專利名稱：一種春結球甘藍育種保持自交系春性的繁殖方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物育種技術領域，涉及利用一種二年生植物組織的培養(yǎng)實 現(xiàn)作物春季品種選育的方法，尤其是一種春結球甘藍育種保持自交系春性的 繁殖方法。
背景技術：
結球甘藍(■Srassics o7e_r<3ces. L , Far. caAzYsz^g L.)屬于十字花禾斗 蕓薹屬中一種重要蔬菜，它具有品質優(yōu)良、營養(yǎng)豐富、食用多樣、耐貯運等 特點，世界各國普遍栽培。據(jù)報道，2006年中國結球甘藍播種面積達到93. 73 萬hm2，在國內蔬菜栽培和周年供應中占居重要地位。結球甘藍適應性強， 一年內可分為春、夏、秋等多季節(jié)、多茬次上市，對緩解市場淡旺季、滿足 鮮菜周年均衡供應起著關鍵性作用；特別是近年來隨著消費者生活水平的不 斷提高和設施栽培的大力發(fā)展，促使春結球甘藍栽培面積迅速擴大。結球甘 藍為典型的綠體春化型二年生作物，只有植株營養(yǎng)體達到一定體積，經過一 定低溫感應才能通過春化，因而一年只能完成一個生長時期，這就對于適宜 春季栽培的春早熟雜種一代品種及其親本的選育極為不利，并帶來了育種障 礙，使春季栽培的春結球甘藍在春季很難育種。如果春季栽培的結球甘藍親 本自交系經常在秋季進行篩選，就會導致春季栽培品種的春性嚴重退化，春 結球甘藍品種在春季適應性減弱，如容易出現(xiàn)結球性、耐低溫性、耐弱光性 差，也易發(fā)生先期抽薹現(xiàn)象。雖然科學家已研究出能夠采用春季結球甘藍腋 芽扦插繁殖方法保留親本自交系的春性，但腋芽扦插苗栽培期長，經過夏、 秋季，易受夏季高溫、干旱影響，使扦插苗成活率很低，并且成本也很高； 即使成活苗秋季栽培，也會因苗齡過長、植株衰老，秋季病害危害會導致植株過早死亡，失去所選育的自交系材料。這就嚴重影響著選育適宜春季栽培 品種的春結球甘藍的育種進程。
一種在春季正常進行春結球甘藍育種，既能保持所選育雜種一代品種的 親本自交系在春季所具有的表現(xiàn)特性(春性)，又能保證所選自交系的正常 存活，或擴大其繁殖系數(shù)增加自交系植株數(shù)量，使自交系正常完成生活周期， 這就成為本領域技術人員研究的熱點(創(chuàng)新點)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，提供一種春結球甘藍育種保持自交系春性的繁殖方 法。該方法首次選用結球甘藍自交系成熟葉球的綠色葉片作為外植體，進行 組織培養(yǎng)，擬獲得一種具有高誘導率的再生苗，并保持原自交系春性的繁殖 方法。
為了實現(xiàn)上述任務，本發(fā)明采取如下的技術解決方案 一種春結球甘藍育種保持自交系春性的繁殖方法，其特征在于，包括下 列步驟
1) 外植體選擇
以春季正常栽培春結球甘藍自交系，將入選的春性表現(xiàn)優(yōu)良的植株葉球 的外層綠色葉片，切成lcm2左右的小片作為離體培養(yǎng)的外植體；
2) 不定芽的分化誘導
把外植體接種到培養(yǎng)瓶內的不定芽分化誘導培養(yǎng)基上，在溫度25aC， 每天12h 14h光照，光照強度2000 2500Lx條件下培養(yǎng)，經20 30天
誘導出不定芽；
所述的不定芽分化誘導培養(yǎng)基的配方是:在MS培養(yǎng)基中加入3%蔗糖(質 量)、0.8%瓊脂(質量)、3.0mg/L的6-芐基腺嘌呤(6-BA)及0. 4mg/L的 a-萘乙酸(NAA);
3) 不定芽的生根誘導待不定芽生長至1. 5 2. 5cm高時，自不定芽基部切下將其轉入培養(yǎng)瓶 內的不定芽誘導根培養(yǎng)基上，在溫度25°C，每天10h 12h光照，光照強 度2000 2500Lx的條件下培養(yǎng)，經15 20天誘導生根，獲得再生苗；
