專利名稱：：紅樹植物根際促生固氮菌(dzy-x1)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請(qǐng)專利屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種對(duì)紅樹林植物具有良好促生效果紅樹林根際固氮菌及其制備生物固氮菌肥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：紅樹林為自然分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落，覆蓋大約60-75%熱帶和亞熱帶海岸，對(duì)維護(hù)海灣河口的生態(tài)平衡起重要作用，是海洋生產(chǎn)力的重要組成部分(Holguineta1.,2001)，被認(rèn)為是具有較高生產(chǎn)力的生態(tài)系統(tǒng)。該生態(tài)系統(tǒng)具有較高的有機(jī)質(zhì)水平(全球每年凋落物為100TgC)，為毗連的沿岸水域和相關(guān)的生物群落生境提供有機(jī)物(Holguinetal.,2001;LugomelaandBergman,2002)。然而紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的無機(jī)營養(yǎng)較貧乏，尤其是無機(jī)氮水平較低(Holguinetal.,1992;Vazquezetal.，2000)，固氮生物的生物固氮被證明是紅樹林生態(tài)系統(tǒng)無機(jī)氮的主要來源(HicksandSylvester,1985;Kyamzietal2003)。生物固氮作為紅樹林生態(tài)系統(tǒng)和生源元素生物地球化學(xué)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，對(duì)紅樹林生態(tài)系統(tǒng)及生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生極大的影響。由于人類的過度開發(fā)、圍海造地和都市化等行為，使全球的紅樹林正以驚人的速度減少，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織保守的數(shù)據(jù)估算，紅樹林正以每年平均減少1-2%的速度消失，其速度甚至超過了珊瑚礁和熱帶森林的消失速度。在發(fā)展中國家中，消失的速度更快，而紅樹林的90%以上位于發(fā)展中國家。美國紅樹林行動(dòng)項(xiàng)目組負(fù)責(zé)人Aheredo(1999)認(rèn)為，熱帶亞熱帶國家曾在3/4的海岸線上分布有紅樹林，現(xiàn)在僅剩下不到一半，而且大部分紅樹林為嚴(yán)重退化的生態(tài)系統(tǒng)?？茖W(xué)家預(yù)言，如果任其發(fā)展，在未來的近100年內(nèi)，人類將徹底失去紅樹林(Duke，2007)。近年來，紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的維護(hù)和紅樹林植株的保育等研究成為熱門研究領(lǐng)域，也有多個(gè)國際組織和團(tuán)體發(fā)起的旨在保護(hù)紅樹林的國際會(huì)議?！吨袊?1世紀(jì)議程》(1994)優(yōu)先項(xiàng)目計(jì)劃中把紅樹林恢復(fù)與重建技術(shù)納入了議事日程。ITTO組織，2002-2006年的計(jì)劃目標(biāo)亦把紅樹林生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)列為首要資助目標(biāo)之一(廖寶文，2005)?？梢娂t樹林濕地生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)工作亟需我們大力開展，但無論理論的研究還是實(shí)際恢復(fù)工作的開展都面臨較大困難。紅樹林的恢復(fù)建設(shè)工作一直比較緩慢，這主要是由于紅樹林造林成活率極低(廖寶文，1999)。墨西哥和印度等國家的科學(xué)家利用植物生長促生菌(PGPB，plantgrowth-promotingbacteria)對(duì)紅樹林進(jìn)行促生，取得了一定階段性進(jìn)展，但發(fā)現(xiàn)的適合紅樹林促生的菌種仍為少數(shù)，此類菌種依舊缺少且多數(shù)被保密收藏。目前中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所正與墨西哥西北生物研究中心合作，引進(jìn)相關(guān)菌種對(duì)我國主要紅樹植物進(jìn)行接種測試和相關(guān)菌劑研究，以期解決我國灘涂地段紅樹林造林成活率極低的棘手問題。