其器官中表達以上基因的植物就環(huán)境脅迫耐受性而言顯示出勝過野生型植物的顯著改善。此外，除啟動子和以上基因之外，表達載體還可以含有其他DNA區(qū)段。不具體地限制這類其他DNA區(qū)段，并且其實例包括終止子、選擇標記、增強子和用于增強翻譯效率的核苷酸序列。另外，以上重組表達載體還可以具有T-DNA區(qū)域。T-DNA區(qū)域可以增強基因導入的效率，尤其當以上重組表達載體使用農(nóng)桿菌導入植物時。不具體地限制轉錄終止子，只要它具有作為轉錄終止位點的功能并且可以是任何已知的轉錄終止子。例如，具體而言，可以優(yōu)選地使用胭脂堿合酶基因的轉錄終止區(qū)(Nos 終止子)、花椰菜花葉病毒35S的轉錄終止區(qū)(CaMV35S終止子)等。它們當中，可以更優(yōu)選地使用Nos終止子。在以上重組載體的情況下，可以通過在適宜位置安置轉錄終止子防止合成過長轉錄物和強啟動子降低質粒在導入植物細胞后的拷貝數(shù)的現(xiàn)象。作為轉化體選擇標記，例如可以使用耐藥基因。此類耐藥基因的具體實例包括針對潮霉素、博來霉素、卡那霉素、慶大霉素、氯霉素的耐藥基因等。通過選擇可以在含有以上抗生素的培養(yǎng)基中生長的植物，能夠容易地選擇出轉化的植物。用于增加翻譯效率的核苷酸序列的實例是來自煙草花葉病毒的ω序列。將這種 ω序列設置在啟動子的非翻譯區(qū)(5' UTR)內，從而可以增加融合基因的翻譯效率。如此， 取決于目的，重組表達載體可以含有多種DNA區(qū)段。不具體地限制用于構建重組表達載體的方法。對于適當選擇的充當母體的載體， 可以按預定順序導入以上啟動子和以上基因并且如果需要，以上其他DNA區(qū)段。例如，將以上基因和啟動子(并且，如果需要，轉錄終止子等)連接以構建表達盒，并且隨后可以將該盒導入載體中。在表達盒的構建中，例如，準備DNA區(qū)段的切割位點以具有彼此互補的突出
14末端并且隨后用連接酶進行反應，這使得指定DNA區(qū)段的順序成為可能。此外，當表達盒含有終止子時，可以將多個DNA區(qū)段從上游按以下順序設置啟動子、以上基因和終止子。另夕卜，也不具體地限制用于構建表達載體的試劑(即，限制酶、連接酶等的類型)。因而，可以適當?shù)剡x擇并且使用市售試劑。另外，不具體地限制用于復制以上表達載體的方法(產(chǎn)生方法)，并且可以在本文中使用常規(guī)已知的復制方法。通常，此類表達載體可以在作為宿主的大腸桿菌 (Escherichia coli)中復制。此時，可以根據(jù)載體的類型選擇大腸桿菌的優(yōu)選類型。MiL通過一般轉化方法將上述的表達載體導入目的植物中。不具體地限制用于將表達載體導入植物細胞中的方法(轉化方法)?？梢愿鶕?jù)植物細胞使用常規(guī)已知的適宜導入方法。具體而言，例如，可以使用采用農(nóng)桿菌的方法或涉及直接導入植物細胞中的方法。就使用農(nóng)桿菌的方法而言，例如可以使用在Bechtold，Ε.，Ellis, J.和Pelletier， G. (1993)In Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants (通過浸潤成體擬南芥植物的植物內農(nóng)桿菌介導基因轉移法)· C. R.Acad. Sci. Paris ki. Vie，316，1194-1199 中描述的方法，或在 Zyprian E, Kado Cl,Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conj unction with a high-copy vir region helper plasmid (借助新微型T載體與高拷貝 vir 區(qū)輔助質粒組合的農(nóng)桿菌介導的植物轉化法)，Plant Molecular Biology, 1990,15 (2), 245-256中描述的方法。就用于將表達載體直接導入植物細胞的方法而言，可以使用微注射法、電穿孔法、 聚乙二醇法、粒子槍法、原生質體融合法、磷酸鈣法等。另外，當使用將DNA直接導入植物細胞的方法時，可以在本文中使用的DNA含有為表達靶基因所需的轉錄單位如啟動子和轉錄終止子，以及靶基因。在這種情況下，載體功能不是必需的。另外，可以在本文中使用沒有轉錄單位的只含有靶基因的蛋白質編碼區(qū)的 DNA,只要所述DNA整合至宿主的轉錄單位中并且隨后靶基因可以表達。將以上表達載體或不含有表達載體但含有靶基因的表達盒導入其中的植物細胞的實例包括植物器官如花、葉和根的每種組織、愈傷組織的細胞和懸浮培養(yǎng)的細胞。此時， 適宜的表達載體可以根據(jù)待產(chǎn)生的植物的類型構建，或可以事先構建通用表達載體并且隨后導入植物細胞中。不具體地限制導入表達載體的植物或換而言之，經(jīng)過改善以具有環(huán)境脅迫耐受性的植物。具體而言，可以通過誘導以上基因的表達而期望任何植物具有改善環(huán)境脅迫耐受性的效果。目的植物的實例包括但不限于雙子葉植物和單子葉植物如屬于十字花科、禾本科、茄科(Solanaceae)、豆科(Leguminosae)、楊柳科(Salicaceae)等的植物(見下文)。