專利名稱：利用組織培養(yǎng)技術(shù)高效繁殖多年生野生大豆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的繁殖野生大豆的方法，具體涉及一種利用組 織培養(yǎng)技術(shù)高效繁殖多年生野生大豆的方法。
技術(shù)背景多年生野生大豆是豆科(Leguminosae)、蝶形花亞科(Papiliomatae)、大豆 屬、Glycine亞屬。Glycine亞屬有22個(gè)多年生野生種。主要分布在澳大利亞 及南太平洋島嶼，我國臺(tái)灣及福建、廣東沿海島嶼有G.tabacinaBenth.(煙豆) 和G. tomentella Hayata (短絨野大豆)2個(gè)種分布。大豆屬還有soya亞屬， 有兩個(gè)種，分別是栽培大豆(G. maxMerr.)和一年生野生大豆(G. soja Sieb. & Zucc.)。 一年生野生大豆是栽培大豆的祖先。野生大豆遍布東亞的中國、朝鮮、 日本及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)。栽培大豆起源于中國。大豆屬物種二倍體的基因組 2n=40。單倍體基因組分析、RFLP標(biāo)記分析表明大豆是一個(gè)古四倍體，其基因組 經(jīng)過長期進(jìn)化而二倍化。由于人類的干預(yù)，野生大豆資源的棲息地不斷縮減，這 些植物資源如同石油，礦產(chǎn)一樣，是不可再生的。野生大豆被列為國家二級(jí)保護(hù) 植物。Glycine亞屬的野生種和栽培大豆相比，很多性狀具有潛在的應(yīng)用價(jià)值， 如中日性、耐熱、耐旱、耐冷、耐鹽、抗大豆孢囊線蟲、抗花葉病毒病、抗根腐 病、花序多花性、莢的多粒性等。但迄今將野生多年生大豆的外源性狀引入栽培 大豆尚未成功。隨著有性雜交和體細(xì)胞雜交研究的不斷深入，以及基因克隆及基 因轉(zhuǎn)移技術(shù)的應(yīng)用，可望使以前大豆改良中難以利用的種質(zhì)資源加入大豆的育種 計(jì)劃中。野生大豆都具有厚厚的種皮，或者種皮外長有泥膜，可以防止種子在不利生 長的環(huán)境中因遇水吸漲而過早萌發(fā)。這個(gè)特性對于生長在原生境下野生大豆非常 有利，但是對于需要在栽培條件下栽培和繁殖的野生大豆資源來講，對于播種及 出苗是不利的。尤其對于種子數(shù)量很少的多年生野生大豆資源，其繁殖主要存在兩個(gè)問題 一是出苗率低。為使多年生野生大豆的種子及時(shí)萌發(fā)，常規(guī)的方法是 在播種前破壞種皮，然后播種于土壤或基質(zhì)中。但在田間種植時(shí)，過早劃破種皮 的種子往往受到土壤中微生物的影響，損失部分種子。在種子萌發(fā)后至成為壯苗 之前，會(huì)遇到土壤害蟲的為害，也會(huì)降低成苗率。另一個(gè)問題是，多年生野生大 豆一粒種子只能長出一棵幼苗，對于在苗期材料，或者那些根部不能發(fā)出新枝的 材料來說， 一粒種子只能長成一棵植株，如果在收獲成熟種子之前遇到不利環(huán)境， 造成植株死亡就不能留下后代。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利申請?zhí)?00410050905.6,發(fā)明名稱為萬帶蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)技術(shù)，該專利提出涉及一種萬帶蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)技術(shù)，采用人工營養(yǎng)基利用無菌播種的方法能獲得大量試管苗，并 利用無菌實(shí)生苗的莖尖或莖節(jié)進(jìn)行叢生芽的增殖并通過生根培養(yǎng)能形成完整植 株。該專利涉及萬帶蘭的無菌播種和組織培養(yǎng)繁殖的方法及所使用的培養(yǎng)基。是 利用無菌播種，利用無菌實(shí)生苗的莖尖或莖節(jié)進(jìn)行叢生芽的增殖。這種方法往往 是利用無菌實(shí)生苗來得到莖尖，節(jié)間等來產(chǎn)生叢生芽，進(jìn)行大量繁殖，而對于實(shí) 生苗本身不再利用，這樣對于一些珍稀材料，或種子很少的材料來講，直接采用 組織培養(yǎng)方式進(jìn)行大量繁殖會(huì)有一些風(fēng)險(xiǎn)，必須保證有一定數(shù)量的種子，才能進(jìn) 行組織培養(yǎng)的方法增殖。