專利名稱：百合無菌苗葉片直接誘導(dǎo)小鱗莖的繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)，具體地說，涉及百合(Liliumlongiflorum)的組織培 養(yǎng)和無菌苗葉片器官直接發(fā)生的方法。
背景技術(shù)：
近年來，百合以其花朵大型、色彩豐富、氣味芳香而被世界各國人民所喜愛，迅速 占據(jù)世界切花市場。其中，亞洲百合雜種系、東方百合雜種系、麝香百合雜種系為主要的切 花種類。切花生產(chǎn)所用種球依賴進(jìn)口這是一個(gè)不爭的事實(shí)。并且進(jìn)口百合鱗莖在第二年往 往會退化，所以每年均需要進(jìn)口。雖然百合的鱗片扦插和組織快繁的研究有很多報(bào)道，但是鱗片扦插容易引起種性 退化的問題，而組織快繁再生產(chǎn)中應(yīng)用較少，因?yàn)樵嚬苊缫圃詴r(shí)容易大量死亡。由于這些方 法還不能夠滿足百合種球生產(chǎn)需求，因此，需要探索新的百合鱗莖快繁方法，并且形成相關(guān) 的種球生產(chǎn)技術(shù)體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種百合無菌苗葉片直接誘導(dǎo)小鱗莖的繁殖方法及其應(yīng)用。百合無菌苗葉片直接誘導(dǎo)小鱗莖的繁殖方法，包括將無菌苗的葉盤接種至小鱗莖 誘導(dǎo)培養(yǎng)基，再將誘導(dǎo)的小鱗莖接種至小鱗莖膨大培養(yǎng)基，其中所述的小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基 為MS+6-BA2. Omg/L+NAAO. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 瓊脂 6. 25g/L，所述的小鱗莖膨 大培養(yǎng)基為=MS+活性炭(AC) 2. O 2. 5g/L+蔗糖90g/L+瓊脂6. 25g/L。其中，所述百合葉盤接種后進(jìn)行暗培養(yǎng)，所述小鱗莖接種至小鱗莖膨大培養(yǎng)基 后進(jìn)行光照培養(yǎng)，所述的光照條件為自然散射光2500 3000LUX加人工輔助光1500 2000Lux，光照時(shí)間為12h/d。本發(fā)明提供的百合無菌苗葉片直接誘導(dǎo)小鱗莖的繁殖方法，還包括制備百合無 菌苗，具體為將百合鱗片表面滅菌后接種至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，將誘 導(dǎo)的叢生芽的單芽接種至叢生芽增殖培養(yǎng)基，獲得大量無菌苗。其中所述的叢生芽誘 導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 瓊脂 6. 25g/L，或 MS+6-BA2. 0mg/L+2，4-D 0. 1 0. 5mg/L+蔗糖 25 35g/L+瓊脂 6. 25g/L，或MS+6-BA2. Omg/ L+IAA 0. lmg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 瓊脂 6. 25g/L,優(yōu)選為 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂6. 25g/L，其中所述的叢生芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BAl. 0 2. 5mg/L+NAA 0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 瓊脂 6. 25g/L,優(yōu)選為 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. 25g/L。本發(fā)明提供的百合無菌苗葉片直接誘導(dǎo)小鱗莖的繁殖方法可應(yīng)用與百合鱗莖的 快速繁殖。與傳統(tǒng)的百合鱗莖發(fā)生途徑相比較，葉片直接誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖的方法有以下優(yōu)
點(diǎn)
(1)在叢生芽誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，再次擴(kuò)大了誘導(dǎo)率，(一個(gè)單芽可以產(chǎn)生3 8個(gè)葉 片，每個(gè)葉片又可以產(chǎn)生ι 3個(gè)小鱗莖，)。因此，比傳統(tǒng)的叢生芽誘導(dǎo)小鱗莖誘導(dǎo)率提高 了 3 24倍。(2)縮短了鱗莖膨大的培養(yǎng)時(shí)間，傳統(tǒng)的單芽培養(yǎng)成小鱗莖需要較長的時(shí)間，而葉 片直接產(chǎn)生的小鱗莖，大小均勻、整齊一致，在膨大培養(yǎng)基上生長一個(gè)月后，即產(chǎn)生鱗片葉。(3)葉片直接產(chǎn)生的小鱗莖帶有較長的根，不需要專門的誘導(dǎo)生根階段。