十字花科擬南芥、油籽油菜(蕪青(Brassica rapa)、歐洲油菜(Brassica napus) > (Brassica campestris)) > ^ M ( 1=t" M (Brassica oleracea var. capitata))、NapA(白菜(Brassica rapa var. pekinensis))、青菜(Brassica rapa var. chinensis)( iiWIIi^ft (Brassica rapa var. rapa)) >BfM^W (Brassica rapa var. hakabura) (potherb mustard) (Brassica rapa var. lancinifolia) (Komatsuna) (Brassica rapa var. peruviridis)、白菜(pak choi)(青菜(Brassica rapavar. chinensis))、白蘿卜(daikon)(蘿卜(Raphanus sativus))、日本辣根(山葵(Wasabia japonica))等。禾斗煙草(Nicotiana tabacum)、爺子(Solanum melongena)、馬鈴薯(Solaneum tuberosum)、番^5 (Lycopersicon lycopersicum)、辣椒(紅辣椒(Capsicum annuum)) >H 冬爺(petunia)等。豆科大豆(Glycine max)、豌豆(Pi sum sativum)、蠶豆(Vicia faba)、紫藤(多花紫藤(Wisteria f loribunda))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、鳥足三葉草(日本
(Lotus corniculatusvar. japonicus))(Phaseolus vulgaris)、紅豆(azuki
bean)(赤豆(Vigna angularis))、金合歡屬(Acacia)植物等。菊禾斗(Asteraceae)菊花(Chrysanthemum morifolium)、向日葵(Helianthus annuus)等。棕櫚科(Arecaceae)油棕櫚(油棕(Elaeisguineensis)、洲油棕櫚 (Elaeis oleifera))、椰子(Cocos nucifera)、海φ (Phoenix dactylifera)、巴西棕櫚 (Copernicia)等。(Anacardiaceae)( 7^^0W (Rhus succedanea))(Anacardium occidentale)、漆豐對(Toxicodendron vernicifluum)、芒果(Mangifera indica)、P可月t軍子 (Pistacia vera)等。P 禾4" (Cucurbitaceae) /R (胃/R (Cucurbita maxima) > /R (Cucurbita moschata) >0 !^ (Cucurbita pepo)、胃瓜(Cucumis sativus)、蛇瓜(snake gourd) ( ΞΕ /R (Trichosanthes cucumeroides))( 7Jn ^Ι^ (Lagenaria siceraria var. gourda))寸。薔薇科(Rosaceae)扁桃(Amygdalus communis)、玫瑰(薔薇屬(Rosa))、草莓 (草莓屬(Fragaria))、櫻桃(李屬(Prunus)、蘋果(Malus pumila var. domestica)等。石竹禾斗(Caryophyllaceae)(香石竹(Dianthus caryophyllus))等。楊柳科(Salicaceae)楊(毛果楊(Populus trichocarpa)、歐洲黑楊(Populus nigra)或歐洲山楊(Populus tremula))等。禾本科玉米(玉蜀黍 Gea mays))、稻(Oryza sativa)、大麥(Hordeum vulgare)、小麥(普通小麥(Triticum aestivum))、竹(剛竹屬(Phyllostachys))、甘 1 (Saccharum officinarum)、紫各良 1 草(象草(Pennisetum pupureum))、鹿茅(沙生蔗茅(Erianthus ravenae))、芒草(日本銀草)(Miscanthus virgatum)、高粱(高粱屬 (Sorghum))和柳枝稷(黍屬(Panicum))等。百合科(Liliaceae)郁金香(郁金香屬(Tulipa))、百合(百合屬(Li 1 ium))等。這些實例中，能充當生物燃料原料的能量作物如甘蔗、玉米、油籽油菜和向日葵可以是優(yōu)選的目標。可以通過改善能量作物的環(huán)境脅迫耐受性顯著地擴展相關能量作物的栽培地區(qū)和栽培條件。具體而言，甚至可以在野生型植物在環(huán)境因素(例如，平均溫度，土壤中鹽的濃度等)影響下不能生長的地區(qū)栽培能量作物。因而，可以降低生物燃料如生物乙醇、生物柴油、生物甲醇、生物二甲醚(bioDME)、bioGTL(BTL)和生物丁醇的成本。另外，如上文所述，可以從多種植物分離并且使用可以用于本發(fā)明中的LRR-RLP 基因和LRR-RLK基因?？梢愿鶕?jù)就環(huán)境脅迫耐受性而言待改善的目的植物的類型，適當?shù)剡x擇并且使用此類LRR-RLP基因和LRR-RLK基因。具體而言，當目的植物是單子葉植物時， 優(yōu)選地導入已經(jīng)從單子葉植物分離的LRR-RLP基因或LRR-RLK基因。特別地，當目的植物是稻時，優(yōu)選地導入源自稻的LRR-RLP基因(SEQ ID NO 7)或LRR-RLK基因(SEQ ID NO: 11、16 或 18)。此外，在本發(fā)明中，甚至目的植物是單子葉植物時，可以導入源自雙子葉植物的 LRR-RLP基因或LRR-RLK基因。具體而言，例如，可以將源自擬南芥的LRR-RLP基因或 LRR-RLK基因不僅導入雙子葉植物中，還導入劃分為單子葉植物的多種植物中。其他步驟和方法在以上轉化后，可以通過常規(guī)已知的方法進行從植物中選擇適當?shù)霓D化體的步驟。不具體地限制這種選擇方法。