專利名稱：：一種快速培育純合抗蟲兼抗除草劑轉(zhuǎn)基因觀賞羽衣甘藍的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種快速培育純合抗蟲兼抗除草劑轉(zhuǎn)基因觀賞羽衣甘藍的方法。
背景技術(shù)：
：觀賞羽衣甘藍(Brassicaoleraceavar.ac印hala)，屬十字花科二年生草本植物，是蕓薹屬甘藍種的園藝變種。以觀葉為主，其葉片形態(tài)美觀多變，心葉色彩絢麗如花，整個植株形如盛開的牡丹花，人們形象地稱之為“葉牡丹”。其抗寒性很強，能耐受_8°C左右的低溫，近來在許多城市，尤其是長江流域及黃河以南城市，已成為秋冬至早春的主要景觀地被植物。我國目前種子基本依靠進口，國內(nèi)稀有育種工作。觀賞羽衣甘藍的部分生長期處于蟲害發(fā)生嚴重季節(jié)，一方面害蟲咬食的結(jié)果，造成了觀賞性的嚴重破壞，另一方面，大量噴施殺蟲劑，也易造成環(huán)境污染及害蟲抗藥性的形成。此外，作為觀賞植物，通常大片栽種于戶外露地，人工除草是一個耗時耗工的勞動。因此培育抗蟲、抗除草劑的觀賞羽衣甘藍具有重要的社會及經(jīng)濟價值。在甘藍類作物中，幾乎不存在抗蟲種質(zhì)，更不存在抗除草劑種質(zhì)。采用基因工程手段，引入抗蟲及抗除草劑基因，是培育抗蟲兼抗除草劑品種的最直接、有效的手段，而且由于是單基因的引入，也保證了其觀賞性狀不受影響。目前國際上使用較多的殺蟲基因有來自蘇云金桿菌的Bt基因，也有部分工作中采用了來自植物的蛋白酶抑制劑基因，而這兩個基因的殺蟲機理不同。將不同殺蟲機理的殺蟲蛋白基因同時導(dǎo)入同一受體植物，有可能提高植物的抗蟲性，并延緩昆蟲對殺蟲蛋白產(chǎn)生耐受性。國際上使用較多的抗除草劑基因是來自于細菌Str印tomyceshygroscopicus的bar基因，它編碼對除草劑Basta中有效成分PPT(Phosphinothricin)的抗性。在優(yōu)良育種材料中建立高效組織培養(yǎng)離體再生體系是開展基因工程種質(zhì)改良的基礎(chǔ)。我們已經(jīng)在幾份優(yōu)良育種材料中建立了高頻率的不定芽誘導(dǎo)及植株再生技術(shù)(趙秀樞等，2009)，而國內(nèi)外尚未見利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲、抗除草劑觀賞羽衣甘藍的有關(guān)報道。甘藍類作物具有很強的雜種優(yōu)勢。生產(chǎn)中使用的種子均為雜交一代。在雜交育種中，首先必須獲得純合的雙親材料，常規(guī)育種需要經(jīng)過6-10年時間。由于植物的花粉細胞(小孢子細胞)僅具有一套染色體，通過小孢子培養(yǎng)可以一步獲得雙單倍體純合植株，僅需1-2年時間，能大大加速育種進程。我們已經(jīng)建立了觀賞羽衣甘藍小孢子培養(yǎng)技術(shù)，并獲得了相應(yīng)的國家發(fā)明專利(ZL200610112997.5)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因甘藍的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因甘藍的方法，包括如下步驟用含有目的基因的重組農(nóng)桿菌侵染甘藍的子葉，再進行共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因甘藍。上述過程中，所述甘藍的子葉為帶柄子葉；所述柄的長度為lmm-4mm；所述柄的長度具體為1mm、2mm或4mm。上述過程中，所述侵染包括如下步驟將所述甘藍的子葉置于所述含有目的基因的重組農(nóng)桿菌的菌液中，浸泡3min-5min，得到侵染后的子葉。上述過程中，所述含有目的基因的重組農(nóng)桿菌的菌液的0D_值為0.3-0.5。上述過程中，所述共培養(yǎng)的方法包括如下步驟將所述侵染后的子葉置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在溫度為22°C_27°C且黑暗的條件下培養(yǎng)2天；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基由NH4N03、KN03、CaCl22H20、MgS047H20、KH2P04、FeS047H20、EDTANa2、KI、CoCl26H20、H3B03、Na2Mo042H20、MnS044H20、CuS045H20、ZnS047H20、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素(即VB1)、鹽酸吡哆辛(即VB6)、6-芐氨基腺嘌呤(即6-BA)、a-萘乙酸(即NAA)、蔗糖、瓊脂、乙酰丁香酮和水組成；所述NH4N03在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KN03在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl22H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L，所述MgS047H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2P04在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeS047H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L，所述EDTANa2在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L,所述CoCl2-6H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3B03在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L，所述Na2Mo042H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnS04*4H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuS04*5H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述ZnS047H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述甘氨酸在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述硫胺素在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述鹽酸吡哆辛在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述6-芐氨基腺嘌呤在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1.Omg/L，所述a-萘乙酸在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述蔗糖在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1.Og/L，所述乙酰丁香酮在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為100umol/L,所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值為5.2。上述過程中，在所述共培養(yǎng)后，包括誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的步驟；和/或，所述目的基因為Bt-pinll基因和bar基因；所述Bt-pinll基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述bar基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；和/或，所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)和所述生根培養(yǎng)的方法中培養(yǎng)條件均為溫度為25V、光照周期為16h光照/8h黑暗、光強度為30001x；和/或，所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基由NH4N03、KN03、CaCl22H20、MgS04.7H20、KH2P04、FeS047H20、EDTANa2、KI、CoCl26H20、H3B03、Na2Mo042H20、MnS044H20、CuS045H20、ZnS047H20、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素、鹽酸吡哆辛、6-芐氨基腺嘌呤、a-萘乙酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦(稱Phosphinothricin或PPT)、羧卞青霉素(Carbenicillin)和水組成；所述NH4N03在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KN03在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl22H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L,所述MgS047H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2P04在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeS047H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L，所述EDTANa2在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl26H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3B03在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L,所述Na2Mo042H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L，所述MnS044H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuS045H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnS047H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述甘氨酸在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基基中的濃度為2.Omg/L，所述硫胺素在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述鹽酸吡哆辛在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述6-芐氨基腺嘌呤在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1.Omg/L，所述a-萘乙酸在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述蔗糖在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1.0g/L，所述草胺膦在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為3-7mg/L，所述羧卞青霉素在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為300mg/L，所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基的pH值為5.8；和/或，所述生根培養(yǎng)基由NH4N03、KN03、CaCl22H20、MgS047