專利名稱：花生球蛋白Ara3基因啟動子在驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因植物種子中特異表達上的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因啟動子，特別是涉及花生球蛋白Ara3基因啟動子在 驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因植物種子中特異表達上的應用。
背景技術(shù)：
啟動子(Promoter)是RNA聚合酶能夠識別并與之結(jié)合從而起始基因轉(zhuǎn) 錄的DNA序列，是重要的順式作用元件，位于結(jié)構(gòu)基因5、端上游區(qū)的DNA 序列，能指導全酶與模板的正確結(jié)合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特 異性轉(zhuǎn)錄的形式，決定轉(zhuǎn)錄的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶類型，是 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。
目前，植物基因工程中常用的啟動子為組成型表達啟動子(Constitutive promoter),研究發(fā)現(xiàn)在組成型啟動子的控制下外源基因的表達存在一些缺陷， 而種子特異性啟動子具有顯著的組織和發(fā)育時期的特異性，可以控制外源基因 在植物種子中高效表達，避免外源基因在植物的其他部位表達，也可避免外源 基因在轉(zhuǎn)基因訴諸植株中非特異表達所造成的能量負荷和物質(zhì)浪費，減少對植 物的不利影響，同時還發(fā)揮了植物種子作為蛋白高效表達和貯存器官的優(yōu)勢。 因此，利用種子特異性啟動子控制外源基因在種子中特異表達具有重要的理論 和實踐意義。
種子特異性啟動子區(qū)別于其它類型啟動子的一個顯著特點是在該類啟動 子上游存在一些特異的調(diào)控元件，這些調(diào)控元件與調(diào)控種子特異性基因的特異表達有關(guān)，如RY基序、GCN4基序、E盒、G盒、CAAT盒和B盒等。
隨著植物基因工程的發(fā)展， 一些種子特異性啟動子被克隆，成為轉(zhuǎn)基因技 術(shù)中的有利工具，這些種子特異性啟動子有的是貯藏蛋白來源的種子特異性啟 動子，如油菜1.7S蛋白基因啟動子、谷蛋白基因啟動子、豆球蛋白基因啟動 子、油體蛋白基因啟動子、云扁豆蛋白基因啟動子、2S清蛋白基因啟動子和 伴大豆球蛋白基因啟動子等，有的是非貯藏蛋白來源的種子特異性啟動子，如 USP基因啟動子、棉花?；d體蛋白硫酯酶基因啟動子等。這些啟動子都能驅(qū) 使Gt/S報告基因或外源基因在植物種子中特異和高效表達。
種子貯藏蛋白是包括人類在內(nèi)的動物界食用蛋白的第一來源，據(jù)估計，人 類有50%的食物蛋白直接來源于谷類種子。在種子發(fā)育過程中，貯藏蛋白基因 是少數(shù)幾個在種子中大量表達的基因；種子貯藏蛋白是基因表達的直接產(chǎn)物， 大量積累于種子中；種子發(fā)育的生理學和遺傳學研究比較深入，這些有利因素 使種子貯藏蛋白基因成為研究基因調(diào)控的理想對象，因此，從種子貯藏蛋白基 因中克隆種子特異性啟動子是十分有效而簡便的方法，并且具有巨大的潛在市 場價值和應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于種子特異性啟動子在作物改良、生產(chǎn)外源蛋白等應用 中的特殊價值，提供花生球蛋白Ara3基因啟動子在驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因植 物種子中特異表達上的應用。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的