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)高效繁 殖多年生野生大豆的方法，既解決了種子數(shù)量少，進(jìn)行組織培養(yǎng)方法增殖會(huì)損失 種子的風(fēng)險(xiǎn)，也解決了目前多年生野生大豆繁殖出苗率低，以及在收獲成熟種子 之前遇到不利環(huán)境或因素，植株整株死亡，不能留下后代的問題。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，根據(jù)繁殖材料性質(zhì)和種子的數(shù)量的差 別，可以采用以下兩種方案，即在種子數(shù)量極少，每份遺傳上同質(zhì)的材料只有l(wèi)-2粒種子時(shí)，采用方法一；當(dāng)要繁殖的材料有2粒以上的種子，采用方法二。 所述方法一，包括以下步驟第一步，種子滅菌及多年生野生大豆無菌苗的獲得取成熟的多年生野生大 豆種子，用氯氣或過飽和漂白粉精片溶液進(jìn)行種子滅菌，用手術(shù)刀將種皮劃破。將劃破種皮的多年生野生大豆種子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)得到無菌苗， 為"第二步"提供植物材料。如果只用種子直接繁殖，不需要組織培養(yǎng)增殖，此 步驟不需要種子滅菌。所述萌發(fā)培養(yǎng)基為現(xiàn)有的MS培養(yǎng)基、Bs培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基的無機(jī)成分加上 Bs培養(yǎng)基的有機(jī)成分，培養(yǎng)溫度為24'C-26'C。第二步，增殖及生根待實(shí)生苗長至10cm，從無菌苗頂端向下3cm-4cm處切 下莖端，將無菌苗莖段的植物學(xué)下端插入生根培養(yǎng)基中生根，作為第四步的材料； 切去頂端的野生大豆實(shí)生苗作為第三步的材料。所述生根培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為24°C-26°C。為第三步的盆栽 及第四步的繼續(xù)增殖準(zhǔn)備材料。第三步，盆栽將裝有切去頂端的實(shí)生苗的瓶子打開，在培養(yǎng)室內(nèi)生長3天， 移栽到裝有滅菌的基質(zhì)(或土)的盆中。在24'C-26'C條件下培養(yǎng)，待長出新枝 后，將盆轉(zhuǎn)移到戶外。盆栽野生大豆在戶外生長一周后移栽到田間。如果該材料 不能在當(dāng)?shù)厥彝庠蕉?，則采用盆栽方式。第四步，第二步得到的已經(jīng)生根的實(shí)生苗頂端幼莖，在生根培養(yǎng)基中經(jīng)過半 個(gè)月的培養(yǎng)，長出很多健康的根。如果需要繼續(xù)繁殖，可以將已經(jīng)伸長的莖端切 下，重復(fù)第二步的步驟。所述方法二，包括以下步驟第一步，種子萌發(fā)取成熟的多年生野生大豆種子，用手術(shù)刀將種皮劃破。將劃破種皮的多年生野生大豆種子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，使種子萌發(fā)，為"第二 步"提供植物材料。所述萌發(fā)培養(yǎng)基為現(xiàn)有的MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基的無機(jī)成分加上 B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分，培養(yǎng)溫度為24'C-26'C。第二步，盆栽待種子萌發(fā)3-4天，種子長出幼根，脫掉種皮，將幼苗植入 經(jīng)過滅菌的土壤或基質(zhì)中， 一個(gè)月后，換盆移栽到田間。如果該材料不能在當(dāng)?shù)?室外越冬，則采用盆栽方式。本發(fā)明雖然也是使用無菌播種及組織培養(yǎng)技術(shù)，但不同的是在無菌苗長到足 夠大之后，切下上端，將帶有正常根系的下端移栽到土壤或基質(zhì)中，使其成苗。這樣用來播種得到無菌實(shí)生苗的種子也長成一棵植株，對于種子稀少的材料或雜 交得到的種子可以采用這種方式繁殖，采用這種方法可以保證每一粒種子都能夠 得到健康的植株，同時(shí)利用組織培養(yǎng)的方式大量繁殖遺傳上同質(zhì)的植株。