H20、KH2P04、FeS047H20、EDTANa2、KI、CoCl26H20、H3B03、Na2Mo042H20、MnS044H20、CuS045H20、ZnS047H20、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素、鹽酸吡哆辛、6-芐氨基腺嘌呤、a-萘乙酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦、頭孢霉素和水組成；所述NH4N03在生根培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KN03在生根培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl22H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L，所述MgS047H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2P04在生根培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeS047H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTANa2在生根培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl26H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3B03在生根培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L,所述Na2Mo042H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L，所述MnS04*4H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L，所述CuS045H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnS047H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在生根培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述甘氨酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為2.0mg/L，所述硫胺素在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L,鹽酸吡哆辛在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L,所述6-芐氨基腺嘌呤在生根培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L，所述a-萘乙酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述蔗糖在生根培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在生根培養(yǎng)基中的濃度為1.0g/L，所述草胺膦在生根培養(yǎng)基中的濃度為3-7mg/L，所述頭孢霉素在生根培養(yǎng)基中的濃度為20-25mg/L，所述生根培養(yǎng)基的pH值為5.8。上述過程中，所述甘藍為觀賞羽衣甘藍，具體可為京冠白1號品種。由上述任一所述方法獲得的轉(zhuǎn)基因甘藍也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種獲得轉(zhuǎn)基因甘藍純合體的方法。本發(fā)明所提供的獲得轉(zhuǎn)基因甘藍純合體的方法，包括如下步驟取上述任一所述的轉(zhuǎn)基因甘藍的小孢子，進行胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、生根培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因甘藍純合體；所述小孢子取自如下時期的花蕾含70%單核靠邊期小孢子細胞和30%雙核期小孢子細胞的花蕾；和/或，所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)中使用的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基由KN03、Ca(N03)2*4H20、MgS047H20、KH2P04、FeS047H20、EDTANa2、KI、CoCl26H20、H3B03、Na2Mo042H20、MnS044H20、CuS045H20、ZnS047H20、肌醇、煙酸、卩比哆醇、硫胺素、甘氨酸、葉酸、生物素、谷氨酰胺、絲氨酸、谷胱甘肽、6-芐氨基腺嘌呤、蔗糖、活性炭和水組成；所述KN03在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為125mg/L，所述Ca(N03)24H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L，所述MgS047H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為125mg/L，所述1^#04在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為125mg/L，所述FeS047H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTANa2在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl26H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3B03在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L，所述Na2Mo042H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnS044H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuS045H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnS047H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為lOOmg/L，所述煙酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述吡哆醇在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L,所述硫胺素在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述甘氨酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述葉酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述生物素在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.05mg/L，所述谷氨酰胺在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為800mg/L，所述絲氨酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L,所述谷胱甘肽在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為30mg/L，所述6-芐氨基腺嘌呤在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5-1.2mg/L，所述蔗糖在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為130g/L，所述活性炭在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.2g/L；所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的PH值為5.9;和/或，所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為在溫度為33°C且黑暗條件下高溫脅迫處理24小時后，再在溫度為25°C且黑暗條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)胚；和/或，所述小孢子在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為105個/mL；和/或，所述分化及篩選培養(yǎng)中所使用的分化培養(yǎng)基由NH4N03、KN03、CaCl22H20、MgS047H20、KH2P04、FeS047H20、EDTANa2、KI、CoCl26H20、H3B03、Na2Mo042H20、MnS044H20、CuS045H20、ZnS047H20、肌醇、煙酸、吡哆醇、硫胺素、甘氨酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦和水組成；所述NH4N03在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KN03在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl2.2H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L，所述MgS04.7H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2P04在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeS04.7H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTA.Na2在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L,所述KI在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl2.6H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3BO3在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L,所述Na2MoO4.2H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L，所述MnSO4.4H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L，所述CuSO4.5H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述ZnSO4.7H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述吡哆醇在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述硫胺素在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述甘氨酸在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述蔗糖在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為10g/L，所述草胺膦在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為5.5-8.5mg/L；所述分化及篩選培養(yǎng)基的pH值為5.8。