例如，可以基于耐藥性如潮霉素抗性做出選擇。備選地， 在轉化體生長后，可以選擇作為整體或在其任意器官或組織中具有顯著改善的環(huán)境脅迫耐受性的轉化體。另外，可以從通過根據(jù)常規(guī)方法的轉化獲得的轉化植物來獲得后代植物?；诃h(huán)境脅迫耐受性選擇已經(jīng)將LRR-RLP基因或LRR-RLK基因導入其中的仍保留性狀的后代植物。因此，可以產(chǎn)生因為具有以上性狀而能夠顯示改善的環(huán)境脅迫耐受性的穩(wěn)定植物株系。 另外，可以從轉化的植物或其后代植物獲得植物細胞或繁殖材料，如種子、果實、莖干、愈傷組織、塊莖、切穗(cut ear)或切塊(lump)?？梢曰诖祟惒牧蠌闹写罅慨a(chǎn)生因為具有以上性狀而能夠顯示改善的環(huán)境脅迫耐受性的穩(wěn)定植物株系。此外，本發(fā)明的植物可以包括包含成體植物、植物細胞、植物組織、愈傷組織和種子中至少任一者的物質。即，根據(jù)本發(fā)明，處于允許其最終生長以變成植物的狀態(tài)下的任何物質可以視為植物。此外，植物細胞包括多種形式的植物細胞。此類植物細胞的實例包括懸浮培養(yǎng)的細胞、原生質體和葉切片。作為此類植物細胞增殖/分化的結果，可以獲得植物。 此外，可以根據(jù)植物細胞的類型，通過常規(guī)已知的方法從植物細胞中繁殖出植物。如上文所述，根據(jù)本發(fā)明，可以提供下述植物，隨著向其中導入LRR-RLP基因或 LRR-RLK基因或者改變其中內在的該基因的表達控制區(qū)，所述植物就環(huán)境脅迫(如鹽脅迫) 耐受性而言顯示出勝過野生型植物的改善。
實施例下文參考以下實施例更詳細地描述本發(fā)明，但是本發(fā)明的技術范圍不限于此。[實施例1]1.材料和方法1-1.實驗材料作為實驗材料，使用擬南芥突變體的種子(活化標簽T-DNA株系Weigel T-DNS 株系，總計20072個株系)。此外，從諾丁漢擬南芥保藏中心(Nottingham Arabidopsis Stock Centre，NASC)購買種子。關于用作實驗材料的種子，可以參考Weigel，D.等人，Plant Physiol. ，122，1003-1013(2000)。1-2.方法1-2-1.耐鹽突變體的選擇將狗丨861 T-DNA株系的種子無菌播種在含有125mM或150mM NaCl的改良MS瓊脂(1%)培養(yǎng)基[B5培養(yǎng)基中的維生素，10g/l蔗糖和8g/L瓊脂(細菌培養(yǎng)基用；Wako Pure Chemical hdustries有限公司)]上并且隨后在22°C在30-100 μ mol/m2/sec的照明下 (16小時明亮期/8小時黑暗期的循環(huán))下培養(yǎng)。播種后2至4周，選擇耐鹽候選突變體。 此外，關于 MS 培養(yǎng)基，見 Murashige，T.等人，(1962)Physiol. Plant.，15，473-497。另外， 關于 B5 培養(yǎng)基，見 Gamborg，0. L.等人，(1968) Experimental Cell Research，50，151-158。1-2-2. DNA 制備通過TAIL-PCR方法確定T-DNA插入至由此所選的耐鹽擬南芥株系的基因組中的位點。首先，從栽培的擬南芥植物收獲幼葉并且隨后在液氮冷凍下碾碎。使用DNA制備試劑盒(DNeasy Plant Mini Kit，QIAGEN)，根據(jù)隨同該試劑盒所包括的標準操作方案制備DNA。1-2-3. TAIL-PCR方法和T-DNA插入位點的推定設定三種類型的特異性引物TL1、TL2和TL3位于W^eigel T-DNA株系中所用的活化標簽載體(PSKI015 =GenBank登錄號AF187951)的左側T-DNA序列(T-DNA左邊界) 附近。在使用任意引物Pl和以下PCR反應液及反應條件下，進行TA1L-PCR(主編，Isao Shimamoto 禾口 Takuji Sasaki,新版，Plant PCR Experimental Protocols, 2000,第 83-89 頁，Shujunsha，東京，日本；Genomics 25，674-681，1995 ；Plant J.，8，457-463，1995)，從而擴增鄰近T-DNA的基因組DNA。引物TL1、TL2、TL3和Pl的具體序列如下。TLl 5' -TGC TTT CGC CAT TAA ATA GCG ACG G-3' (SEQ ID NO :44)TL2 5' -CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TG_3' (SEQ ID NO :45)TL3 5' -TCC CGG ACA TGA AGC CAT TTA C_3' (SEQ ID NO :46)Pl 5' -NGT CGA SffG ANA WGA A~3' (SEQ ID NO :47)此外，在SEQ ID NO :47 中，“η” 代表“a”、“g”、“c” 或“t”(存在位置1 和 11)， “S”代表“g”或“C”(存在位置7)，并且“W”代表“a”或“t”(存在位置8和13)。在表1和表2中分別顯示第一輪PCR反應液組成和反應條件。表 1
模板(基因組DNA) IOng
IOx PCR緩沖液(Takara Bio) 2微升
2.5 mM dNTPs (Takara Bio) 1.6微升
第一特異性引物(TL1: SEQ ID NO:44) 0.5 pmol 任意引物P1(SEQ ID NO:47) 100 pmol
TaKaRa Ex Taq (Takara Bio)_ 1.0單位_