然而，引進(jìn)菌種在我們國家紅樹林中的成活率小，并且也存在外種入侵所會(huì)產(chǎn)生的各種隱患。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一株從中國熱帶紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中篩選出的，具有較高的生物固氮活性的紅樹植物根際促生固氮菌新種。本發(fā)明的另一目的是提出所述的紅樹植物根際促生固氮菌在制備生物固氮菌肥的應(yīng)用。本發(fā)明所提出的紅樹植物根際促生固氮菌，是從海南省三亞市的熱帶紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中篩選出來的固氮菌新種。其分類命名為弧菌屬附n'osp.2006-DZY-Xl。該菌于2007年7月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，地址中國武漢市武漢大學(xué))，保藏編號(hào)CCTCCNO:M207118。本發(fā)明所述菌種的菌學(xué)特性描述如下菌種描述革蘭氏陰性，直短桿狀，不產(chǎn)生孢子，0.5X1.2-1.8Hm,單個(gè)生。氧化酶陽性，接觸酶陽性，好氧或者兼性厭氧，0F發(fā)酵。是呼吸型，又是發(fā)酵代謝型。不產(chǎn)氣。以單極生鞭毛欲動(dòng)，鞭毛有一中心，并帶有外鞘。在不良條件下形成原生質(zhì)球體。在Ashby、TCBS以及BUG培養(yǎng)基上生長良好。在Ashby培養(yǎng)基上經(jīng)過5d左右培養(yǎng)可以長為直徑3-4cm左右，黃褐色、圓形、邊緣整齊表面光滑的扁平菌落(如圖1)。生長良好且迅速。2%-3%鹽度為宜。V.P.陰性。對(duì)抗生素多數(shù)敏感，抗藥性較小。目前已有報(bào)道弧菌屬細(xì)菌固氮，如Kc/azo的p//czw和K"ara/ege"s。乙炔還原法(ARA)表明該菌可以利用N2作為氮源，且具有較高的生物固氮活性，純培養(yǎng)條件下，其固氮活性30-78umolC2H2h—'mgi鮮重。運(yùn)用特定的引物，對(duì)其純培養(yǎng)物提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過固氮基因"/ZF的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增到較理想的目的條帶，證明該菌株具有生物固氮基因(圖2)。從菌株附Wosp.2006-DZY-X1的純培養(yǎng)物提取基因組DNA，運(yùn)用固氮基因特定的引物PolF/PolR和細(xì)菌16SrDNA全序列通用引物16SF/16SR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增到理想的目的條帶，通過基因克隆和測序分析得到固氮基因序列和16SrDNA序歹U,通過GenBank中的BLAST軟件將m:/7/序列和16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)，在數(shù)據(jù)庫中沒有找到完全相似的序列，表明這2條基因序列為首次發(fā)現(xiàn)的新基因序列。向基因庫成功遞交新基因序列得到登錄號(hào)為EF422075和EF199929。在GenBank數(shù)據(jù)庫中選取了部分與測定序列相似性較高的代表性基因序列，通過ClustalW軟件和Mega軟件以Neibor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖3，4),進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)可以看出菌株W6n'osp.2006-DZY-X1的16SrDNA序列具有較近親緣關(guān)系的序列均來自弧菌屬()^ho)，并且與已知菌種KAazo的/^/cws禾BKto/"折cm的16SrDNA序列具有98%的相似性，與該屬中為定種的W6Wosp.QY102和P76n'osp.K22-41具有98%的同源性。另外與該屬中己定種的K/z/s/7aw'cus，Kwetec/zw汰ov/z'禾口K_/7uv/<3//s具有95-97°/。的同源性。菌株附n'osp.2006-DZY-X1的固氮基因("i/H)序列與已知菌種M6n'oAaz0的;7Wc附的固氮酶基因親緣關(guān)系最近(圖4)，序列同源性為97%。生理生化結(jié)果表明，該菌和與它親緣關(guān)系最相近的兩株已知菌株明顯不同(表l),證明為一株新種。