和/或，所述分化及篩選培養(yǎng)的條件為在溫度為25°C、光強為2000LUX、光照時間為16小時光照/天的條件下進行分化及篩選培養(yǎng)20天；和/或，所述生根培養(yǎng)中使用的生根培養(yǎng)基由NH4N03、KNO3>CaCl2·2H20、MgSO4·7H20、KH2PO4,FeSO4·7H20、EDTA·Na2,ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3,Na2MoO4·2H20、MnSO4·4H20、CuSO4·5H20、ZnSO4·7H20、肌醇、煙酸、吡哆醇、硫胺素、甘氨酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦和水組成；所述NH4NO3在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為825mg/L，所述KNO3在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為950mg/L，所述CaCl2·2H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為220mg/L，所述MgSO4·7H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為185mg/L，所述KH2PO4在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為85mg/L，所述FeSO4·7Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L，所述EDTA.Na2在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl2·6Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述H3BO3在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L，所述Na2MoO4·2Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L，所述MnSO4·4Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L，所述CuSO4·5H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnSO4·7H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L,所述肌醇在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述吡哆醇在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述硫胺素在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.Img/L，所述甘氨酸在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述蔗糖在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為15g/L，所述瓊脂在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為8.Og/L，所述草胺膦在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為5.5-8.5mg/L，所述生根培養(yǎng)基的pH值為5.9；和/或，所述生根培養(yǎng)的條件為在溫度為25°C、光強2000LUX且光照時間為16小時光照/天。上述過程中，所述甘藍為觀賞羽衣甘藍，具體可為京冠白1號品種。本發(fā)明公開了一種利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組織轉(zhuǎn)化途徑，并結(jié)合轉(zhuǎn)基因材料的游離小孢子培養(yǎng)，快速獲得純合的抗蟲兼抗除草劑觀賞羽衣甘藍的方法及所用的培養(yǎng)基。本發(fā)明具有以下環(huán)節(jié)及特征1)以雙價抗蟲基因Bt-pinll為目的基因，以編碼除草劑Basta抗性的bar基因為標記基因，選擇觀賞羽衣甘藍的帶柄子葉為外植體，經(jīng)系列的轉(zhuǎn)化技術(shù)指標優(yōu)化后，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高頻率轉(zhuǎn)化再生體系。該體系條件下非選擇培養(yǎng)基上的對照外植體的不定芽誘導(dǎo)率達100%，每個外植體上不定芽數(shù)高達25個；選擇培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化處理后外植體的不定芽誘導(dǎo)率達48%，每個外植體上的再生芽數(shù)平均為1-2個，經(jīng)分子鑒定確認，再生植株中外源基因陽性的植株比例約73%，因此外植體的轉(zhuǎn)化頻率約達35%。人工飼喂小菜蛾幼蟲的結(jié)果證明，獲得的轉(zhuǎn)基因再生株具有抗蟲性，最好的抗性材料其幼蟲致死率可達97%。2)采用具有良好抗蟲性的轉(zhuǎn)基因再生株為花粉供體母株，通過游離小孢子培養(yǎng)胚狀體發(fā)生途徑，結(jié)合在胚成苗階段及幼苗生根階段的除草劑抗性篩選，快速獲得純合的轉(zhuǎn)基因植株，并在其自交后代中，通過對標記性狀——除草劑Basta抗性的鑒定，證明沒有出現(xiàn)抗性分離，進一步證實外源基因得到了純合。自外植體的轉(zhuǎn)化至純合轉(zhuǎn)基因抗性材料的獲得，僅需要短暫的三年時間，這是常規(guī)育種所不能達到的。本發(fā)明獲得的新材料，可以直接在生產(chǎn)中應(yīng)用，也可以用于進一步的雜交育種體系，培育抗蟲抗除草劑的雜種新一代。由于國際上觀賞植物的基因工程產(chǎn)品較之食用類作物更易獲得基因工程產(chǎn)品的安全生產(chǎn)許可，本發(fā)明將具有現(xiàn)實的社會效應(yīng)和經(jīng)濟、生態(tài)效■、Λfrff.ο圖1帶柄子葉外植體在芽誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基上形成Basta抗性不定芽圖2再生株在添加Basta的生根培養(yǎng)基上生根圖3再生株完成移栽馴化圖4再生株中外源基因的分子雜交鑒定圖5再生株葉片的小菜蛾幼蟲抗性鑒定圖6轉(zhuǎn)基因再生株的游離小孢子培養(yǎng)形成的胚狀體圖7小孢子再生植株中除草劑抗性的分離情況。圖8小孢子再生株后代的外源基因得到純合(全部抗除草劑Basta)。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。試材為觀賞羽衣甘藍白色皺葉類型，品種名稱為“京冠白1號”，“京冠白1號”的種子購自北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心。除草劑Basta購自AgrEvo公司，產(chǎn)品目錄號為9000471。實施例1、培育重組觀賞羽衣甘藍的方法實驗一、培育重組觀賞羽衣甘藍及鑒定(一)培育重組觀賞羽衣甘藍為了考察所建立的離體培養(yǎng)體系是否有效，實驗中以相同材料設(shè)置對照，對照外植體在預(yù)培養(yǎng)后直接進入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(表1)，不與農(nóng)桿菌接觸，也不經(jīng)篩選培養(yǎng)(即無步驟4、5、6)。1、無菌材料的獲得挑選籽粒飽滿、大小均勻無病蟲害的種子，75%酒精消毒30s，無菌水沖洗3次，3%次氯酸鈉(V/V，)消毒15min(其間不斷搖動，加一滴吐溫)，無菌水沖洗4次，無菌濾紙吸干種子表面水分，播種于MS基本培養(yǎng)基上，每瓶播種20粒。25°C散射光下或是黑暗中發(fā)芽。2、外植體的預(yù)培養(yǎng)切取萌發(fā)4天后無菌苗的帶柄子葉(柄長2mm左右)作為外植體，接種(切口插入培養(yǎng)基)到預(yù)培養(yǎng)基上，在25°C、16h光照/8h黑暗光周期、光強度為30001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2d。3、重組農(nóng)桿菌菌液的制備重組農(nóng)桿菌EHA105/pBAC173的制備質(zhì)粒載體pBAC173中含抗蟲基因Bt-pinll，及除草劑抗性基因bar，Bt-pinII基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，bar基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。載體pBBBasta-pinll(張軍杰，劉凡，羅晨，姚磊，趙泓，黃玉碧.大白菜的馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)化及抗菜青蟲性的鑒定，園藝學(xué)報，2004，31(2):193-198.)(北京市農(nóng)林科學(xué)院)；載體pBPC56在基礎(chǔ)載體pSP72(購自Promega公司)的HindIII和XbaI位點之間插入CaMV35S啟動子(GenBankNo.AF502128所示序列中自5'末端起第25-859位核苷酸序列)、BamHI和KpnI位點插入bar基因(序列表中序列3所示)、KpnI和EcoRI位點之間插入Nos終止子(GenBankNo.AF502128所示序列中自5'末端起第2778-3030位核苷酸序列)，得到的重組載體記作載體PBPC56；載體PBPC56RL將pBPC56用HindIII酶切，用T4DNApolymerase(購自Promega公司)補平，引入EcoRI接頭子(CCGGAATTCCGG，上海生工公司合成)獲得；^ff^IrWEHA105(HoodEE,KusnadiA,NikolovΖ,HowardJA.Molecularfarmingofindustrialproteinsfromtransgenicmaize.AdvExpMedBiol.1999，464:127-47)(北京市農(nóng)林科學(xué)院)；MJt^WpCAMBIA0390Hajdukiewicz，P.，Svab,Ζ.andMaliga,P.ThesmallversatiIepPZPfamilyofAgrobacteriumbinaryvectorsforplanttransformationoPlantMol.Biol.25(6)，989-994(1994)。(北京市農(nóng)林科學(xué)院)具體操作如下3-1、Bt基因CrylAb/Ac的人工合成與克隆采用植物基因表達密碼子偏好原則，在上海生工生物工程公司合成序列1所示CrylAb/Ac基因(即Bt基因)。將合成的基因與pUC_T載體連接，得到重組質(zhì)粒記作pUC-btl920。②根據(jù)CrylAb/Ac(l-1920bp)序列設(shè)計引物，在上游引物Crypl—端引入BamHI位點，在下游引物Cryl920R—端引入BglII位點，并設(shè)置終止密碼子。用長PCR的方法擴增目的基因(l_1930bp)。上游引物Cryp1:5，GGATCCATGGACAACAACCCAAACATCA3'下游引物Cryl920R:5，CAGATCGGCCTGAAGACCTGATAGATCT3’③PCR擴增反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>④PCR擴增反應(yīng)程序951預(yù)變性31^11，941變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸3min，30個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。⑤克隆序列的測序鑒定將擴增的PCR產(chǎn)物與pGEM-TeasyVector載體連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有IPTG和X_gal的LB/Amp平板上篩選白色菌落，對重組子進行EcoRI酶切鑒定。把酶切檢測正確的質(zhì)粒送到公司進行Sp6/T7雙向測序。比對結(jié)果表明(軟件DNAMAN)，所克隆序列與目標基因序列同源性100%，可以確定克隆到的DNA片段就是CrylAb/Ac基因。