總計20微升表2#1 :94°C (30 秒)/95°C (30 秒)#2 5 個循環(huán)94°C (30 秒)/65 V (30 秒)/72 V (1 分鐘)
#3 1個循環(huán)94°C (30秒)/25°C (1分鐘)—在3分鐘內升至72°C /72V (3分鐘)#4 :94°C (15 秒)/65 V (30 秒)/72 V (1 分鐘)，94 "C (15 秒)/68 "C (30 秒)/72 V (1 分鐘)，和15 個循環(huán)94°C (15 秒)/44°C (30 秒)/72 °C (1 分鐘)#5:72°C(3 分鐘)在表3和表4中分別顯示第二輪PCR反應液組成和反應條件。[表 3]
模板(第一輪PCR產(chǎn)物的50倍稀釋物)1微升
10 X PCR緩沖液(Takara Bio) 2微升
2.5 mM dNTPs (Takara Bio) 1.5微升
第二特異性引物(TL2: SEQIDNO:45) 5 pmol 任意引物 Pl(SEQff) NO:47) IOOpmolTaKaRa Ex Tag (Takara Bio)_ 0.8單位
總計20微升[表4]#6 :94 V (15 秒)/64 °C (30 秒)/72 V (1 分鐘)，94"C (15 秒)/64。C (30 秒)/72 °C (1 分鐘)，禾口12 個循環(huán)94°C (I5 秒)/440C (30 秒)/72 V (1 分鐘)#5:72°C(5 分鐘)在表5和表6中分別顯示第三輪PCR反應液組成和反應條件。[表 5]
模板(笫二輪PCR產(chǎn)物的50倍稀釋物) 1微升
IOx PCR緩沖液(Takara Bio)5 微升
2.5 mM dNTPs (Takara Bio)0.5微升第三特異性引物(TL3:SEQIDNO:46) IOpmol 任意引物 Pl(SEQff) NO:47) IOOpmol TaKaRa Ex Tag (Takara Bio)_1.5單位_
總計50微升[表 6]#7:20 個循環(huán)94 "C (30 秒)/44 "C (30 秒)/72 V (1 分鐘)#5:72°C(3 分鐘)
隨后，將第二和第三反應產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳，并且隨后證實擴增的存在或不存在和反應產(chǎn)物的特異性。另外，使用BigDye終止循環(huán)測序試劑盒Ver 3. 1 (Applied Biosystems)和特異性引物TL3，使第三擴增產(chǎn)物直接接受測序反應。然后，使用ABl PRISM 3100Genetic Analyzer (Applied Biosystems)測定核苷酸序列。作為結果，測定了 5種不同的核苷酸序列。具體而言，獲得了 538-bp序列信息、 311-bp序列信息、498-bp序列信息、633-bp序列信息和245_bp序列信息。獲得的序列在 SEQ ID NOS 48 至 52 中顯示。使用獲得的序列信息對擬南芥屬信息資源(TA^ :http //www, arabidopsis. org/)進行BLAST檢索。因而，發(fā)現(xiàn)T-DNA插入位點按以下順序存在在擬南芥染色體1基因[AGI (擬南芥基因組初始基因代碼)代碼Atlg69990]與基因[AGI (擬南芥基因組初始基因代碼)代碼Atlg70000]之間的位點；擬南芥染色體5基因[AGI (擬南芥基因組初始基因代碼)代碼At5g39400]的位點；擬南芥染色體3基因[AGI (擬南芥基因組初始基因代碼)代碼At3g05630]的位點；擬南芥染色體2基因[AGI (擬南芥基因組初始基因代碼) 代碼At2g33110]的位點；和在擬南芥染色體1基因[AGI (擬南芥基因組初始基因代碼) 代碼Atlg71810]與基因[AGI (擬南芥基因組初始基因代碼)代碼Atlg71820]之間的位點ο1-2-4.對激活的基因的預測基于在上文1-2-3中所揭示的各T-DNA插入位點(在Atlg69990與Atlg70000 之間的位點、At5g39400的位點、At3g05630的位點、At2g33110的位點和在Atlg71810與 Atlg71820之間的位點)附近IO-Kb范圍內存在的推定可讀框(ORF)基因的序列，預測激活
的基因。1-2-5.獲得預測的基因為了擴增含有在1-2-4中已經(jīng)預測被激活的LRR_RLK(富亮氨酸重復序列的受體樣蛋白激酶)基因(Atlg69990)、LRR-RLK(富亮氨酸重復序列的受體樣蛋白激酶)基因 (At5g39390)、LRR(富亮氨酸重復序列)蛋白基因(At3g05650)和LRR(富亮氨酸重復序列) 蛋白基因(At2g33080)的 ORF 區(qū)的片段，基于 TAIR(http://www, arabidopsis. orR/home. html)公開的序列信息，設計并且合成針對每個片段的PCR引物對(表7)。此外，如此設計這些引物，從而將導入表達載體中所需要的限制酶位點添加至每條引物(表7)。表權利要求
1.一種導入了至少一個基因或改變了內在的該基因的表達控制區(qū)的植物，其中所述基因選自編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的基因，其選自包含 At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、 At2g33080、At2g32660、At2g33050和At2g33060的第一組；編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因，其選自包含At3g^450、Atlg27190和Atlg69990的第二組；和編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因，其選自包含At3g47570、At3g47580、At3g47090、 At3g47110、At5g20480 和 At5g39390 的第三組。