表1剛n'o.tfezofro;^c附和DZY-X1兩種細(xì)菌指標(biāo)比較(+:表示陽性反應(yīng)；-表示陰性反應(yīng))TestPf必azoirqp/h'cws附rz.osp._2006-DZY-X1在培養(yǎng)基上有側(cè)毛+—游動(dòng)+直桿狀+氧化酶++還原硝酸鹽+熒光色素++葡萄糖產(chǎn)氣V.P.生長需要Na十+淀粉酶++明膠口引哚++蔗糖++甘露醇++阿拉伯糖++精氨酸++鼠李糖D-丙氨酸L-丙氨酸十D-阿拉伯糖十L-天冬酰胺(+)—纖維二糖++D-半乳糖++D-半乳糖醛酸+a-酮戊二酸+a-D-乳糖++L-亮氨酸D-甘露糖醇++L-脯氨酸+丙酸dL-絲氨酸dL-山梨醇D隱蔗糖++D-海藻糖++注K^"zofro;WcM數(shù)據(jù)參考東秀珠《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》。用含有ra>n'0sp.2006-DZY-Xl的菌液處理兩種紅樹植物，木欖dt/gw'eragymoA/za)和紅海欖(朋—tora砂/osa)，結(jié)果如表2所示。_表2P6rZosp.2006-DZY-X1對(duì)木欖和紅海欖胚處理45天后的影響_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注表中值均為IO組平行樣平均值。生物量中重量指濕重；剩下重量均指干重。從表2中我們可以看出該菌對(duì)于木欖和紅海欖有著良好的促生作用。和對(duì)照組相比，葉面積明顯高于對(duì)照組。葉面積平均值分別高于木欖和紅海欖280.9%和74.9%。根生物量也有一定提高，其中紅海欖提高比較明顯，為56%，木欖效果不很顯著，提高了11.1%。處理后光合素色含量也都有比較明顯的提高，紅海欖葉綠素b含量提高了148.3%，類胡蘿卜素含量提高了235.2%。木欖提高不明顯，葉綠素b含量處理后提高20。/。，類胡蘿卜素含量提高35%。這些結(jié)果表明，用含有該菌的菌劑接種海欖、紅海欖和木欖等紅樹植物可以明顯促進(jìn)植株生長，因此，該菌可以作為制備促進(jìn)紅樹林植物生長的生物固氮菌肥的應(yīng)用。本發(fā)明將在以下方面產(chǎn)生有益效果該菌對(duì)于紅樹林植物的促生效果較好，可用于自然紅樹林生態(tài)系統(tǒng)菌肥的生產(chǎn)工程菌，提高紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力，有望用于紅樹林恢復(fù)、造林的艱巨任務(wù)中。圖1是f^Wosp.2006-DZY-X1菌落在TCBS上生長情況照片；圖2是附A7'osp.2006-DZY-X1菌落在BUG上生長情況照片；圖3是ra>r!'0sp.2006-DZY-X1菌株的透射電鏡照片；圖4是菌株附Wosp.2006-DZY-Xl的電泳圖(1:DNA，2:16SrDNA，3:固氮基因",)H，Ml:入DNA/EcoRI十HindIII，M2:DL2000);圖5是W6/v'osp.2006-DZY-X1在16SrDNA無根系統(tǒng)發(fā)育樹中位置圖6是ra)〃》sp.2006-DZY-X1在以固氮基因"i//建立的無根發(fā)育樹中的位置圖。具體實(shí)施例方式一、材料與方法1、材料l.l土樣采集樣品采自海南省三亞市紅沙河沿岸紅樹林區(qū)木欖(5n/gw'eragyw"orWza)根際沉積物，樣品采集后裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室低溫保存。1.2培養(yǎng)基Ashby液體培養(yǎng)基甘露醇lO.Og,KH2P04'11200.2g，MgS04'7H200,2g，NaCl0,2g，CaS04O.lg'CaCO35.0g，去離子水lOOOmL,pH7.0。Ashby固體培養(yǎng)基Ashby液體培養(yǎng)基+2.2%瓊脂。改良DObereiner無氮液體培養(yǎng)基蔗糖10g，蘋果酸5.0g，K2HP04H20O.lg，KH2P04H200.4g,MgS04'7H2O0.2g，NaC10.1g，Na2M0O40.002g，F(xiàn)eCl30.01g，去離子水lOOOml，pH7.0。LB培養(yǎng)基酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCUOg，瓊脂1-2%，去離子水lOOOml，pH7.0。2、方法2.1菌種分離2.1菌種分離將樣品混勻后取約lg于200mlAshby、DObereiner或者Ashby+DObereiner無氮液體培養(yǎng)基(Ashby培養(yǎng)基與DObereiner培養(yǎng)基以1:1比例混合)中，3(TC恒溫48h進(jìn)行加富培養(yǎng)。