所述的不定芽誘導根培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中加入3%蔗糖(質量)、 0.8%瓊脂(質量)和0.5 1.0mg/L的a-萘乙酸(NAA)。
4)再生苗的鍛煉與移栽
將有再生苗的培養(yǎng)瓶口打開鍛煉3 5天，從培養(yǎng)瓶中取出再生苗，洗 去根部的培養(yǎng)基，移植到裝有營養(yǎng)土的塑料缽中促使其緩苗生長，在秋季， 當再生苗有5 7片真葉時，適應性煉苗7天后定植于田間(露地)。
本發(fā)明首次選擇春結球甘藍葉球綠色葉片作為植株再生離體培養(yǎng)的外 植體，保證了春結球甘藍自交系在春季結球期植株農藝性狀的選擇和保持了 自交系的春性，克服了其他方法(如子葉、下胚軸誘導培養(yǎng)等)不能進行田 間選擇保持春性的缺陷；保證了春結球甘藍自交系的存活，不受夏季高溫、 強光、干旱等不利因素影響，能大幅度提高自交系同一基因型植株數(shù)，擴繁 株數(shù)50倍以上。


圖1-1是實施例春結球甘藍自交系YCF51-99-835168春季葉球成熟期圖； 圖1-2是實施例春結球甘藍自交系YCF51-99-835168春季品種育種入選 單株圖1-3是實施例春結球甘藍自交系YCF51-99-835168葉球葉片外植體圖； 圖2_1是實施例春結球甘藍自交系BMP01-88-561336葉球葉片(外植體) 不定芽誘導圖2-2是實施例春結球甘藍自交系BMP01-88-561336不定芽的根誘導圖； 圖2-3是實施例春結球甘藍自交系BMP01-88-561336再生苗移栽培養(yǎng)缽圖。以下結合附圖和發(fā)明人給出的實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
按照本發(fā)明的技術方案，春結球甘藍育種保持自交系春性的繁殖方法， 具體按下列步驟進行
1) 外植體選擇
以春季正常栽培春結球甘藍自交系，將入選的春性表現(xiàn)優(yōu)良的植株葉球 的外層綠色葉片，切成lcm2左右的小片作為離體培養(yǎng)的外植體。
2) 不定芽分化誘導培養(yǎng)基制備
不定芽分化誘導培養(yǎng)基配方為在MS培養(yǎng)基中加入396蔗糖(質量)、0. 8% 瓊脂(質量)、3. 0mg/L的6-芐基腺嘌呤(6-BA)及0. 4mg/L的a -萘乙酸(NAA)。
3) 不定芽誘導根培養(yǎng)基的制備
不定芽誘導根培養(yǎng)基配方為在MS培養(yǎng)基中加入3%蔗糖(質量)、0. 8% 瓊脂(質量)和0.5 1.0mg/L的a-萘乙酸(NM)。
4) 不定芽的分化誘導
把外植體接種到培養(yǎng)瓶內的不定芽分化誘導培養(yǎng)基上，在溫度25°C， 每天12h 14h光照，光照強度2000 2500Lx條件下培養(yǎng)，經20 30天(d) 誘導出不定芽。
5) 不定芽的生根誘導
待不定芽生長至1. 5 2. 5cm高時，自不定芽基部切下將其轉入培養(yǎng)瓶 內的不定芽誘導根培養(yǎng)基上，在溫度25'C，每天10h 12h光照，光照強度 2000 2500Lx的條件下培養(yǎng)，經15 20天(d)誘導生根，獲得再生苗。
6) 再生苗的鍛煉與移栽
將有再生苗的培養(yǎng)瓶口打開鍛煉3 5天(d)，從培養(yǎng)瓶中取出再生苗， 洗去根部的培養(yǎng)基，移植到裝有營養(yǎng)土的塑料缽中促使其緩苗生長。在秋季， 當再生苗有5 7片真葉時，適應性煉苗7天(d)后定植于田間(露地)。上述MS培養(yǎng)基的制備方法詳見李浚明《植物組織培養(yǎng)教程》(第二版， 北京中國農業(yè)大學出版社，2002， 32 38)。
以下是發(fā)明人給出的實施例需要說明的是，這些實施例是一些較佳 的實施例，根據(jù)實驗證明，本發(fā)明不限于這些實施例。 實施例l:
本實施例選用申請人的春結球甘藍育種研究室新育成的春結球甘藍品 種"秦甘50"(國家品種鑒定)的父本(自交系YCF51-99-835168)的早代為 實驗材料。
1) 外植體選擇