2.根據(jù)權利要求1所述的植物，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的選自第一組的基因是選自由 At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、 At3g25010,At2g33020,At2g33080,At2g32660,At2g33050 和 At2g33060 組成的組中的至少一個基因或功能上與其等同的基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的植物，其中功能上與所述基因等同的基因是源自除擬南芥 (Arabidopsis thaliana)之外的生物的基因并且編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白。
4.根據(jù)權利要求1所述的植物，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的選自第一組的基因編碼任一種以下(a)至(c)的蛋白質(a)包含SEQID NO 2中所示氨基酸序列的蛋白質；(b)蛋白質，其包含相對于SEQID NO :2中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣活性，和(c)蛋白質，其由嚴格條件下雜交至包含與SEQID NO :1中所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸編碼并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣活性。
5.根據(jù)權利要求1所述的植物，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第二組的基因是選自由At3g28450、Atlg27190和Atlg69990組成的組中的至少一個基因或功能上與其等同的基因。
6.根據(jù)權利要求5所述的植物，其中功能上與所述基因等同的基因是源自除擬南芥之外的生物的基因并且編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶。
7.根據(jù)權利要求1所述的植物，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第二組的基因編碼任一種以下(a)至(c)的蛋白質(a)包含SEQID NO 4中所示氨基酸序列的蛋白質；(b)蛋白質，其包含相對于SEQID NO :4中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性，和(c)蛋白質，其由嚴格條件下雜交至包含與SEQID NO :3中所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸編碼并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性。
8.根據(jù)權利要求1所述的植物，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第三組的基因是選自由 At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480 和 At5g39390組成的組中的至少一個基因或功能上與其等同的基因。
9.根據(jù)權利要求8所述的植物，其中功能上與所述基因等同的基因是源自除擬南芥之外的生物的基因并且編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶。
10.根據(jù)權利要求1所述的植物，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第三組的基因編碼任一種以下(a)至(c)的蛋白質(a)包含SEQID NO 6中所示氨基酸序列的蛋白質；(b)蛋白質，其包含相對于SEQID NO :6中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性，和(c)蛋白質，其由嚴格條件下雜交至包含與SEQID NO :5中所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸編碼并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性。