3-2、Bt基因片段的克隆與Bt-PinII融合基因的克隆根據(jù)CrylAb(l-1920bp)和PinIIX04118基因序列，分別設(shè)計引物，先去除PinII的內(nèi)含子(intron)，然后把Bt和PinII基因融合成一個基因片段。Partl為PinII基因intron前面部分；Part2為intron后面部分。第一步，Bt-Partl融合根據(jù)基因序列，設(shè)計下游引物pin2_lAr，引物部分與CrylAb/Ac(l_1920bp)片段在1900-1920bp處有互補序列20bp，上游引物為Crypl，模板為pUC-btl920。擴增片斷長度為1960bp。pin2-lAr(58bp):GTAGGTAAGCAACGAAATTAACTTCCTTGTGAACATCCATGGTCTTCAGGCCGATCTG①PCR擴增體系(25μL)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>②PCR擴增反應(yīng)程序95°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸3min，30個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。第二步，PinII基因Part2部分的PCR擴增。分別設(shè)計引物，模板為pBBBasta-pinll質(zhì)粒DNA，擴增大小為843bp的目的片段。引物如下上游弓丨物pin2-2f(52bp):TAATTTCGTTGCTTACCTACTAATTGTTCTTGGATTATTGGTACTTGTAAGC下游引物pin2-3r(30bp):GAATTCTGTAAATTATCTCACTTTATTAAG①PCR擴增體系<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>②PCR擴增反應(yīng)程序95°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸lmin50s，30個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。第三步，Bt-PinII融合。1960bp和843bp之間有20bp重疊區(qū)域，設(shè)計引物重疊延伸，用PCR方法擴增整個基因片段，長度為2783bp。模板為第一步的擴增產(chǎn)物(模板1)和第二步的擴增產(chǎn)物(模板2)的混合物，引物為Crypl和pin2-3r。①PCR擴增體系(25μL)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>②PCR擴增反應(yīng)程序95°C預(yù)變性3min，94°C變性40s，56°C退火50s，72°C延伸4min20s，30個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。得到的2.8kbPCR產(chǎn)物，測序驗證，序列如序列表中序列2所示，確認為Bt-PinII融合基因。3-3、表達載體PBAC173的構(gòu)建用BamHI和EcoRI分別雙酶切pBPC56和Bt-PinII基因，回收，連接，獲得中間載體PBAC169；在用HindIII和EcoRI雙酶切中間載體pBAC169和載體pCAMBIA0390，回收片段，連接，得到中間載體PBAC170；然后分別用EcoRI單酶切中間載體pBAC170(CIP處理)和載體PBPC56RL，回收，連接，獲得表達載體pBAC173。3-4、重組質(zhì)粒對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及鑒定①在超凈工作臺中將10μ1連接產(chǎn)物加入到100μ1的DH5a感受態(tài)細胞中，混勻，置冰水浴上30min。②42°C水浴熱激90s，再放入冰浴中12min。③加入900mlLB液體培養(yǎng)基，37°C，150rpm振蕩培養(yǎng)1.52h。④在已加入Amp(50μg/)的LB固體培養(yǎng)基上，均勻涂抹上X_gal(20mg/mL)40μ1和IPTG(200mg/mL)4y1的混合液。⑤將活化好的均勻涂布在上述LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜，第二天觀察結(jié)果。重組質(zhì)粒的PCR鑒定及酶切鑒定挑出白色菌落，進行PCR檢測。反應(yīng)體系和條件與前述擴增基因片段同。挑取PCR初步鑒定得到的白色單菌落，在含抗生素的液體LB中過夜培養(yǎng)，收集菌體，提取質(zhì)粒，選用重組質(zhì)粒上的單、雙酶切位點分別進行酶切鑒定。正確的質(zhì)粒DNA用于下一步農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。3-5、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105(1)農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備①挑取農(nóng)桿菌EHA105單菌落于ΥΕΒ+50μg/Rif+50μg/Kan的液體培養(yǎng)基，28°C，黑暗，培養(yǎng)過夜(16h)。②取過夜培養(yǎng)菌液500μ1接種于50mLYEB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0.51.O0③菌液冰上放置15min后，4°C，2000g，離心5min，棄上清。④用ImL預(yù)冷的20mmol/LCaCl2懸浮細胞，每100μ1分裝到1.5的EP管中即可用于轉(zhuǎn)化。⑤如果不立即使用，加入甘油，液氮中速凍，置-70°C保存?zhèn)溆谩?2)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及鑒定①取100μ1感受態(tài)細胞，加入1μg提取自上述大腸桿菌，并經(jīng)驗證確認的質(zhì)粒PBAC173DNA,液氮中速凍3min，37°C水浴5min，然后各加入ImLYEB培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)24h0②IOOOOrpm離心30s，棄上清，分別加入0.IYEB培養(yǎng)基重新懸浮細胞，分別涂布于含有50μg/Kan和50μg/Rif的YEB平板上，28°C黑暗培養(yǎng)23d。③挑單菌落，接種于YEB液體(含有50μg/Kan,500μg/Sm和50μg/Rif)培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜。④提取質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA為模板進行PCR擴增鑒定或者重新轉(zhuǎn)化到大腸桿菌提取質(zhì)粒DNA進行酶切鑒定。結(jié)果得到陽性重組農(nóng)桿菌，記作農(nóng)桿菌EHA105/pBAC173。農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與活化將重組農(nóng)桿菌EHA105/pBAC173的單克隆接種于含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福霉素的20mlLB液體培養(yǎng)基中，28°C，黑暗培養(yǎng)2d，至培養(yǎng)物的OD6tltl值為0.8-1.0；4000rpm離心收集菌體沉淀；菌侵染液的制備將菌體沉淀重新懸浮于感染液(表1)中，使其0D_為0.4，得到菌侵染液。LB液體培養(yǎng)基由胰蛋白胨、酵母提取物和NaCl組成；胰蛋白胨在LB液體培養(yǎng)基中的濃度為10g/L，酵母提取物在LB液體培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，NaCl在LB液體培養(yǎng)基中的濃度為10g/L；LB液體培養(yǎng)基的pH7.0。4、農(nóng)桿菌侵染外植體把預(yù)培養(yǎng)后的外植體放入重組農(nóng)桿菌EHA105/pBAC173侵染液中，浸泡4min，取出外植體，并在無菌濾紙上吸干多余菌液，接種到共培養(yǎng)基上。5、共培養(yǎng)在25°C、黑暗條件下共培養(yǎng)2d；共培養(yǎng)培養(yǎng)基如表1。6、轉(zhuǎn)化不定芽的誘導(dǎo)及篩選完成共培養(yǎng)后的材料接種到芽誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基上，在25°C、16h光照/8h黑暗光周期、光強度為30001x的培養(yǎng)條件下進行轉(zhuǎn)化不定芽的誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)。20天左右，待幼芽長至3cm左右(圖1)時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基促使植株的生長及根的形成。芽誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基如表17、生根及移栽將步驟6得到的苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(表1)，在25°C、16h光照/8h黑暗光周期、光強度為30001x的培養(yǎng)條件下進行生根培養(yǎng)10天，幼苗長出新根，并迅速成株(圖2)。具有5片真葉后，即可出瓶移栽。移栽基質(zhì)由草炭和蛭石組成，質(zhì)量比為草炭蛭石=11，間隙覆蓋薄膜保濕一周后可完全揭掉(圖3)，植株存活率為100%。植株存活率的計算公式為存活率=存活植株數(shù)/移栽植株總數(shù)X100%。在上述實驗條件下，對照組對照外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(非選擇培養(yǎng)基上，見表1)培養(yǎng)20天左右，有大量的不定芽自子葉柄切口處形成，外植體的不定芽誘導(dǎo)率可達100%，每個外植體上不定芽數(shù)高達25個。實驗組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化處理后的外植體，在加有除草劑Basta(含PPT)的選擇培養(yǎng)基上，部分變褐，無不定芽形成，部分外植體的子葉柄切口端在插入培養(yǎng)基部位形成一些綠色不定芽，外植體的不定芽誘導(dǎo)率可達48%，每個外植體上的再生芽數(shù)平均為1-2個。外植體的不定芽誘導(dǎo)率=具不定芽發(fā)生的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)χ100%。本發(fā)明中用外植體的轉(zhuǎn)化率來表示轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化效率的計算公式為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)xlOO%。實驗組轉(zhuǎn)化效率為35%。MS基本培養(yǎng)基組成與文獻“MurashigeΤ.andF.Skoog,1962.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissueculture.Physiol.Plant.15:473_497.”中所述MS基本培養(yǎng)基組成一致。表1、用于羽衣甘監(jiān)遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的培養(yǎng)基配方及滅菌方式<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(二)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定1、轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定質(zhì)粒pBAC173的構(gòu)建方法與實驗(一)中所述一致。