專利名稱：昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置以及土壤中昆蟲病原線蟲的分離方法及種群密度測量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種線蟲的分離與檢測裝置、分離方法以及種群密度測量方法。
背景技術(shù)：
昆蟲病原線蟲是一類專門寄生于土壤害蟲的微小動(dòng)物，它隸屬于動(dòng)物界，線 蟲門(Nematoda),側(cè)尾腺口綱(Secernentea)，圓線蟲目(Rhabditida)，斯氏線蟲科 (Steinernematidae)和異小桿線蟲科(Heterhabditidae)。這類線蟲的侵染期階段可以在 土壤中存活較長時(shí)間并能主動(dòng)搜尋對人類有害的昆蟲寄主，找到寄主后，它通過昆蟲的口 道、氣門或體壁鉆入昆蟲血液循環(huán)系統(tǒng)，然后通過釋放共生菌，使寄主昆蟲在24到48小時(shí) 內(nèi)死亡。國內(nèi)外科學(xué)工作者研究認(rèn)為，這類線蟲對人畜以及其它有益生物包括害蟲天敵等 均無任何不良影響，而且全世界各地區(qū)均有分布。利用昆蟲病原線蟲進(jìn)行以蟲治蟲可以使 農(nóng)民在無公害生產(chǎn)中減少農(nóng)藥用量，起到保護(hù)水質(zhì)和環(huán)境的作用。目前國內(nèi)外一些發(fā)達(dá)地 區(qū)越來越多地生產(chǎn)和使用這類生物進(jìn)行地下害蟲和鉆蛀性害蟲的防治。在應(yīng)用昆蟲病原線蟲進(jìn)行防治的過程中，有效地從當(dāng)?shù)赝寥乐蟹蛛x適合于地方生 態(tài)條件的線蟲品種和品系是成功防治害蟲的關(guān)鍵。此類工作目前是通過田間取回土樣后， 將土樣分裝在培養(yǎng)皿或塑料袋內(nèi)，然后放入大蠟螟(Galleriamellonella)等幼蟲進(jìn)行誘 集。這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要占用較大的空間，花費(fèi)大量時(shí)間來檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以上種種 因素限制了對該線蟲的野外搜尋范圍從而減少了分離機(jī)會(huì)。另外，在科技人員或植物保護(hù)工作者將該線蟲釋放到田間進(jìn)行防治某種害蟲后需 要跟蹤監(jiān)測線蟲在土壤中的存活情況以便決定下一次應(yīng)用的必要性、應(yīng)用時(shí)間及用量。這 一過程在以往和現(xiàn)在采用的方法如上述，所不同的是田間取樣勢必會(huì)破壞田間的作物。另 外在定量時(shí)采用大蠟螟誘集直至土樣中沒有線蟲為止要花費(fèi)很多時(shí)間，同時(shí)還要對被侵染 的大蠟螟逐頭解剖數(shù)蟲，此過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

發(fā)明內(nèi)容
本本發(fā)明的目的是解決目前昆蟲病原線蟲的分離方法及定量測量方法中，存在需 要采集土樣、解剖死蟲體、需時(shí)較長、破壞作物以及解剖大蠟螟導(dǎo)致的費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問題，提 供了一種昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置以及土壤中昆蟲病原線蟲的分離方法及種群密 度測量方法。昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置，它由采集管和捕捉管組成；所述采集管由采集 管上蓋、采集管壁和網(wǎng)罩組成，采集管壁為兩端開口的管狀結(jié)構(gòu)，采集管上蓋密封安裝在采 集管壁的上端，網(wǎng)罩的上端開口、下端封閉，網(wǎng)罩的上端開口處與采集管壁的下端封閉連 接，網(wǎng)罩的下端暴露在采集管壁外；所述捕捉管由捕捉管壁和無紡布條組成，捕捉管壁為上 端開口、下端封閉的管狀結(jié)構(gòu)，捕捉管壁的側(cè)壁上設(shè)有一個(gè)橫向長孔，無紡布條封閉安裝在 此長孔處；采集管壁的下端與捕捉管壁的上端插接在一起，且網(wǎng)罩置于捕捉管壁內(nèi)。