11.用于賦予環(huán)境脅迫耐受性至植物的方法，包括導入至少一個導入基因或改變內在的該基因的表達控制區(qū)，其中所述基因選自編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的基因，其選自包含 At5g40170、At2g25440, At2g32680, At3g24900、At3g25020、At3g25010、 At2g33020、At2g33080、At2g32660、At2g33050 和 At2g33060 的第一組；編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因，其選自包含At3g^450、Atlg27190和Atlg69990的第二組； 和編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因，其選自包含At3g47570、At3g47580、 At3g47090、At3g47110、At5g20480 和 At5g39390 的第三組。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的選自第一組的基因是選自由 At5g40170、At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、 At3g25010,At2g33020,At2g33080,At2g32660,At2g33050 和 At2g33060 組成的組中的至少一個基因或功能上與其等同的基因。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中功能上與所述基因等同的基因是源自除擬南芥之外的生物的基因并且編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白。
14.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的選自第一組的基因編碼任一種以下(a)至(c)的蛋白質(a)包含SEQID NO 2中所示氨基酸序列的蛋白質；(b)蛋白質，其包含相對于SEQID NO :2中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣活性，和(c)蛋白質，其由嚴格條件下雜交至包含與SEQID NO :1中所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸編碼并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣活性。
15.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第二組的基因是選自由At3g28450、Atlg27190和Atlg69990組成的組中的至少一個基因或功能上與其等同的基因。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中功能上與所述基因等同的基因是源自除擬南芥之外的生物的基因并且編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶。
17.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第二組的基因編碼任一種以下(a)至(c)的蛋白質(a)包含SEQID NO 4中所示氨基酸序列的蛋白質；(b)蛋白質，其包含相對于SEQID NO :4中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性，和(c)蛋白質，其由嚴格條件下雜交至包含與SEQID NO :3中所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸編碼并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性。
18.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第三組的基因是選自由 At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480 和 At5g39390組成的組中的至少一個基因或功能上與其等同的基因。
19.根據(jù)權利要求18所述的方法，其中功能上與所述基因等同的基因是源自除擬南芥之外的生物的基因并且編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶。
20.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第三組的基因編碼任一種以下(a)至(c)的蛋白質(a)包含SEQID NO 6中所示氨基酸序列的蛋白質；(b)蛋白質，其包含相對于SEQID NO :6中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性，和(c)蛋白質，其由嚴格條件下雜交至包含與SEQID NO :5中所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸編碼并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性。
21.用于產(chǎn)生植物的方法，所述方法包括步驟制備導入了至少一個基因或改變了內在的該基因的表達控制區(qū)的轉化植物，其中所述基因選自編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的基因，其選自包含At5g40170、 At2g25440、At2g32680、At3g24900、At3g25020、At3g25010、At2g33020、At2g33080、 At2g32660、At2g33050和At2g33060的第一組；編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因，其選自包含At3g^450、Atlg27190和Atlg69990的第二組；和編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的基因，其選自包含At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、 At5g20480 和 At5g39390 的第三組；和評價轉化植物的后代植物的環(huán)境脅迫耐受性以選擇具有顯著改善的環(huán)境脅迫耐受性的株系。