花生球蛋白基因Ara3是貯藏蛋白基因，其GenBank登錄號為DQ519079。 本發(fā)明人通過對該基因進行研究發(fā)現(xiàn)，花生球蛋白基因Ara 3上游從第1位~第634位共長634bp的啟動子序列具有指導基因在植物種子中表達的能力，可 驅(qū)使外源基因在種子和萌發(fā)幼胚組織中特異表達，同時對該序列的結(jié)構(gòu)進行分 析，發(fā)現(xiàn)第536位~第601位和第36位~第47位為TATA框，第647位 第644 位、第641位 第646位、第82位 第86位、第156位~第160位和第124位 ~第127位的區(qū)段上有CAAT框，除此之外，該634bp序列上還包含2個E盒、 1個RY基序、1個legumin盒和1個G盒，其中RY基序和legumin盒對于啟 動子的種子特異性具有決定意義(Fujiwara et al., Plant Mol Biol， 24:261-272, 1990; Baumlein et al"尸te 2:233-239, 1992; Rerie et al., Plant Cell Biochem Biotech, 1:53-104, 1992)， G盒也存在于多種種子特異啟動子中(Williams etal., Plant Cell,.4:485-496, 1992)。
本發(fā)明的花生球蛋白Ara3基因啟動子序列可作為啟動子元件，與其它任 何一種外源基因連接，插入植物雙元表達載體中，構(gòu)建重組表達載體。
上述外源基因可以為任意目的基因序列，如同源植物、外源植物、真菌、 藻類、細菌、病毒、動物或人類基因，也可以是人工設(shè)計合成的DNA序列， 這些序列可以是一段編碼有功能的蛋白質(zhì)或其一部分的正義序列或一段反義 序列。
上述植物雙元表達載體可以為任意一種植物雙元表達載體，如pBIlOl系 列載體、pBI121載體、pCAMBIA系列載體等植物表達載體。
本發(fā)明的花生球蛋白Ara3基因啟動子序列，或上述由該啟動子序列與外 源基因構(gòu)建的重組表達載體可轉(zhuǎn)化埃希氏大腸桿菌(￡"/^n'c/z&co/z')、 土壤根 癌農(nóng)桿菌(^ro&cten'ww&we/ac/era)等微生物制備重組微生物，用于制備轉(zhuǎn) 基因植物或表達外源蛋白。本發(fā)明的花生球蛋白Ara3基因啟動子序列，或上述由該啟動子序列與外 源基因構(gòu)建的重組表達載體可轉(zhuǎn)化宿主細胞或宿主組織及其后代，以此來進行 植物的品質(zhì)改良或生產(chǎn)外源蛋白。所述植物宿主細胞或宿主組織是植物細胞或 植物種子本身，或它們的后代。
本發(fā)明的花生球蛋白Ara3基因啟動子在植物組織中的表達，可采用如下 步驟
(1) 將含有本發(fā)明花生球蛋白Ara3基因啟動子序列的重組表達載體轉(zhuǎn) 化植物細胞；
(2) 使上述植物細胞生長成能夠結(jié)種子的成熟植物。 本發(fā)明的重組表達載體的構(gòu)建可采用本領(lǐng)域的常規(guī)做法，構(gòu)建好的重組表
達載體可采用任意一種適應于植物細胞或植物的轉(zhuǎn)化方法(如農(nóng)桿菌介導侵染 法、電擊法、基因槍轟擊法、花粉管導入法、細胞和原生質(zhì)體顯微注射法等) 將其轉(zhuǎn)入植物細胞或組織中，被轉(zhuǎn)化后的細胞在合適的條件下就可大量增殖或 再生成完整的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明的花生球蛋白Ara 3基因啟動子能有效調(diào)控外源基因特異地在種子 和萌發(fā)幼苗組織中表達，因此可用于轉(zhuǎn)基因植物中改良植物的品質(zhì)，或改變植 物種子發(fā)育過程的物質(zhì)代謝和運輸以及種子的生理生化特性，所述植物包括單 子葉植物和雙子葉植物；也可以用于生產(chǎn)外源蛋白，如生產(chǎn)人類食物、動物詞 料、化妝品或藥品等。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果-
l.對于植物來說種子是重要的繁殖和營養(yǎng)貯存器官，它可以高效地表達和 穩(wěn)定積累大量的蛋白質(zhì)等重要的基因產(chǎn)物，本發(fā)明的種子特異性啟動子把外源目的基因的表達局限在種子或胚組織中，從而有效地避免了外源蛋白在成熟的
根、莖、葉花等器官中的積累所造成的對植物生長的影響和能量物質(zhì)的浪費；
2. 本發(fā)明的花生球蛋白Ara3基因啟動子可以誘導外源目的基因在種子中 特異表達，且表達產(chǎn)物被貯存在成熟種子中，從而大大減少了表達產(chǎn)物存貯上 的物理空間限制，有利于表達產(chǎn)物的高水平累積，同時可以在常規(guī)條件下長期 保存，同時因為表達產(chǎn)物被貯存在種子中，其含量和純度也就相對較高，這就 使得表達產(chǎn)物的回收純化變得相對簡單易行；