圖1是鱗片接種45天后的誘導(dǎo)情況。圖2是鱗片誘導(dǎo)的不定芽繼代45天之后的生長情況。圖3是單芽誘導(dǎo)90天之后的生長情況。圖4 是葉盤在 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. 25g/L 的誘導(dǎo) 情況。圖5是誘導(dǎo)出的小鱗莖在MS+AC2. Og/L+蔗糖90g/L+瓊脂6. 25g/L接種一個(gè)月的 生長情況。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1百合鱗片誘導(dǎo)選取無病蟲害的購買自北京綠爾有限公司的‘西伯利亞’百合鱗 片，用洗潔精清洗后，在自來水下沖洗30min，用75 %酒精浸泡35s，無菌水沖洗兩次，再 用0. 升汞滅菌不同時(shí)間，即外層鱗片滅菌15min，中層鱗片滅菌12min，內(nèi)層鱗片滅菌 lOmin，無菌水沖洗4 5次，然后在無菌濾紙的培養(yǎng)皿中切塊備用。將上述表面滅菌的百合鱗片接種至MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 5mg/L ；MS+6-BA2. Omg/ L+NAA 0. lmg/L ；MS+6-BA2. 0mg/L+2，4_D 0. 5mg/L ；MS+6-BA2.0mg/L+2，4_D 0. lmg/L ； MS+6-BA2. 0mg/L+IAA0. lmg/L。其中，上述培養(yǎng)基中，蔗糖含量為30g/L，瓊脂含量為6. 25g/ L0結(jié)果表明，‘西伯利亞’外層鱗片采用升汞滅菌15min后，不定芽誘導(dǎo)率最高為 48. 56%，高于中層鱗片的39. 26%和內(nèi)層鱗片的28. 18%的不定芽誘導(dǎo)率。鱗片不同層數(shù)分化系數(shù)的比較在MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊 脂6.25g/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，‘西伯利亞’的中層鱗片的平均分化系數(shù)為5. 2，外層鱗片為 3. 0，內(nèi)層鱗片為2. 73。其中，平均分化系數(shù)是指每個(gè)已分化的鱗片所分化的不定芽的平均 數(shù)。將‘西伯利亞，鱗片接種至上述5種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中MS+6-BA2. 0mg/L+NAA 0. lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6. 25g/L的培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化率最高(圖1)，為42. 87%。將誘 導(dǎo)出的不定芽在上述培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代，不定芽繼續(xù)增殖(圖2)。實(shí)施例2將鱗片上分化出的叢生芽切割成單芽接種至下述八種培養(yǎng)基中A:MS+6-BAl. 0mg/L+NAA0. lmg/L ；
B:MS+6--BAl.0mg/L+NAA0.5mg/L
C:MS+6--BAl.5mg/L+NAA0.lmg/L
D:MS+6--BAl.5mg/L+NAA0.5mg/L
E:MS+6--BA2.0mg/L+NAA0.lmg/L
F:MS+6--BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L
G:MS+6--BA2.5mg/L+NAA0.lmg/L
H:MS+6--BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L。其中，上述培養(yǎng)基中，蔗糖含量為30g/L，瓊脂含量為6. 25g/L。在A培養(yǎng)基上叢生芽增長系數(shù)為2. 76，小苗長勢良好；在B培養(yǎng)基上叢生芽增長 系數(shù)為3. 17，小苗長勢較好；在C培養(yǎng)基上叢生芽增長系數(shù)為2. 97，小苗長勢差；在D培養(yǎng) 基上叢生芽增長系數(shù)為3. 96，小苗長勢良好；在E培養(yǎng)基上叢生芽增長系數(shù)為3. 20，小苗長 勢較好；在F培養(yǎng)基上叢生芽增長系數(shù)為4. 23，小苗長勢良好；在G培養(yǎng)基上叢生芽增長系 數(shù)為4. 13，小苗玻璃化；在H培養(yǎng)基上叢生芽增長系數(shù)為3. 12，小苗玻璃化。因此，從單芽分化系數(shù)和叢生芽的質(zhì)量來看，‘西伯利亞’在培養(yǎng)基MS+6-BA2. Omg/ L+NAA 0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6. 25g/L上分化系數(shù)達(dá)到4. 23，小苗長勢良好(圖3)。實(shí)施例3無菌苗葉片直接誘導(dǎo)小鱗莖培養(yǎng)基的篩選選取生長健壯的‘西伯利亞’無菌苗， 將葉片剪成3cm左右的葉盤，接種至以下4種培養(yǎng)基中，其中培養(yǎng)容器為培養(yǎng)皿MS+Pic (毒銹定)2. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. 25g/L ； MS+Pic (毒銹定)2. Omg/L+KTO. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. 25g/L ；MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. 25g/L ；MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. 25g/L。將接種過葉盤的培養(yǎng)皿置于紙盒子內(nèi)，再將紙盒子放置在完全黑暗的人工氣候箱 內(nèi)。整個(gè)過程中組培苗的培養(yǎng)溫度為20 23°C。其中，在培養(yǎng)基MS+Pic (毒銹定)2. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6. 25g/L上，單芽的誘 導(dǎo)率為 2. 77%,而培養(yǎng)基 MS+Pic (毒銹定)2. Omg/L+KTO. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. 25g/ L上，單芽誘導(dǎo)率為16. 16%。