土壤中昆蟲病原線蟲的分離方法，它的過程如下
步驟A1、將安裝在一起的采集管和捕捉管拆離，然后將大蠟螟裝入采集管，然后在采集 管內(nèi)塞入棉球，使大蠟螟一直停留在網(wǎng)罩內(nèi)；
步驟A2、在待采集的土壤上打一個(gè)洞，在洞內(nèi)放入裝有大蠟螟的采集管； 步驟A3、48小時(shí)后，從洞中取回采集管，并在25°C下培養(yǎng)一天后，觀察是否有大蠟螟已 死亡；
步驟A4、利用WhiteTrap法對死亡的大蠟螟再進(jìn)一步培養(yǎng)七到十天，即可分離出昆蟲 病原線蟲。土壤中昆蟲病原線蟲的種群密度測量方法，它的過程如下
步驟B1、將安裝在一起的采集管和捕捉管拆離，然后將大蠟螟裝入采集管，然后在采集 管內(nèi)塞入棉球，使大蠟螟一直停留在網(wǎng)罩內(nèi)；在捕捉管內(nèi)裝清水至長孔處，然后將盛有清水 的捕捉管與裝有大蠟螟的采集管安裝在一起；
步驟B2、在土壤上打一個(gè)洞，然后將步驟B2中安裝好的捕捉管和采集管作為整體放入 洞中，其中采集管在上、捕捉管在下；
步驟B3、48小時(shí)后，從洞中取回安裝在一起的采集管和捕捉管，然后卸掉捕捉管，并將 捕捉管中的水吸出后，在顯微鏡下觀察水里的昆蟲病原線蟲的個(gè)數(shù)；
步驟B4、根據(jù)步驟B3中觀察到的昆蟲病原線蟲的個(gè)數(shù)，計(jì)算獲得土壤中昆蟲病原線蟲 的種群密度。本發(fā)明既不破壞作物的正常生長，又無需將土樣帶回實(shí)驗(yàn)室，且無需進(jìn)行大蠟螟 的解剖，可提高效率。


圖1為本發(fā)明的昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置中的采集管的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2 為本發(fā)明的昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置中的捕捉管的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為本發(fā)明的昆 蟲病原線蟲的分離與檢測裝置的采集管和捕捉管安裝在一起后的整體結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為 實(shí)施方式三中制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一結(jié)合圖1至圖3說明本實(shí)施方式，本實(shí)施方式的昆蟲病原線蟲 的分離與檢測裝置，它由采集管和捕捉管組成；所述采集管由采集管上蓋11、采集管壁12 和網(wǎng)罩13組成，采集管壁12為兩端開口的管狀結(jié)構(gòu)，采集管上蓋11密封安裝在采集管壁 12的上端，網(wǎng)罩13的上端開口、下端封閉，網(wǎng)罩13的上端開口處與采集管壁12的下端封 閉連接，網(wǎng)罩13的下端暴露在采集管壁12外；所述捕捉管由捕捉管壁21和無紡布條22組 成，捕捉管壁21為上端開口、下端封閉的管狀結(jié)構(gòu)，捕捉管壁21的側(cè)壁上設(shè)有一個(gè)橫向長 孔，無紡布條22封閉安裝在此長孔處；采集管壁12的下端與捕捉管壁21的上端插接在一 起，且網(wǎng)罩13置于捕捉管壁21內(nèi)。網(wǎng)罩13下端底部距采集管壁12的下端開口處的距離可為20毫米。捕捉管壁21的上端開口處與下端底部間的距離可為45毫米。捕捉管壁21的側(cè)壁上的長孔可為長16毫米、寬4毫米的長方形孔。