選取生長狀態(tài)較好的轉(zhuǎn)基因植株，提取基因組DNA；以質(zhì)粒pBAC173DNA作為陽性對照，未轉(zhuǎn)基因植株DNA作為陰性對照，不加DNA反應(yīng)管作空白對照，對羽衣甘藍再生植株基因組DNA進行外源基因片段的PCR擴增及Southern雜交鑒定；PCR擴增引物為來自bar基因的特異序列，具體為5，-AACTTCCGTACCGAGCCGCA-3，，5，-ATGCCAGTTCCCGTGCTTGA-3’，Southern雜交中使用的核酸探針為地高辛標記的bar基因序列。對在芽誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基上獲得的分別來自不同外植體的86個獨立轉(zhuǎn)化株進行了PCR鑒定，隨機取樣其中的18份材料進行了Southern雜交鑒定。根據(jù)Southern雜交結(jié)果，確定再生植株中外源基因陽性植株的頻率。代表性結(jié)果如圖4所示。圖4中，泳道1表示非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧?，泳?至泳道5為4個陽性植株，泳道6為未檢測到外源基因的再生植株。18份材料的鑒定結(jié)果表明，再生株中，外源基因陽性的植株頻率約為73%，這樣推算出外植體的轉(zhuǎn)化頻率約為35%(73%x48%)0這在蕓薹屬作物中是很高的。外植體轉(zhuǎn)化頻率的計算公式外源基因陽性植株頻率χ外植體的抗性不定芽誘導(dǎo)率。2、轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性鑒定接蟲方法取轉(zhuǎn)基因植株及對照植株對等位置葉片，表面清洗并吸干水分后，分別放入墊有濾紙保濕的直徑9厘米培養(yǎng)皿中；將同期孵化約6小時的小菜蛾幼蟲(1-2齡)放入培養(yǎng)皿中的菜葉上，每皿放幼蟲10頭，每處理重復(fù)5次。在25°C，RH為60-70%條件下進行飼蟲實驗(圖5)。每三天更換培養(yǎng)皿中葉片。共實驗15天，統(tǒng)計平均死亡率。調(diào)查方法每日觀察一次，檢查幼蟲的存活數(shù)量(以毛筆輕觸蟲體，無任何反應(yīng)判為死亡)，觀察記錄1-2齡、3-4齡幼蟲死亡數(shù)量，統(tǒng)計平均死亡率(表2)。表2、飼喂轉(zhuǎn)Bt-PinII基因葉片的小菜蛾幼蟲死亡率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>17"3-10__24__表中173-1至173-10為轉(zhuǎn)基因植株葉片。結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因起始材料相比，各個轉(zhuǎn)基因植株葉片均有較高的抗蟲效果，不同單株的抗蟲效果不同，但存在具有高抗性的單株，取食小菜蛾幼蟲的死亡率可達97%。實驗二、培育重組觀賞羽衣甘藍所用的種子為京冠白1號，與實驗一中相同。(一)培育重組觀賞羽衣甘藍為了考察所建立的離體培養(yǎng)體系是否有效，實驗中以相同材料設(shè)置對照，對照外植體在預(yù)培養(yǎng)后直接進入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不與農(nóng)桿菌接觸，也不經(jīng)篩選培養(yǎng)(無步驟4、5、6)。1、無菌材料的獲得實驗中所使用的種子為京冠白1號。方法與實驗一中所述相同。2、外植體的預(yù)培養(yǎng)方法與實驗一中所述相同，不同的是切取萌發(fā)3天后無菌苗的帶柄子葉(柄長Imm左右)作為外植體。預(yù)培養(yǎng)基如表1所示。3、重組農(nóng)桿菌菌液的制備方法與實驗一中所述相同。不同的是重組農(nóng)桿菌菌液的濃度為OD6tltl為0.3。重組農(nóng)桿菌EHA105/pBAC173與實驗一中所述相同。LB液體培養(yǎng)基與實驗一中所述相同。4、農(nóng)桿菌侵染外植體方法與實驗一中所述相同，不同的是浸泡3min。5、共培養(yǎng)方法與實驗一中所述相同，不同的是共培養(yǎng)的溫度為22°C。共培養(yǎng)培養(yǎng)基如表1。6、轉(zhuǎn)化不定芽的誘導(dǎo)及篩選方法與實驗一中所述相同，不同的是篩選培養(yǎng)基中PPT的濃度為3mg/L。7、生根及移栽方法與實驗一中所述相同，不同的是生根培養(yǎng)基中PPT的濃度為3mg/L，頭孢霉素的濃度為20mg/L。在上述實驗條件下，對照外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(非選擇培養(yǎng)基上)20天左右，有多量的不定芽自子葉柄切口處形成，外植體的不定芽誘導(dǎo)率可達100%，每個外植體上不定芽數(shù)可達18個。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化處理后的外植體，在加有PPT的選擇培養(yǎng)基上，部分變褐，無不定芽形成，部分外植體的子葉柄切口端在插入培養(yǎng)基部位形成一些綠色不定芽，外植體的不定芽誘導(dǎo)率可達40%，每個外植體上的再生芽數(shù)平均為1個。外植體的不定芽誘導(dǎo)率=具不定芽發(fā)生的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)χ100%。(二)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定1、轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定方法與實驗一中所述相同。結(jié)果表明，再生株中外源基因陽性的植株頻率約為75%，這樣推算出外植體的轉(zhuǎn)化頻率約為30%(75%x40%)，比實驗一中的外植體轉(zhuǎn)化頻率稍低，推測原因可能是所取用的是發(fā)芽3天后的帶柄子葉外植體，較幼嫩，致使對農(nóng)桿菌更敏感。外植體轉(zhuǎn)化頻率的計算公式外源基因陽性植株頻率χ外植體的不定芽誘導(dǎo)率。2、轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性鑒定方法與實驗一中所述相同。結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因起始材料相比，各個轉(zhuǎn)基因植株葉片均有較高的抗蟲效果，不同單株的抗蟲效果不同，但存在具有高抗性的單株，取食小菜蛾幼蟲的死亡率可達96%，與實驗一中結(jié)果無顯著性差異。本實驗條件下，外植體的轉(zhuǎn)化效率為30%。實驗三、培育重組觀賞羽衣甘藍所用的種子為京冠白1號，與實驗一中相同。(一)培育重組觀賞羽衣甘藍為了考察所建立的離體培養(yǎng)體系是否有效，實驗中以相同材料設(shè)置對照，對照外植體在預(yù)培養(yǎng)后直接進入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不與農(nóng)桿菌接觸，也不經(jīng)篩選培養(yǎng)(無步驟4、5、6)。1、無菌材料的獲得實驗中所使用的種子為京冠白1號，與實驗一中相同。方法與實驗一中所述相同。2、外植體的預(yù)培養(yǎng)方法與實驗一中所述相同，不同的是切取萌發(fā)5天后無菌苗的帶柄子葉(柄長4mm左右)作為外植體。預(yù)培養(yǎng)基如表1所示。3、重組農(nóng)桿菌菌液的制備方法與實驗一中所述相同。不同的是重組農(nóng)桿菌菌液的濃度為OD6tltl為0.5。重組農(nóng)桿菌EHA105/pBAC173與實驗一中所述相同。LB液體培養(yǎng)基與實驗一中所述相同。4、農(nóng)桿菌侵染外植體方法與實驗一中所述相同，不同的是浸泡5min。5、共培養(yǎng)方法與實驗一中所述相同，不同的是共培養(yǎng)的溫度27°C。共培養(yǎng)培養(yǎng)基如表1。6、轉(zhuǎn)化不定芽的誘導(dǎo)及篩選方法與實驗一中所述相同，不同的是篩選培養(yǎng)基中PPT的濃度為7mg/L。7、生根及移栽方法與實驗一中所述相同，不同的是生根培養(yǎng)基中PPT的濃度為7mg/L，頭孢霉素在生根培養(yǎng)基中的濃度為25mg/L。在上述實驗條件下，對照外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(非選擇培養(yǎng)基上)20天左右，有多量的不定芽自子葉柄切口處形成，外植體的不定芽誘導(dǎo)率可達95%，每個外植體上不定芽數(shù)可達16個。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化處理后的外植體，在加有除草劑Basta(含PPT)的選擇培養(yǎng)基上，部分變褐，無不定芽形成，部分外植體的子葉柄切口端在插入培養(yǎng)基部位形成一些綠色不定芽，外植體的不定芽誘導(dǎo)率可達36%，每個外植體上的再生芽數(shù)平均為1個。外植體的不定芽誘導(dǎo)率=具不定芽發(fā)生的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)χ100%。(二)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定1、轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定方法與實驗一中所述相同。結(jié)果表明，再生株中外源基因陽性的植株頻率約為80%，這樣推算出外植體的轉(zhuǎn)化頻率約為28.8%(外植體轉(zhuǎn)化頻率=外源基因陽性植株頻率80%χ外植體的不定芽誘導(dǎo)率36%)，比實驗一中的外植體轉(zhuǎn)化頻率低，推測原因可能是所取用的是發(fā)芽5天后的帶柄子葉外植體，子葉柄偏長，不定芽誘導(dǎo)能力降低所致。此外還可見再生株中外源基因陽性的植株頻率提高(約為80%)，這說明芽誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基中使用7mg/L的PPT濃度是有效的。2、轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性鑒定方法與實驗一中所述相同。結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因起始材料相比，各個轉(zhuǎn)基因植株葉片均有較高的抗蟲效果，不同單株的抗蟲效果不同，但存在具有高抗性的單株，取食小菜蛾幼蟲的死亡率可達95%，與實驗一中結(jié)果無顯著性差異。本實驗條件下，外植體的轉(zhuǎn)化效率為28.8%。實施例2、轉(zhuǎn)基因再生株通過游離小孢子培養(yǎng)快速得到純合材料一般情況下，獲得的轉(zhuǎn)基因植株中，外源基因都是呈雜合態(tài)存在，如果受體材料自生的遺傳背景也是雜合的，如在甘藍類作物中，常規(guī)需要8-10年時間的自交，才能獲得完全純合的材料，用于雜交制種。本實驗采用單倍體育種方法，結(jié)合轉(zhuǎn)基因材料的特性，在1-2年的時間內(nèi)快速培育出純合的轉(zhuǎn)基因材料。將抗蟲性良好的轉(zhuǎn)基因羽衣甘蘭供體母株173-2，173-6，173-7,173-8,173-9栽種于具有防蟲網(wǎng)的塑料大棚內(nèi)，在3-6月上旬采集小孢子用本發(fā)明的方法進行體外培養(yǎng)，可以一次性獲得純合的轉(zhuǎn)基因植株。具體過程包括以下步驟實驗一、純合體的獲得1)游離小孢子培養(yǎng)通過細胞核的DAPI熒光染色(ColemenAW,GoffLJ.ApplicationoffluorochrometopollenbiologyI.Mithramycinand4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)asvitalstainandforquantificationofnuclearDNA.StainTechnol，1985，60:145-154)，顯微鏡檢，確定小孢子的發(fā)育時期，取含70%單核靠邊期小孢子細胞和30%雙核期小孢子細胞的花蕾，將花蕾用體積比為2.5%的次氯酸鈉水溶液表面滅菌15分鐘，無菌水清洗3次，用杵棒擠壓法在B5培養(yǎng)液中釋放出游離小孢子，經(jīng)50μm孔徑尼龍網(wǎng)過濾懸浮液，IOOOrpm離心5分鐘，棄上清，以B5培養(yǎng)液重新懸浮沉淀，再重復(fù)清洗2次后，將小孢子接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，至終濃度為IO5個/mL，分裝于06cm培養(yǎng)皿中，每皿2.5mL，接著在33°C、黑暗條件下高溫脅迫處理24小時后，再轉(zhuǎn)入25°C、黑暗條件下培養(yǎng)，以誘導(dǎo)胚狀體。