在培養(yǎng)基MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 6. 25g/L上，可以直接誘導(dǎo)出小鱗莖，但誘導(dǎo)率為14. 32%，在培養(yǎng)基MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6. 25g/L上小鱗莖誘導(dǎo)率達(dá)到29. 58 %，小鱗莖的誘導(dǎo)系數(shù)為 1 3個(gè)，并且在小鱗莖上直接生長出細(xì)弱而長的根(圖4)。實(shí)施例5將實(shí)施例4誘導(dǎo)獲得的小鱗莖切割下來，接種至膨大培養(yǎng)基MS+AC (活性炭)2. Og/ L+蔗糖90g/L+瓊脂6. 25g/L中，一個(gè)月后，鱗莖膨大速度較快，并且迅速分化出鱗片葉(圖 5)。若無特殊說明，上述培養(yǎng)過程中光照條件為自然散射光2500 3000LUX加人工輔 助光1500 2000Lux，光照時(shí)間為12h/d，培養(yǎng)溫度為20 23°C。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
百合無菌苗葉片直接誘導(dǎo)小鱗莖的繁殖方法，包括將百合無菌苗的葉盤接種至小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，再將誘導(dǎo)的小鱗莖接種至小鱗莖膨大培養(yǎng)基，其中所述的小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6 BA2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+蔗糖25～35g/L+瓊脂6.25g/L，所述的小鱗莖膨大培養(yǎng)基為MS+活性炭2.0～2.5g/L+蔗糖85～95g/L+瓊脂6.25g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. 25g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小鱗莖膨大培養(yǎng)基為MS+活性炭 2. Og/L+ 蔗糖 90g/L+ 瓊脂 6. 25g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葉盤接種至小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基后 進(jìn)行暗培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括制備所述的百合無菌苗，其步驟包括將百合鱗片表面滅菌后接種至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，將誘導(dǎo)的叢 生芽的單芽接種至叢生芽增殖培養(yǎng)基，獲得無菌苗，其中所述的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 瓊脂 6. 25g/L,或 MS+6-BA2. Omg/ L+2，4-D 0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 瓊脂 6. 25g/L,或 MS+6-BA2. 0mg/L+IAA 0. Img/ L+蔗糖25 35g/L+瓊脂6. 25g/L，其中所述的叢生芽增殖培養(yǎng)基為MS+6_BA1. 0 2. 5mg/ L+NAA 0. 1 0. 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 瓊脂 6. 25g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. 25g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的叢生芽增殖培養(yǎng)基為 MS+6-BA2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. 25g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的鱗片為外層鱗片。
9.權(quán)利要求1 8任一項(xiàng)所述的方法在百合鱗莖快速繁殖中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了百合(Lilium longiflorum)組培苗葉片直接誘導(dǎo)小鱗莖的快速繁殖方法，步驟為將百合無菌苗的葉盤接種至小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，再將誘導(dǎo)的小鱗莖接種至小鱗莖膨大培養(yǎng)基，其中所述的小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.25g/L，所述的小鱗莖膨大培養(yǎng)基為MS+活性炭2.0～2.5g/L+蔗糖90g/L+瓊脂6.25g/L。本發(fā)明的百合無菌苗葉片直接誘導(dǎo)小鱗莖的繁殖方法，一個(gè)葉盤能夠產(chǎn)生1～3個(gè)小鱗莖。鱗莖直接產(chǎn)生根的誘導(dǎo)率達(dá)到100％，與鱗片直接誘導(dǎo)叢生芽，再產(chǎn)生小鱗莖的過程相比，縮短了時(shí)間，簡化了步驟，為新發(fā)現(xiàn)的一條器官直接發(fā)生途徑。
文檔編號A01H4/00GK101971775SQ201010511389
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月18日
發(fā)明者孔瀅, 孫明, 張啟翔, 楊煒茹, 石晉芳, 程堂仁 申請人:北京林業(yè)大學(xué)