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所述長方形孔的上端邊緣與采集管壁12的下端邊緣之間的距離可為20毫米，長 方形孔的下端邊緣與捕捉管壁21的下端底部之間的距離可為21毫米。捕捉管壁21的下部可呈倒圓錐形。本實(shí)施方式的昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置，可由15毫升塑料離心管改造而 成，也可由廠家直接批量生產(chǎn)。將15毫升離心管由底部上量45毫米處切斷，然后在上部分的內(nèi)端嵌入一個(gè)由鐵 絲網(wǎng)做成的上面開口、下端帶底的網(wǎng)罩，網(wǎng)罩下端暴露于離心管外的部分為20毫米，此部 分作為采集管。切下的下部分先在由底部上量25毫米處向下開長方形口(4毫米xl6毫米)。然 后將此開口用普通無紡布封上即成捕捉管。將采集管和捕捉管安裝在一起就可以用于線蟲 的定量測定，野外采集時(shí)將捕捉管部分去掉就可用于定性測定和線蟲新品種的誘集分離。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式的土壤中昆蟲病原線蟲的分離方法，它基于實(shí)施方 式一中的昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置實(shí)現(xiàn)，它的過程如下
步驟A1、將安裝在一起的采集管和捕捉管拆離，然后將大蠟螟裝入采集管，然后在采集 管內(nèi)塞入棉球，使大蠟螟一直停留在網(wǎng)罩13內(nèi)；
步驟A2、在待采集的土壤上打一個(gè)洞，在洞內(nèi)放入裝有大蠟螟的采集管； 步驟A3、48小時(shí)后，從洞中取回采集管，并在25°C下培養(yǎng)一天后，觀察是否有大蠟螟已 死亡；
步驟A4、利用WhiteTrap法對死亡的大蠟螟再進(jìn)一步培養(yǎng)七到十天，即可分離出昆蟲 病原線蟲。在步驟A1中，放入采集管內(nèi)的大蠟螟可為多個(gè)。下面提供一個(gè)具體實(shí)施例
首先將安裝在一起的采集管和捕捉管拆離，然后打開采集管上蓋11，將2頭大蠟螟裝 入采集管的網(wǎng)罩13內(nèi)，然后將棉球塞進(jìn)采集管內(nèi)，使2頭大蠟螟一直停留在網(wǎng)罩13內(nèi)。其 中，所述網(wǎng)罩13由普通鐵絲網(wǎng)構(gòu)成。根據(jù)待采集地點(diǎn)的面積，準(zhǔn)備足夠數(shù)量的采集管(其中每只采集管內(nèi)各裝有2頭 大蠟螟)帶到待采集地點(diǎn)，在每一個(gè)采集點(diǎn)，用直徑約20毫米的方楞錐在土壤中打一個(gè)50 毫米深的洞，然后埋入3到5只采集管，且相互距離不小于50毫米。48小時(shí)后，取回所有采集管，在25°C下培養(yǎng)一天后，觀察是否有大蠟螟已被昆蟲 病原線蟲侵染后死亡。將死亡的大蠟螟利用WhiteTrap中進(jìn)一步培養(yǎng)，七到十天后即可分離出昆蟲病原 線蟲。WhiteTrap法是一種實(shí)驗(yàn)室利用活體昆蟲培養(yǎng)和收集昆蟲病原線蟲的方法。具體 方法和步驟如下
將被侵染的昆蟲(常用大蠟螟幼蟲)放置在倒置的并事先鋪好潮濕濾紙的小培養(yǎng)皿(直 徑=60mm)皿蓋內(nèi)；將上述皿蓋放置于大培養(yǎng)皿(直徑=100mm)內(nèi)，放好后在大培養(yǎng)皿內(nèi)加 水，水量以剛好覆蓋皿底為宜。蓋好大皿蓋；放25度恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)7天左右待發(fā)現(xiàn)水中出 現(xiàn)線蟲后將線蟲水收集并更換新水，每天采收一次知道水中停止出現(xiàn)線蟲為止。本實(shí)施方式可實(shí)現(xiàn)野外分離線蟲，或?qū)μ镩g某一位置是否有線蟲進(jìn)行定性檢測。由于檢測過程是在野外直接進(jìn)行，而無需將土樣帶回實(shí)驗(yàn)室，而且不需要解剖死蟲體，本實(shí) 施方式在一定時(shí)間內(nèi)可提高檢測效率。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式的土壤中昆蟲病原線蟲的種群密度測量方法，它基 于實(shí)施方式一中的昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置實(shí)現(xiàn)，它的過程如下
步驟B1、將安裝在一起的采集管和捕捉管拆離，然后將大蠟螟裝入采集管，然后在采集 管內(nèi)塞入棉球，使大蠟螟一直停留在網(wǎng)罩13內(nèi)；在捕捉管內(nèi)裝清水至長孔處，然后將盛有 清水的捕捉管與裝有大蠟螟的采集管安裝在一起；