3天后，培養(yǎng)于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的小孢子即開始出現(xiàn)一次分裂，在以后的培養(yǎng)時間里細胞持續(xù)分裂，依次形成細胞團、原胚、球形胚和心型胚，約25天后形成魚雷期、子葉期胚(圖6)。之后，轉(zhuǎn)入25°C、2000Lux、16小時光照/天條件下培養(yǎng)7天。B5士音夜的農(nóng)iS~i:fi^“G￡imborgetal.Planttissueculturemedia.Invitro,1976，12:473_478”中所述相同。胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基如表3所述。2)分化及篩選培養(yǎng)將步驟1)得到的胚狀體接種于分化及篩選培養(yǎng)基中，在25°C、2000Lux、16小時光照/天條件下進行分化培養(yǎng)20天，部分胚狀體長出綠色莖、葉(圖7A)，部分胚狀體在該分化及篩選培養(yǎng)基上直接變黃、枯死，部分胚狀體即使長出了莖葉，也慢慢變黃枯死(圖7B)，說明自原始轉(zhuǎn)化再生株中，通過花粉培養(yǎng)，分離出了攜帶外源基因的配子體和沒有攜帶外源基因的配子體形成的植株，實現(xiàn)了外源基因的純合。分化及篩選培養(yǎng)基如表3所述。3)生根培養(yǎng)將長出莖、葉的綠色植株轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中，在25°C、2000Lux、16小時光照/天條件下進行生根培養(yǎng)，得到羽衣甘蘭完整再生植株。生根培養(yǎng)基如表3所述。4)移栽、采種洗凈植株根部附帶的瓊脂，移栽入基質(zhì)(草炭蛭石=11)中?；ㄆ谥仓瓿Ｒ?guī)套袋自交授粉，收獲種子。5)純合轉(zhuǎn)基因材料的鑒定將約200粒種子播種于苗盤中，子葉長出后，噴施0.5%(V/V)Basta水溶液(含PPT750mg/L)，隔周噴施，共二次。三周后調(diào)查幼苗的除草劑抗性分離情況。結(jié)果表明，小孢子培養(yǎng)獲得的再生株中，外源基因均已純合，其后代全部抗除草劑，不發(fā)生抗性分離現(xiàn)象(圖8)。0.5%(V/V)Basta水溶液(含PPT750mg/L)就是將Basta溶于水得到的，0.5%(V/V)Basta水溶液中PPT的濃度為750mg/L。至此，在三年的時間內(nèi)快速獲得了抗蟲兼抗除草劑的純合轉(zhuǎn)基因觀賞羽衣甘藍材料。表3、用于轉(zhuǎn)基因羽衣甘蘭游離小孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方及滅菌方式<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>滅菌處理過濾滅菌高壓滅菌后加過濾滅菌的高壓滅菌后加過濾滅菌的___Basta溶液_Basta溶液_實驗二、純合體的獲得1)游離小孢子培養(yǎng)小孢子的獲得取含70%單核靠邊期小孢子細胞和30%雙核期小孢子細胞花蕾中的小孢子，方法與實驗一中所述相同。將小孢子接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在33°C、黑暗條件下高溫脅迫處理24小時后，再轉(zhuǎn)入25°C、黑暗條件下培養(yǎng)，以誘導(dǎo)胚狀體，約25天后形成魚雷期、子葉期胚；再轉(zhuǎn)入25°C、2000Lux、16小時光照/天條件下培養(yǎng)7天。胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基與實驗一中胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的不同之處在于6-BA在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L。2)分化培養(yǎng)將步驟1)得到的胚狀體接種于分化及篩選培養(yǎng)基中，在25°C、2000Lux、16小時光照/天條件下進行分化培養(yǎng)20天，部分胚狀體長出綠色莖、葉(圖7A)，部分胚狀體在該分化及篩選培養(yǎng)基上直接變黃、枯死，部分胚狀體即使長出了莖葉，也慢慢變黃枯死(圖7B)，說明自原始轉(zhuǎn)化再生株中，通過花粉培養(yǎng)，分離出了攜帶外源基因的配子體和沒有攜帶外源基因的配子體形成的植株，實現(xiàn)了外源基因的純合。分化及篩選培養(yǎng)基的組成與實驗一中分化及篩選培養(yǎng)基的不同之處在于PPT在分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為5.5mg/L。3)生根培養(yǎng)將長出莖、葉的綠色植株轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中，在25°C、2000Lux、16小時光照/天條件下進行生根培養(yǎng)，得到羽衣甘蘭完整再生植株。生根培養(yǎng)基的組成與實驗一中生根培養(yǎng)基的不同之處在于PPT在生根培養(yǎng)基中的濃度為5.5mg/L。4)移栽、采種方法與實驗一中所述相同。5)純合轉(zhuǎn)基因材料的鑒定將約200粒種子播種于苗盤中，子葉長出后，噴施0.5%(V/V)Basta水溶液(含PPT750mg/L)，隔周噴施，共二次。三周后調(diào)查幼苗的除草劑抗性分離情況。結(jié)果表明，其后代全部抗除草劑，不發(fā)生抗性分離現(xiàn)象，說明小孢子培養(yǎng)獲得的再生株中，外源基因均已純合。至此，在三年的時間內(nèi)快速獲得了抗蟲兼抗除草劑的純合轉(zhuǎn)基因觀賞羽衣甘藍材料。實驗三、純合體的獲得1)游離小孢子培養(yǎng)小孢子的獲得取含70%單核靠邊期小孢子細胞和30%雙核期小孢子細胞花蕾中的小孢子，方法與實驗一中所述相同。將小孢子接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在33°C、黑暗條件下高溫脅迫處理24小時后，再轉(zhuǎn)入25°C、黑暗條件下培養(yǎng)，以誘導(dǎo)胚狀體，約25天后形成魚雷期、子葉期胚；再在25°C、2000Lux、16小時光照/天條件下培養(yǎng)7天。胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基與實驗一中胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的不同之處在于6-BA在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為1.2mg/L。2)分化培養(yǎng)將步驟1)得到的胚狀體接種于分化及篩選培養(yǎng)基中，在25°C、2000Lux、16小時光照/天條件下進行分化培養(yǎng)20天，部分胚狀體長出綠色莖、葉(圖7A)，部分胚狀體在該分化及篩選培養(yǎng)基上直接變黃、枯死，部分胚狀體即使長出了莖葉，也慢慢變黃枯死(圖7B)，說明自原始轉(zhuǎn)化再生株中，通過花粉培養(yǎng)，分離出了攜帶外源基因的配子體和沒有攜帶外源基因的配子體形成的植株，實現(xiàn)了外源基因的純合。分化及篩選培養(yǎng)基的組成與實驗一中分化及篩選培養(yǎng)基的不同之處在于PPT在分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為8.5mg/L。3)生根培養(yǎng)將長出莖、葉的綠色植株轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中，在25°C、2000Lux、16小時光照/天條件下進行生根培養(yǎng)，得到羽衣甘蘭完整再生植株。生根培養(yǎng)基的組成與實驗一中生根培養(yǎng)基的不同之處在于PPT在生根培養(yǎng)基中的濃度為8.5mg/L。4)移栽、采種方法與實驗一中所述相同。5)純合轉(zhuǎn)基因材料的鑒定將約200粒種子播種于苗盤中，子葉長出后，噴施0.5%(V/V)Basta水溶液(含PPT750mg/L)，隔周噴施，共二次。三周后調(diào)查幼苗的除草劑抗性分離情況。結(jié)果表明，其后代全部抗除草劑，不發(fā)生抗性分離現(xiàn)象，說明小孢子培養(yǎng)獲得的再生株中，外源基因均已純合。至此，在三年的時間內(nèi)快速獲得了抗蟲兼抗除草劑的純合轉(zhuǎn)基因觀賞羽衣甘藍材料。權(quán)利要求一種培育轉(zhuǎn)基因甘藍的方法，包括如下步驟用含有目的基因的重組農(nóng)桿菌侵染甘藍的子葉，再進行共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因甘藍。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述甘藍的子葉為帶柄子葉；所述柄的長度為lmm-4mm；所述柄的長度具體為lmm、2mm或4mm。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述侵染包括如下步驟將所述甘藍的子葉置于所述含有目的基因的重組農(nóng)桿菌的菌液中，浸泡3min-5min，得到侵染后的子葉。4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述含有目的基因的重組農(nóng)桿菌的菌液的0D600值為0.3-0.5。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)的方法包括如下步驟將所述侵染后的子葉置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在溫度為22°C_27°C且黑暗的條件下培養(yǎng)2天；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基由NH4N03、KNO3>CaCl2·2H20、MgSO4·7H20、KH2PO4,FeSO4·7H20、EDTA·Na2,ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3,Na2MoO4·2H20、MnSO4·4H20、CuSO4·5H20、ZnSO4·7H20、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素、鹽酸吡哆辛、6-芐氨基腺嘌呤、α-萘乙酸、蔗糖、瓊脂、乙酰丁香酮和水組成；所述NH4NO3在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KNO3在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl2·2H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L，所述MgSO4·7H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2PO4在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeSO4·7H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L，所述EDTA·Na2在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L,所述CoCl2·6Η20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3BO3在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L，所述Na2MoO4·2H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnSO4·4Η20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuSO4·5Η20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述ZnSO4·7H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述甘氨酸在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述硫胺素在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述鹽酸吡哆辛在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述6-芐氨基腺嘌呤在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1.Omg/L，所述α-萘乙酸在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述蔗糖在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1.Og/L，所述乙酰丁香酮在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為100μmol/L,所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值為5.2。