3. 本發(fā)明的花生球蛋白Am3基因啟動子對植物品種的品質(zhì)改良、發(fā)育與 代謝調(diào)控和利用轉(zhuǎn)基因植物來生產(chǎn)外源蛋白非常有用，對今后轉(zhuǎn)基因植物具有 重大應用前景。


圖1為PCR擴增^ra3基因啟動子的電泳圖； 其中，M為分子量Marker, 1為PCR擴增產(chǎn)物； 圖2為重組表達載體pBA3的構(gòu)建流程圖3為種子特異性啟動子驅(qū)動的GWS報告基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的組織 特異性表達分析結(jié)果其中，l為花后5天種子，2為花后7天種子，3為成熟種子，4為萌發(fā)2 天幼苗，5為萌發(fā)3天幼苗，6為萌發(fā)6天幼苗，7為萌發(fā)10天幼苗，8為萌 發(fā)20天幼苗，9為成熟葉片，IO為帶莖花序和幼嫩角果。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的闡述，但具體實施例并不對本發(fā) 明做任何限定。實施例l花生基因組DNA的提取
本實施例提取花生基因組DNA，其具體步驟如下
(1 )取花生新葉O.lg于液氮中研磨完全，加入1 .Oml的4xCTAB溶液[PH 8.0， 含4%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)， 200mM Tris-Cl， 20mM EDTA， 1.4M NaCl，用前加2。/。mg/mip-巰基乙醇]，充分振蕩混勻，60°C水浴45 min，每隔 5min振蕩混勻一次；10000rpm離心5 min，取上清液；
(2) 向上述上清液中加入等體積酚氯仿(24: 1，體積比)混合液，混勻， 8000rpm離心5 min，取上清液；
(3) 向上述上清液中加入等體積酚氯仿(24: 1，體積比)混合液，重復 抽提一次，離心后將上清液轉(zhuǎn)移至新管；
(4) 加入0.6倍體積異丙醇和0.1倍體積的3M的乙酸鈉(pH5.2)， -20°C 沉淀30 min， 10000rpm離心10 min，棄上清液；
(5) 用70%乙醇洗沉淀兩次，再用無水乙醇洗沉淀l次，沉淀干燥后溶于 5(HJl雙蒸水中，-20°(:保存，即得到花生基因組DNA。
實施例2種子特異性啟動子的克隆
本實施例根據(jù)已測定的」n 3基因(GenBank登錄號DQ519079)序列， 設(shè)計并合成特異引物Pl和P2擴增花生Jm 3基因上游的第1位 第634位共 634bp長的啟動子片段，同時擴增時在啟動子序列的兩端加入SamHI和 位點，其具體步驟如下
l.引物
特異引物P1，其核苷酸序列如SEQIDNO: l所示，長度為27bp; 特異引物P2，其核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示，長度為26bp。2.PCR擴增
PCR擴增反應體系，總體系為50(al，其配合和組成可參考PCR提取試劑盒中的配方5 10xPCR反應緩沖液(10mM)， 1 |al dNTP (各2.5 mM)， 2.5^特異引物P1 (10mM)， 2.5pl特異P2 (10mM)， 1 pl Ex-Taq DNA聚合酶(5U/nl)， lplDNA模板，37pl去離子水。
PCR反應參數(shù)為(1)94°C 5min;(2)94。C 30s， 50°C lmin ， 72°C 2min，30個循環(huán);(3) 72。Cl0min。
PCR結(jié)果如圖1所示，擴增得到634bp的單一條帶，由此證明本實施例克隆得到花生球蛋白Ara 3基因上游634bp啟動子片段。
實施例3重組表達載體及重組微生物的制備
報告基因是判斷目的基因是否己經(jīng)成功的導入到受體細胞并且表達的一類標記基因。轉(zhuǎn)基因植物常用的報告基因主要有P-葡萄糖醛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(gw)、胭脂堿合成酶基因("w)、章魚堿合成酶基因(o")、或綠色熒光蛋白基因(g*)等。