春結球甘藍自交系YCF51-99-835168的早代于12月20日冷床育苗，3片真 葉分苗一次，當幼苗長有6 7片真葉時，于3月中旬定植在露地。田間按春 結球甘藍露地栽培正常管理，當植株生長葉球成熟時(圖l-l)，田間選擇符 合育種目標、農藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良的植株(圖l-2),選其葉球葉片作為植株再 生離體培養(yǎng)的外植體(圖l-3)。
2) 再生植株誘導培養(yǎng) ①不定芽的誘導
選用春結球甘藍自交系YCF51-99-835168的早代成熟葉球的外層綠色葉 片，將葉片切成lci^左右的小方片，用75%酒精(40 50秒)、0. 1%升汞(8 IO分)消毒；接種于不定芽誘導根培養(yǎng)基中，不定芽誘導根培養(yǎng)基的配方為 在MS培養(yǎng)基中加入39&蔗糖(質量)、0.8%瓊脂(質量)、3. 0mg/L的6-芐基腺 嘌呤(6-BA)及0.4mg/L的a-萘乙酸(NM)。
在溫度25'C，每天12h 14h光照，光照強度2000 2500Lx條件下培養(yǎng)， 經20 30天(d)誘導出不定芽。根據(jù)秋季田間(露地)適宜定植時間(陜 西定植時間為8月下旬)，可繼代1 3代，延長培養(yǎng)時間。春結球甘藍自交系 YCF51-99-835168的早代誘芽率86. 5%，分化率128%。
7上述誘芽率(％) ^誘導出芽的外植體數(shù)/總外植體數(shù)X100(以下相同)；
分化率(％) 二分化的總芽數(shù)/總外植體數(shù)xioo(以下相同)。
② 不定根的誘導
待不定芽生長至1. 5 2. 5cm高時，自不定芽基部切下將其轉入培養(yǎng)瓶 內的不定芽誘導根培養(yǎng)基上，不定芽誘導根培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中加入 3%蔗糖(質量)、0.8%瓊脂(質量)和0.5 1.0mg/L的a-萘乙酸(NAA)。 在溫度25°C，每天10h 12h光照，光照強度2000 2500Lx的條件下培 養(yǎng)，經15 20天(d)誘導生根，生根率100%。
③ 再生苗移栽
將有再生苗的培養(yǎng)瓶口打開鍛煉3 5天(d)，從培養(yǎng)瓶中取出再生苗， 洗去根部的培養(yǎng)基，移植到裝有營養(yǎng)土的塑料缽中促使其緩苗生長。在8 月下旬，當再生苗有5 7片真葉時，適應性煉苗7天(d)后定植于田間(露 地)。秧苗成活率95%，以后管理同于常規(guī)田間(露地)管理。 實施例2:
本實施例選用申請人的春結球甘藍育種研究室新育成的春結球甘藍品
種"秦甘50"(國家品種鑒定)的母本(自交系BMP01-88-561336)的早代為 實驗材料。
1) 外植體選擇
母本自交系BMP01-88-561336的早代田間培養(yǎng)和外植體選擇方法同父本 自交系YCF51-99-835168的早代(參看實施例1)。
2) 再生植株誘導培養(yǎng) ①不定芽的誘導
選取入選春結球甘藍自交系BMP01-88-561336的早代葉球的外層綠色葉 片作為離體培養(yǎng)的外植體。采集葉片后帶回實驗室，先用流水沖洗3次，再 在超凈工作上用75%酒精浸泡50秒(s)， 0. 1%升汞消毒10分(min)、無菌水沖洗3遍，然后將葉片切成邊長為lcm的正方形方塊后，葉背朝下，接種于不 定芽誘導根培養(yǎng)基中，不定芽誘導根培養(yǎng)基配方是，在MS培養(yǎng)基中加入3呢 蔗糖(質量)、0. 8%瓊脂(質量)、3. 0mg/L的6-芐基腺嘌呤(6-BA)及O. 4mg/L 的a -萘乙酸(NM)。在溫度25。C ，每天12h 14h光照，光照強度2000 2500Lx 條件下培養(yǎng)，經20 30天(d)誘導出不定芽。根據(jù)秋季田間(露地)適宜 定植時間(陜西定植時間為8月下旬)，可繼代1 3代，延長培養(yǎng)時間。春結 球甘藍自交系BMP01-88-561336的早代誘芽率91.5%，分化率135% (圖2-1)。