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述共培養(yǎng)后，包括誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的步驟；和/或，所述目的基因為Bt-pinll基因和bar基因；所述Bt-pinll基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述bar基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；和/或，所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)和所述生根培養(yǎng)的方法中培養(yǎng)條件均為溫度為25°C、光照周期為16h光照/8h黑暗、光強度為30001x；和/或，所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基由NH4N03、KNO3>CaCl2·2H20、MgSO4.7H20、KH2PO4,FeSO4·7H20、EDTA·Na2、ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3,Na2MoO4·2H20、MnSO4·4H20、CuSO4·5H20、ZnSO4·7H20、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素、鹽酸吡哆辛、6-芐氨基腺嘌呤、α-萘乙酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦、羧卞青霉素和水組成；所述NH4NO3在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KNO3在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl2·2H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L,所述MgSO4·7H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2PO4在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeSO4·7H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTA·Na2在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L,所述KI在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl2·6H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3BO3在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L,所述Na2MoO4·2H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L，所述MnSO4·4H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuSO4·5H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnSO4·7H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述甘氨酸在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基基中的濃度為2.Omg/L，所述硫胺素在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述鹽酸吡哆辛在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述6-芐氨基腺嘌呤在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1.Omg/L，所述α-萘乙酸在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述蔗糖在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1.0g/L，所述草胺膦在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為3-7mg/L，所述羧卞青霉素在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為300mg/L，所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基的pH值為5.8；和/或，所述生根培養(yǎng)基由NH4N03、KN03、CaCl2·2H20、MgSO4·7H20、KH2P04、FeSO4·7H20、EDTA·Na2、ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3、Na2MoO4·2H20、MnSO4·4H20、CuSO4·5H20、ZnSO4·7H20、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素、鹽酸吡哆辛、6-芐氨基腺嘌呤、α-萘乙酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦、頭孢霉素和水組成；所述NH4NO3在生根培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KNO3在生根培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L,所述CaCl2·2H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L，所述MgSO4·7H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2PO4在生根培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeSO4·7H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L，所述EDTA·Na2在生根培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L,所述CoCl2·6H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3BO3在生根培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L,所述Na2MoO4·2H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnSO4·4H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuSO4·5H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnSO4·7H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在生根培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述甘氨酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述硫胺素在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L,鹽酸吡哆辛在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L,所述6-芐氨基腺嘌呤在生根培養(yǎng)基中的濃度為1.Omg/L，所述α-萘乙酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述蔗糖在生根培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在生根培養(yǎng)基中的濃度為1.0g/L，所述草胺膦在生根培養(yǎng)基中的濃度為3-7mg/L，所述頭孢霉素在生根培養(yǎng)基中的濃度為20-25mg/L，所述生根培養(yǎng)基的PH值為5.8;和/或，所述方法，在所述侵染前，包括如下預(yù)培養(yǎng)的步驟將所述甘藍的子葉置于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在溫度為25°C、16h光照/8h黑暗光周期和光強度為30001x的條件下培養(yǎng)2d;所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中除不含有乙酰丁香酮外，其余組成成分及各成分在培養(yǎng)基中的濃度與所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基相同。7.