22.根據(jù)權利要求21所述的產(chǎn)生方法，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的選自第一組的基因是選自由 At5g40170、At2g25440、At2g3^80、At3g24900、At3g25020、 At3g25010,At2g33020,At2g33080,At2g32660,At2g33050 和 At2g33060 組成的組中的至少一個基因或功能上與其等同的基因。
23.根據(jù)權利要求22所述的產(chǎn)生方法，其中功能上與所述基因等同的基因是源自除擬南芥之外的生物的基因并且編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白。
24.根據(jù)權利要求21所述的產(chǎn)生方法，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣蛋白的選自第一組的基因編碼任一種以下(a)至(c)的蛋白質(a)包含SEQID NO 2中所示氨基酸序列的蛋白質；(b)蛋白質，其包含相對于SEQID NO :2中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣活性，和(c)蛋白質，其由嚴格條件下雜交至包含與SEQID NO :1中所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸編碼并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣活性。
25.根據(jù)權利要求21所述的產(chǎn)生方法，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第二組的基因是選自由At3g28450、Atlg27190和Atlg69990組成的組中的至少一個基因或功能上與其等同的基因。
26.根據(jù)權利要求25所述的產(chǎn)生方法，其中功能上與所述基因等同的基因是源自除擬南芥之外的生物的基因并且編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶。
27.根據(jù)權利要求21所述的產(chǎn)生方法，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第二組的基因編碼任一種以下(a)至(c)的蛋白質(a)包含SEQID NO 4中所示氨基酸序列的蛋白質；(b)蛋白質，其包含相對于SEQID NO :4中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性，和(c)蛋白質，其由嚴格條件下雜交至包含與SEQID NO :3中所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸編碼并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性。
28.根據(jù)權利要求21所述的產(chǎn)生方法，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第三組的基因是選自由 At3g47570、At3g47580、At3g47090、At3g47110、At5g20480 和At5g39390組成的組中的至少一個基因或功能上與其等同的基因。
29.根據(jù)權利要求觀所述的產(chǎn)生方法，其中功能上與所述基因等同的基因是源自除擬南芥之外的生物的基因并且編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶。
30.根據(jù)權利要求21所述的產(chǎn)生方法，其中編碼具有富亮氨酸重復結構的受體樣激酶的選自第三組的基因編碼任一種以下(a)至(c)的蛋白質(a)包含SEQID NO 6中所示氨基酸序列的蛋白質；(b)蛋白質，其包含相對于SEQID NO :6中所示的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性，和(c)蛋白質，其由嚴格條件下雜交至包含與SEQID NO :5中所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸的多核苷酸編碼并且具有富亮氨酸重復結構和受體樣激酶活性。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明，將環(huán)境脅迫耐受性賦予植物或改善了植物的環(huán)境脅迫耐受性。將至少一個基因導入植物中，所述基因選自由選自第一組(包括At2g33080)的LRR-RLP基因、選自第二組(包括At1g69990)的LRR-RLK基因和選自第三組(包括At5g39390)的LRR-RLK基因所組成的組，或在植物中改變內在的該基因的表達控制區(qū)。
文檔編號A01H5/00GK102575262SQ201080046778
公開日2012年7月11日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權日2009年10月30日
發(fā)明者光川典宏, 大音德, 小川健一, 近藤聰 申請人:豐田自動車株式會社