另外實(shí) 生苗的根系強(qiáng)壯，將培養(yǎng)基中的實(shí)生苗移栽得到的植株，比經(jīng)過叢生芽生根得到 的植株強(qiáng)壯，根系發(fā)達(dá)，生長迅速，開花，結(jié)實(shí)早，移栽的成活率高。另外對于 多年生野生大豆的繁殖，現(xiàn)有技術(shù)中尚沒有使用無菌播種組織:培養(yǎng)繁殖。采用上述兩種方法，從方法一的第一步至第三步，方法二的第一步至第二步， 如果沒有人為操作失誤，種子的成苗率可以達(dá)到99%-100%。方法一經(jīng)過第四步， 一粒多年生野生大豆種子可以得到兩株或兩株以上更多的在遺ft上同質(zhì)的植株。 該方法也可以用于雜交種F。代的繁殖，用較少的F。種子得到較多同質(zhì)的F,植株， 并得到更多的R種子。這樣對于雜交困難或者結(jié)實(shí)周期長的物禾中來說，只要一次 雜交成功， 一粒雜交種子就可以繁殖多個(gè)F,植株。因此這種方法不但可以用于資 源的繁殖、保存，還可以用于雜交育種及科學(xué)研究，可以最大限度地利用種子及 種質(zhì)資源繁殖材料。本發(fā)明可用于多年生野生大豆Glycine亞屬22個(gè)種的材茅斗的繁殖，并可為 大豆屬其它種、屬內(nèi)或與其它屬間雜種的無菌播種和繁殖提供方纟去(對于種皮較 薄，種子可以吸水萌發(fā)的種子，可以省去用刀劃破中皮的步驟)。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下 進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限 于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1步驟1:種子滅菌用漂白粉精片過飽和溶液浸泡野生大豆種子15么H中，無菌水漂 洗3次或用氯氣消毒2-10小時(shí)；割破種皮無菌條件下用手術(shù)刀將野生大豆種皮劃破；播種及萌發(fā)培養(yǎng)基將劃破種皮的種子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，萌發(fā)培養(yǎng)基為 MS、 B5或MS無機(jī)+B5有機(jī)固體培養(yǎng)基；種子萌發(fā)培養(yǎng)培養(yǎng)基上的種子在24X:-26'C條件下萌發(fā)。 步驟2種子在萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)待無菌實(shí)生苗長至10cm高時(shí)，切下上部莖端；步驟3生根從無菌苗頂端向下3-4cm處切下莖段，將莖段的植物學(xué)下端插入生根 培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為24'C-26'C;移栽將切去頂端的實(shí)生苗移栽到滅菌的基質(zhì)(或土)的盆中。24°C-26°C 條件下培養(yǎng)，待長出新枝后，將盆轉(zhuǎn)移到戶外，如果該材料不能在當(dāng)?shù)厥彝庠蕉?則采用盆栽方式；步驟4增殖步驟2中得到的實(shí)生苗莖端，在生根培養(yǎng)基中長出健康的根(15天)。 如需繼續(xù)繁殖，將已經(jīng)伸長的莖端切下，重復(fù)步驟2的操作，生根培養(yǎng)基為MS 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度24°C-26°C;本實(shí)施例效果從步驟第1步至第3步的成苗率達(dá)99%-100%，再通過第4 步的增殖，一粒多年生野生大豆種子可以得到兩株或兩株以上更多的在遺傳上同 質(zhì)的植株。本實(shí)施例應(yīng)用該方法可用于雜交種FO代的繁殖，用較少的FO種子得到較 多同質(zhì)的Fl植株，得到更多的Fl種子。尤其適于雜交困難或者生長周期長的物 種。該方法可用于資源的繁殖、保存，以及雜交育種及相關(guān)研究，可最大限度地 利用種子繁殖材料。實(shí)施例2 步驟l種子滅菌、割破種皮、萌發(fā)培養(yǎng)基同實(shí)施例l。 種子萌發(fā)培養(yǎng)基上的種子在24。C-26'C條件下萌發(fā)。 步驟2種子在萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)及移栽3天后長出幼根，將幼苗轉(zhuǎn)移到滅菌的土 壤或基質(zhì)中。30天后移栽到室外(不能在陸地越冬時(shí)盆栽)。