一種獲得轉(zhuǎn)基因甘藍純合體的方法，取權(quán)利要求1-6中任一所述方法獲得的轉(zhuǎn)基因甘藍的小孢子，依次進行胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化篩選培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因甘藍純合體；所述小孢子取自如下時期的花蕾含70%單核靠邊期小孢子細胞和30%雙核期小孢子細胞的花蕾；和/或，所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)中使用的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基由KN03、Ca(NO3)2·4H20、MgSO4·7H20、KH2PO4,FeSO4·7H20、EDTA·Na2,ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3,Na2MoO4·2H20、MnSO4·4H20、CuSO4·5H20、ZnSO4·7H20、肌醇、煙酸、卩比哆醇、硫胺素、甘氨酸、葉酸、生物素、谷氨酰胺、絲氨酸、谷胱甘肽、6-芐氨基腺嘌呤、蔗糖、活性炭和水組成；所述KNO3在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為125mg/L，所述Ca(NO3)2·4H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L，所述MgSO4·7H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為125mg/L，所述KH2PO4在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為125mg/L，所述FeSO4·7H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTA·Na2在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl2·6H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3BO3在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L，所述Na2MoO4·2H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnSO4·4H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuSO4·5H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnSO4·7H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為IOOmg/L，所述煙酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述吡哆醇在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述硫胺素在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述甘氨酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述葉酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述生物素在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.05mg/L，所述谷氨酰胺在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為800mg/L，所述絲氨酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述谷胱甘肽在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為30mg/L，所述6_芐氨基腺嘌呤在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5-1.2mg/L，所述蔗糖在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為130g/L，所述活性炭在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.2g/L；所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的PH值為5.9；和/或，所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為在溫度為33°C且黑暗條件下脅迫處理24小時后，再在溫度為25°C且黑暗條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)胚；和/或，所述小孢子在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為IO5個/mL。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述分化篩選培養(yǎng)中所使用的分化篩選培養(yǎng)基由NH4N03、KNO3>CaCl2·2H20、MgSO4·7H20、KH2PO4,FeSO4·7H20、EDTA·Na2,ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3、Na2MoO4·2H20、MnSO4·4H20、CuSO4·5H20、ZnSO4·7H20、肌醇、煙酸、批哆醇、硫胺素、甘氨酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦和水組成；所述NH4NO3在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KNO3在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl2.2H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L，所述MgSO4.7H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2PO4在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeSO4.7H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTA.Na2在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L,所述KI在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl2.6H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述H3BO3在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L,所述Na2MoO4.2H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnSO4.4H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuSO4.5H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述ZnSO4.7H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述吡哆醇在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述硫胺素在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述甘氨酸在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述蔗糖在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為10g/L，所述草胺膦在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為5.5-8.5mg/L；所述分化篩選培養(yǎng)基的pH值為5.8。和/或，所述分化篩選培養(yǎng)的條件為在溫度為25°C、光強為2000LUX、光照時間為16小時光照/天的條件下進行分化篩選培養(yǎng)20天。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述生根培養(yǎng)中使用的生根培養(yǎng)基由NH4N03、KN03、CaCl2·2H20、MgSO4·7H20、KH2P04、FeSO4·7H20、EDTA·Na2、ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3、Na2MoO4·2H20、MnS04·4H20、CuS04·5H20、ZnS04·7H20、肌醇、煙酸、吡哆醇、硫胺素、甘氨酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦和水組成；所述NH4NO3在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為825mg/L，所述KNO3在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為950mg/L，所述CaCl2·2Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為220mg/L，所述MgSO4·7Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為185mg/L，所述KH2PO4在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為85mg/L，所述FeSO4·7H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTA·Na2在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl2·6Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述!1系03在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L，所述Na2MoO4·2H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnSO4·4H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuSO4·5H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述ZnSO4·7H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L,所述肌醇在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述吡哆醇在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述硫胺素在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述甘氨酸在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述蔗糖在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為15g/L，所述瓊脂在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為8.Og/L，所述草胺膦在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為5.5-8.5mg/L,所述生根培養(yǎng)基的pH值為5.9；和/或，所述生根培養(yǎng)的條件為溫度為25°C、光強2000LUX且光照時間為16小時光照/天。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述甘藍為觀賞羽衣甘藍；所述觀賞羽衣甘藍為京冠白1號品種。全文摘要本發(fā)明公開了一種快速培育純合抗蟲兼抗除草劑轉(zhuǎn)基因觀賞甘藍的方法。本發(fā)明培育轉(zhuǎn)基因甘藍的方法包括如下步驟用含有目的基因的重組農(nóng)桿菌侵染甘藍的子葉，再進行共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因甘藍。本發(fā)明中，在選擇培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化處理后外植體的不定芽誘導(dǎo)率達48％，每個外植體上的再生芽數(shù)平均為1-2個，經(jīng)分子鑒定確認，再生芽的轉(zhuǎn)化頻率達35％。人工飼喂小菜蛾幼蟲的結(jié)果證明，獲得的轉(zhuǎn)基因再生株具有抗蟲性，最好的抗性材料其幼蟲致死率可達97％。自外植體的轉(zhuǎn)化至純合轉(zhuǎn)基因抗性材料的獲得，僅需要短暫的三年時間。文檔編號C05G3/02GK101822156SQ201010125939公開日2010年9月8日申請日期2010年3月16日優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日發(fā)明者劉凡,張曉東,張月云,趙秀樞申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院