② 不定根的誘導
待不定芽生長至1. 5 2. 5cm高時，自不定芽基部切下將其轉入培養(yǎng)瓶 內的不定芽誘導根培養(yǎng)基上，不定芽誘導根培養(yǎng)基為，在MS培養(yǎng)基中加入 3%蔗糖(質量)、0.8%瓊脂(質量)和0.5 1.0mg/L的a-萘乙酸(NAA)。 在溫度25°C，每天10h 12h光照，光照強度2000 2500Lx的條件下培 養(yǎng)，經15 20天(d)誘導生根，生根率100%。
③ 再生苗移栽
將有再生苗的培養(yǎng)瓶口打開鍛煉3 5天(d)，從培養(yǎng)瓶中取出再生苗， 洗去根部的培養(yǎng)基，移植到裝有營養(yǎng)土的塑料缽中促使其緩苗生長。在8 月下旬，當再生苗有5 7片真葉時(圖2-3)，適應性煉苗7天(d)后定 植于田間(露地)。秧苗成活率97%，以后管理同于常規(guī)田間(露地)管理。
權利要求
1. 一種春結球甘藍育種保持自交系春性的繁殖方法，其特征在于，包括下列步驟1)外植體選擇以春季正常栽培春結球甘藍自交系，將入選的春性表現(xiàn)優(yōu)良的植株葉球的外層綠色葉片，切成1cm2左右的小片作為離體培養(yǎng)的外植體；2)不定芽的分化誘導把外植體接種到培養(yǎng)瓶內的不定芽分化誘導培養(yǎng)基上，在溫度25℃，每天12h～14h光照，光照強度2000～2500Lx條件下培養(yǎng)，經20～30天誘導出不定芽；所述的不定芽分化誘導培養(yǎng)基的配方是在MS培養(yǎng)基的基礎上，加入3％蔗糖(質量)、0.8％瓊脂(質量)、3.0mg/L的6-芐基腺嘌呤(6-BA)及0.4mg/L的α-萘乙酸(NAA)；3)不定芽的生根誘導待不定芽生長至1.5～2.5cm高時，自不定芽基部切下將其轉入培養(yǎng)瓶內的不定芽誘導根培養(yǎng)基上，在溫度25℃，每天10h～12h光照，光照強度2000～2500Lx的條件下培養(yǎng)，經15～20天誘導生根，獲得再生苗；所述的不定芽誘導根培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中加入3％蔗糖(質量)、0.8％瓊脂(質量)和0.5～1.0mg/L的α-萘乙酸(NAA)。4)再生苗的鍛煉與移栽將有再生苗的培養(yǎng)瓶口打開鍛煉3～5天，從培養(yǎng)瓶中取出再生苗，洗去根部的培養(yǎng)基，移植到裝有營養(yǎng)土的塑料缽中促使其緩苗生長，在秋季，當再生苗有5～7片真葉時，適應性煉苗7天后定植于田間露地。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種春結球甘藍育種保持自交系春性的繁殖方法，在春季選取春結球甘藍自交系的成熟葉球的外層綠色葉片，按照一定大小接種在不定芽分化誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，當不定芽生長至1.5～2.5cm高時，轉接到不定根分化誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得完整再生苗。隨后將再生苗移至培養(yǎng)土中進行培養(yǎng)，當幼苗生長有5～7片真葉時，適應性煉苗7天后定植于田間(露地)，秧苗成活率達95％以上。采用本發(fā)明方法能夠提高春結球甘藍育種效果，保證春結球甘藍自交系在春季完成結球期和在此期的植株農藝性狀選擇，并保持所選植株特性(春性)不變，保證自交系完成生活周期；能夠大幅度提高自交系同一基因型植株數(shù)量，擴繁株數(shù)50倍以上。
文檔編號A01H4/00GK101473791SQ20091002110
公開日2009年7月8日 申請日期2009年2月11日 優(yōu)先權日2009年2月11日
發(fā)明者張恩慧, 張高翔, 朱守亮, 李宏偉, 楊安平, 程永安, 許忠民, 馬青山 申請人:西北農林科技大學