本實(shí)施例效果只要種子能夠正常萌發(fā)，成苗率可以達(dá)到99.5%-100%。 本實(shí)施例應(yīng)用該方法適用于種子較少的野生大豆材料(包括一年生野生大 豆和多年生野生大豆)的繁殖。實(shí)施例3 步驟1種子滅菌、割破種皮、萌發(fā)培養(yǎng)基同實(shí)施例l。 種子萌發(fā)培養(yǎng)基上的種子在室溫萌發(fā)(18°C-28°C)。。步驟2種子在萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)及移栽3-4天后幼苗移栽到滅菌的土壤或基質(zhì)中(18-23。C,4d， 23-28。C，3d)其余同實(shí)施例2。本實(shí)施例效果只要種子能夠正常萌發(fā)，成苗率可以達(dá)到99.5%-100%。本實(shí)施例應(yīng)用該方法適用于種子較少的野生大豆材料(包括一年生野生大豆和多年生野生大豆)的繁殖。實(shí)施例4 步驟l割破種皮手術(shù)刀將野生大豆種皮劃破。萌發(fā)培養(yǎng)基將種子種于改良的MS、 Bs或MS +85固體培養(yǎng)基。 種子萌發(fā)培養(yǎng)基上的種子在室溫萌發(fā)(18°C-28°C)。。 步驟2同實(shí)施例3本實(shí)施例效果和實(shí)施例2相比，不需無菌操作，成苗率高可以達(dá)到99%-1000/0。本實(shí)施例應(yīng)用適用種子較少的野生大豆材料、未成熟大豆種子的萌發(fā)和成苗，適合生產(chǎn)和科研單位用。以上實(shí)施例中使用的培養(yǎng)基為現(xiàn)有技術(shù)，具體說明如下 注基本培養(yǎng)基配方(mg/L) MS固體培養(yǎng)基配方無機(jī)成分硝酸鉀認(rèn)03 1900，硝酸銨 NH4N03 1650，磷酸二氫鉀 KH2P04 170，硫酸鎂MgS04.7H20 370，氯化鈣 CaC12.2H20 440，碘化鉀 KI 0.83， 硼酸 H3B03 6.2，硫酸錳 MnS04. 4H20 22.3，硫酸鋅 ZnS04. 7 H20 8.6，鉬 酸鈉 Na2Mo04. 2 H20 0. 25，硫酸銅 CuS04. 5 H20 0. 025，氯化鈷 CoC12. 62 0.025，乙二胺四乙酸二鈉 Na2. EDTA 37. 3，硫酸亞鐵 FeS024. 7H20 27. 8。有機(jī)成分肌醇100，甘氨酸2，鹽酸硫胺素VB10. 1，鹽酸吡哆醇VB6 0.5，煙酸 VB5或VPP 0.5，蔗糖 30 000，瓊脂10 000。Ph值5.8。B5固體培養(yǎng)基配方(mg/L)無機(jī)成分NaH2P04'H20(磷酸二氫鈉)150， KN03(硝酸鉀)2 500， (NH4)2S04(硫酸銨)134， MgS04'7H20(硫酸鎂)250， CaC12'2H20(氯化鈣)150， Na-Fe-EDTA(乙二胺四乙酸鐵鈉)28， MnS04'H20(硫酸錳)10， H3B03(硼酸)3.0， ZnS04'7H20(硫酸鋅)2.0， NaMo04'2H20(鉬酸鈉)0.25， CuS04'5H20(硫酸銅) 0.025， CoC12'6H20(氯化鈷)0.025， KI (碘化鉀)0.75。有機(jī)成分鹽酸硫胺素10，鹽酸吡哆素1，煙酸1，肌-肌醇100，蔗糖20 000。瓊脂10 000。pH值5.5。改良的MS固體基本培養(yǎng)基、改良的B5固體基本培養(yǎng)基和改良的MS無機(jī)+Bs 有機(jī)固體培養(yǎng)基其它成分分別同MS固體基本培養(yǎng)基、Bs固體基本培養(yǎng)基和MS 無機(jī)+B5有機(jī)固體培養(yǎng)基，只是不加蔗糖。
權(quán)利要求
1. 一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)高效繁殖多年生野生大豆的方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，種子滅菌及多年生野生大豆無菌苗的獲得取成熟的多年生野生大豆種子，用氯氣或過飽和漂白粉精片溶液進(jìn)行種子滅菌，用手術(shù)刀將種皮劃破，將劃破種皮的多年生野生大豆種子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)得到無菌苗，為第二步提供植物材料；所述萌發(fā)培養(yǎng)基