步驟B2、在土壤上打一個(gè)洞，然后將步驟B2中安裝好的捕捉管和采集管作為整體放入 洞中，其中采集管在上、捕捉管在下；
步驟B3、48小時(shí)后，從洞中取回安裝在一起的采集管和捕捉管，然后卸掉捕捉管，并將 捕捉管中的水吸出后，在顯微鏡下觀察水里的昆蟲病原線蟲的個(gè)數(shù)；
步驟B4、根據(jù)步驟B3中觀察到的昆蟲病原線蟲的個(gè)數(shù)，計(jì)算獲得土壤中昆蟲病原線蟲 的種群密度。其中，步驟B4中所述的計(jì)算獲得土壤中昆蟲病原線蟲的種群密度的過程中，是利 用事先做好的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行的計(jì)算。土壤中昆蟲病原線蟲通過對寄主昆蟲釋放的二氧化碳的趨性來尋找寄主，根據(jù)這 一特性，首先人為定量的將不同濃度梯度的昆蟲病原線蟲均勻混入同一地塊的土壤中，然 后利用本發(fā)明裝置檢測昆蟲病原線蟲進(jìn)入裝置的數(shù)量。實(shí)踐已經(jīng)證明土壤混入的每平方厘 米的線蟲數(shù)和進(jìn)入本裝置的線蟲數(shù)成正比。利用這一相關(guān)關(guān)系即可建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的具體過程為
一、試驗(yàn)條件的優(yōu)化特定昆蟲病原線蟲施入量下，檢測時(shí)間、裝置間距離對昆蟲病原 線蟲進(jìn)入的影響，找到最佳檢測時(shí)間及最佳應(yīng)用距離；
二、在已優(yōu)化條件下，選擇7個(gè)不同的施用密度，其中包括實(shí)際應(yīng)用密度以及最大和最 小田間應(yīng)用密度，檢測線蟲進(jìn)入裝置的數(shù)量，利用這兩組數(shù)據(jù)則可建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。為使建立 的標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確可靠，試驗(yàn)在不同時(shí)間重復(fù)三次，最后取平均數(shù)建立最終的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用以下濃度梯度(1頭 /cm2、10 頭 /cm2、20 頭 /cm2、40 頭 /cm2、60 頭 /cm2、80 頭 / cm2)的線蟲混入土壤后利用本發(fā)明裝置進(jìn)行回收，然后根據(jù)實(shí)際濃度梯度和回收線蟲數(shù)量 通過線性回歸制定出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示，圖4所示曲線對應(yīng)的線性方程為y=0. 0002x -2. 4478，其中x為橫坐標(biāo)，它為土壤中混入的每平方米的線蟲數(shù)，y為縱坐標(biāo)，它為進(jìn)入本裝 置的線蟲數(shù)。假設(shè)在被測土壤里回收的線蟲數(shù)量是70頭，將y=70代入方程式y(tǒng)=0. 0002x -2. 4478后得出x=362239頭/m2。換算成3. 6頭/cm2。被測土壤中每平方厘米大約含有3. 6 頭線蟲。本實(shí)施方式可對土壤中釋放的線蟲進(jìn)行定量測定，測定的主要過程是在田間進(jìn) 行，既不破壞作物的正常生長，又無需將土樣帶回實(shí)驗(yàn)室，且無需進(jìn)行大蠟螟的解剖。本發(fā) 明在一定時(shí)間內(nèi)可提高檢測效率。
權(quán)利要求
昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置，其特征在于它由采集管和捕捉管組成；所述采集管由采集管上蓋(11)、采集管壁(12)和網(wǎng)罩(13)組成，采集管壁(12)為兩端開口的管狀結(jié)構(gòu)，采集管上蓋(11)密封安裝在采集管壁(12)的上端，網(wǎng)罩(13)的上端開口、下端封閉，網(wǎng)罩(13)的上端開口處與采集管壁(12)的下端封閉連接，網(wǎng)罩(13)的下端暴露在采集管壁(12)外；所述捕捉管由捕捉管壁(21)和無紡布條(22)組成，捕捉管壁(21)為上端開口、下端封閉的管狀結(jié)構(gòu)，捕捉管壁(21)的側(cè)壁上設(shè)有一個(gè)橫向長孔，無紡布條(22)封閉安裝在此長孔處；采集管壁(12)的下端與捕捉管壁(21)的上端插接在一起，且網(wǎng)罩(13)置于捕捉管壁(21)內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置，其特征在于網(wǎng)罩(13)下端 底部距采集管壁(12)的下端開口處的距離為20毫米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置，其特征在于捕捉管壁(21) 的上端開口處與下端底部間的距離為45毫米。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置，其特征在于捕捉管壁(21) 的側(cè)壁上的長孔為長16毫米、寬4毫米的長方形孔。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置，其特征在于所述長方形孔 的上端邊緣與采集管壁(12)的下端邊緣之間的距離為20毫米，長方形孔的下端邊緣與捕 捉管壁(21)的下端底部之間的距離為21毫米。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置，其特征在于捕捉管壁(21) 的下部呈倒圓錐形。
7.土壤中昆蟲病原線蟲的分離方法，其特征在于它的過程如下步驟Al、將安裝在一起的采集管和捕捉管拆離，然后將大蠟螟裝入采集管，然后在采集 管內(nèi)塞入棉球，使大蠟螟一直停留在網(wǎng)罩(13)內(nèi)；步驟A2、在待采集的土壤上打一個(gè)洞，在洞內(nèi)放入裝有大蠟螟的采集管；步驟A3、48小時(shí)后，從洞中取回采集管，并在25°C下培養(yǎng)一天后，觀察是否有大蠟螟已 死亡；步驟A4、利用WhiteTrap法對死亡的大蠟螟再進(jìn)一步培養(yǎng)七到十天，即可分離出昆蟲 病原線蟲。
8.土壤中昆蟲病原線蟲的種群密度測量方法，其特征在于它的過程如下步驟Bi、將安裝在一起的采集管和捕捉管拆離，然后將大蠟螟裝入采集管，然后在采集 管內(nèi)塞入棉球，使大蠟螟一直停留在網(wǎng)罩(13)內(nèi)；在捕捉管內(nèi)裝清水至長孔處，然后將盛 有清水的捕捉管與裝有大蠟螟的采集管安裝在一起；步驟B2、在土壤上打一個(gè)洞，然后將步驟B2中安裝好的捕捉管和采集管作為整體放入 洞中，其中采集管在上、捕捉管在下；步驟B3、48小時(shí)后，從洞中取回安裝在一起的采集管和捕捉管，然后卸掉捕捉管，并將 捕捉管中的水吸出后，在顯微鏡下觀察水里的昆蟲病原線蟲的個(gè)數(shù)；步驟B4、根據(jù)步驟B3中觀察到的昆蟲病原線蟲的個(gè)數(shù)，計(jì)算獲得土壤中昆蟲病原線蟲 的種群密度。
全文摘要
昆蟲病原線蟲的分離與檢測裝置以及土壤中昆蟲病原線蟲的分離方法及種群密度測量方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的需時(shí)較長和破壞作物等問題。該裝置由采集管和捕捉管組成，采集管由采集管上蓋、采集管壁和網(wǎng)罩組成，捕捉管由捕捉管壁和無紡布條組成。分離方法將大蠟螟裝入采集管的網(wǎng)罩內(nèi)然后將采集管放入土壤，兩天后取回培養(yǎng)1天，再利用WhiteTrap法培養(yǎng)七到十天可分離線蟲。種群密度測量方法將盛有清水的捕捉管與裝有大蠟螟的采集管安裝后放入土壤，48小時(shí)后取回，觀察記錄水里線蟲個(gè)數(shù)，計(jì)算得土壤線蟲種群密度。本發(fā)明可用于昆蟲病原線蟲的野外采集及應(yīng)用該線蟲作生物防治因子對田間土壤線蟲種群密度的跟蹤和測定。
文檔編號A01K67/033GK101849534SQ20101020521
公開日2010年10月6日 申請日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者劉振華, 戰(zhàn)麗莉, 王 義, 許艷麗 申請人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所