本實施例使用應用較為廣泛的GOS基因作為報告基因，GUS基因編碼p-葡萄糖醛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，該酶與X-Gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸)底物發(fā)生作用，產(chǎn)生藍色沉淀反應，既可以用分光光度法測定，又可以直接觀察到植物組織由沉淀形成的藍色斑點。檢測容易、迅速并能當量，只需少量的植物組織即可在短時間內(nèi)測定完成。
本實施例選擇植物雙元表達載體pBI101.1 (市售)，將實施例2的PCR擴增產(chǎn)物(634bp長的花生球蛋白Ara 3基因啟動子)用萬細H I和I雙酶切；對載體pBI101.1進行&mH I和Sma I雙酶切后，用T4連接酶將兩個雙酶切產(chǎn)物連接起來，構(gòu)建得到重組表達載體，并命名為pBA3，其構(gòu)建過程如圖2所示。
用pBA3轉(zhuǎn)化大腸桿菌E"/z'DH5a (市售)，篩選出陽性克??；然后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌A ^me/"c^wEHA105 (市售)，制備得到含有本發(fā)明啟動子的重組微生物。
本實施例中所涉及的雙酶切反應，T4連接酶連接反應，質(zhì)粒提取和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化等操作均采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作。
實施例4根癌農(nóng)桿菌介導的擬南芥轉(zhuǎn)化
由于根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法操作簡便、成本低、轉(zhuǎn)化率高、轉(zhuǎn)化植物穩(wěn)定，是目前應用最廣泛的轉(zhuǎn)基因方法。
本實施例采用實施例3制備的重組微生物轉(zhuǎn)化擬南芥，其具體操作步驟如
下
(1) 將實施例3得到的含有本發(fā)明啟動子的根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于5 mlYEB液體培養(yǎng)基(卡那霉素50|ag/ml，利福平25 |ug/ml )， 28'C下180rpm振蕩培養(yǎng)過夜；
(2) 將上述培養(yǎng)得到的菌液倒入500 ml YEB液體培養(yǎng)基(卡那霉素50嗎/ml,利福平25嗎/ml )， 28。C下180 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，測定OD值為l.O左右；
(3) 將上述菌液分裝到100ml離心管中，5000rpm離心20min，收集菌體；
(4) 用蔗糖轉(zhuǎn)化液(含蔗糖50g/1,表面活性劑SilwetL-77 20(^1/1)懸浮菌體，花浸泡法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，每組植物浸泡約lmin;
(5) 用塑料膜覆蓋轉(zhuǎn)化后的植物24h保持濕潤，轉(zhuǎn)化后的植物在土壤中繼續(xù)生長，待成熟后收集種子，種子在篩選培養(yǎng)基上萌發(fā)篩選(篩選培養(yǎng)基為含
有50 |ng/ml卡那霉素和150pg/ml羧芐青霉素的MS平板)，10天后可得到綠色Ti代植株轉(zhuǎn)入土壤中培養(yǎng)，從^代植物可得到種子并用上述相同篩選培養(yǎng)基篩選得到T2代轉(zhuǎn)基因植株。
實施例5組織化學染色分析
本實施例對實施例4所得到的轉(zhuǎn)基因植株T,代與T2代進行組織化學染色分析，其具體步驟如下
取新鮮樣品置于X-gluc染色液
中，抽真空15min后37。C保溫過夜，用70%乙醇脫色，直到除去葉綠素，脫色后的樣品在光學顯微鏡下觀察拍照或置于70%乙醇中保存。
擬南芥轉(zhuǎn)基因植株^與丁2代不同發(fā)育階段不同部位的染色結(jié)果如圖3所示，圖中，l為花后5天未成熟種子，報告基因尚未表達；2為花后7天種子，可見GUS開始表達和積累；3為成熟種子，可見GUS表達和積累；4為萌發(fā)2天幼苗，5為萌發(fā)3天幼苗，6為萌發(fā)6天幼苗，7為萌發(fā)10天幼苗，在萌發(fā)早期幼苗組織中可見GUS的積累，隨萌發(fā)天數(shù)增加逐漸減弱；8為萌發(fā)20天幼苗，所有組織已檢測不到報告基因的表達；9為成熟葉片，10為帶莖花序和幼嫩角果，在成熟組織中GUS不表達。由此可以看出( L^報告基因特異性地在成熟種子和萌發(fā)初期幼苗組織中表達，在種子發(fā)育初期未見明顯的外源基因表達，在成熟的根、莖、葉、花和角果外殼中也未見外源基因的表達。