為現(xiàn)有的MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基，或MS培養(yǎng)基的無機(jī)成分加上B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分；第二步，增殖及生根待實(shí)生苗長至10cm，從無菌苗頂端向下3cm-4cm處切下莖端，將無菌苗莖段的植物學(xué)下端插入生根培養(yǎng)基中生根，作為第四步的材料，切去頂端的野生大豆實(shí)生苗作為第三步的材料；所述生根培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基；第三步，盆栽將裝有切去頂端的實(shí)生苗的瓶子打開，在培養(yǎng)室內(nèi)生長3天，再移栽到裝有滅菌的基質(zhì)或土的盆中，待長出新枝后，將盆轉(zhuǎn)移到戶外，盆栽野生大豆在戶外生長一周后移栽到田間；第四步，第二步得到的已經(jīng)生根的實(shí)生苗頂端幼莖，在生根培養(yǎng)基中經(jīng)過半個(gè)月的培養(yǎng)，長出很多健康的根。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用組織培養(yǎng)技術(shù)高效繁殖多年生野生大豆的方 法，其特征是，第一步到第三步中，所述培養(yǎng)的溫度為24。C-26°C。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用組織培養(yǎng)技術(shù)高效繁殖多年生野生大豆的方 法，其特征是，第四步中，如果需要繼續(xù)繁殖，將已經(jīng)伸長的莖端切下，重復(fù)第 二步的步驟。
4、 一種利用組織培養(yǎng)技術(shù)高效繁殖多年生野生大豆的方法，其特征是，包 括以下步驟第一步，種子萌發(fā)取成熟的多年生野生大豆種子，用手術(shù)刀將種皮劃破。將劃破種皮的多年生野生大豆種子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，使種子萌發(fā)，為第二步提供植物材料；所述萌發(fā)培養(yǎng)基為現(xiàn)有的MS培養(yǎng)基，Bs培養(yǎng)基，或MS培養(yǎng)基的無機(jī)成分加上Bs培養(yǎng)基的有機(jī)成分；第二步，盆栽待種子萌發(fā)3-4天，種子長出幼根，脫掉種皮，將幼苗植入 經(jīng)過滅菌的土壤或基質(zhì)中， 一個(gè)月后，換盆移栽到田間。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用組織培養(yǎng)技術(shù)高效繁殖多年生野生大豆的方 法，其特征是，第一步中，所述萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)溫度為24'C-26 。C。
全文摘要
一種農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的利用組織培養(yǎng)技術(shù)高效繁殖多年生野生大豆的方法，包括以下步驟第一步，種子滅菌，劃破種皮，在萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌苗。第二步，待無菌苗長至10cm，切下無菌苗幼莖頂端3-4cm插入生根培養(yǎng)基。第三步，將切去頂端的實(shí)生苗移栽到滅菌的基質(zhì)或土中，待長出新枝移至戶外。一周后移栽到田間或盆栽。第四步，將第二步得到的幼莖在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生根。采用上述方法，多年生野生大豆的成活率可以達(dá)到99％-100％，本發(fā)明可用于多年生野生大豆Glycine亞屬22個(gè)種的材料的繁殖，并可為大豆屬其它種、屬內(nèi)或與其它屬間雜種的無菌播種和繁殖提供方法。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101263786SQ200810037098
公開日2008年9月17日 申請日期2008年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月8日
發(fā)明者曹越平 申請人:上海交通大學(xué)