本實施例的結(jié)果可以說明本發(fā)明的花生球蛋白Ara3基因啟動子(634bp)能誘導外源基因特異地在種子和萌發(fā)幼苗組織中表達。花生球蛋白Ara 3基因啟動子在驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因植物種子中特異表達上的應用序列表SEQUENCE LISTING
<110〉 中山大學
<120〉 花生球蛋白Ara
3基因啟動子在驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因植物種子中特異表達上的應用
〈130>〈歸 2
<170> Patentln version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 27
<212〉 DNA<213>人工序列
<柳〉1
cgcggatccg ggcaggtaaa aataatt 27
<210> 2
〈211〉 26
<212> DNA<213>人工序列
<柳> 2
tcccccgggt tgtgatgaag gagaat 26
1權(quán)利要求
1、花生球蛋白Ara 3基因啟動子在驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因植物種子中特異表達上的應用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于所述應用為用權(quán)利要求1所 述花生球蛋白Ara3基因啟動子、外源基因和植物雙元表達載體構(gòu)建重組表達 載體表達外源基因。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述應用，其特征在于所述植物雙元表達載體為pBI101 載體、pBI121載體、pCAMBIA載體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述應用，其特征在于所述應用為用權(quán)利要求2所述 重組表達載體轉(zhuǎn)化埃希氏大腸桿菌或土壤根癌農(nóng)桿菌制備重組微生物。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述應用，其特征在于所述應用是用權(quán)利要求1所述 花生球蛋白Ara3基因啟動子轉(zhuǎn)化植物細胞制備轉(zhuǎn)基因細胞系。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述應用，其特征在于所述應用是用權(quán)利要求1所述 花生球蛋白Ara3基因啟動子轉(zhuǎn)化植物制備轉(zhuǎn)基因植物體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種花生球蛋白Ara 3基因啟動子在驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因植物種子中特異表達的應用，該啟動子為花生球蛋白基因Ara 3上游第1位～第634位共長634bp的序列。本發(fā)明的啟動子可與外源基因連接插入表達載體中構(gòu)建重組表達載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞或宿主組織及其后代，實現(xiàn)植物的品質(zhì)改良或生產(chǎn)外源蛋白。本發(fā)明的啟動子把外源基因的表達局限在種子或胚組織中，避免了外源蛋白在成熟的根莖等器官中的積累所造成的對植物生長的影響和能量物質(zhì)的浪費。本發(fā)明的啟動子誘導外源基因在種子中特異表達，且表達產(chǎn)物被貯存在成熟種子中，有利于表達產(chǎn)物的高水平累積，且可在常規(guī)條件下長期保存，也有利于表達產(chǎn)物的純化回收。
文檔編號A01H5/00GK101538584SQ200910038619
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日
發(fā)明者林曉東, 鐘玉娟, 黃上志, 茵 黎 申請人:中山大學