然后將菌液分別稀釋至l(T4、l(T5、10-6三個(gè)稀釋度,各稀釋度的菌懸液以涂布法接種于Ashby固體培養(yǎng)基上，30°C48h培養(yǎng)后選擇典型的單一菌落進(jìn)一步純化。2.2菌種純化將分離出的菌落，用接種針挑取典型的單一菌落，經(jīng)涂片染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，如所分離的菌落不純，應(yīng)做系列稀釋后再次用平板涂布法分離，直至獲得純種。將純化后的菌株接種于無氮Ashby固體培養(yǎng)基和LB全培養(yǎng)基甘油保存。2.3液體培養(yǎng)中固氮酶活力測定采用乙炔還原法測定固氮活性(參考Capone1993)，將斜面保存的純菌株接種于10ml液體改良DObereiner培養(yǎng)基內(nèi)，于3(TC搖床振蕩培養(yǎng)72h，分別取1ml于滅菌的5ml小瓶中，蓋上橡皮塞。用注射器從容器中抽走5%空氣，然后加入相同體積的乙炔氣體。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，1個(gè)空白對(duì)照，對(duì)照容器中不加入乙炔氣體。所有樣品于30'C孵育12h，用SQ-204氣相色譜檢測乙烯的生成量。乙炔還原法(ARA)表明該菌可以利用N2作為氮源，且具有較高的生物固氮活性，純培養(yǎng)條件下平均固氮活性為30-78umolC2H2tf1mg'鮮重。2.4DNA的提取與純化方法參考東秀珠《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》P409。2.5"iy^基因的擴(kuò)增采用固氮細(xì)菌的"i/W基因通用引物PolF/PolR(參考Polyetal.，2001)進(jìn)行PCR擴(kuò)增PolF:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)后建立了適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>取2^1PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5。/。的瓊脂糖凝膠電泳檢領(lǐng)lj，剩余的PCR產(chǎn)物直接交與Trwitrogen生物技術(shù)有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系統(tǒng)測序。得到332bp的my7f序列。將序列直接遞交Genbank數(shù)據(jù)庫，序列號(hào)為EU707338。2.616SrDNA全序列的擴(kuò)增DNA提取與純化見方法見東秀珠《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》P4。9。采用細(xì)菌16SrDNA全序列通用引物16SF/16SR(Weisenburgetal.，1998)，16SF:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16SR:5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3',進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)后建立了適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下PCR反應(yīng)體系包括PCR反應(yīng)程序是<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>取2^1PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余的PCR產(chǎn)物直接交與Invitrogen生物技術(shù)有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系統(tǒng)測序。得到的16SrDNA序列，將序列直接遞交Genbank數(shù)據(jù)庫，序列號(hào)為EU707337。利用DNAMAN軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行同源性比較，利用BLAST軟件將測定得到的基因序列與GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)分析，獲取相近典型菌株的16SrDNA基因序列，然后利用BIOEDIT中的ClustalW對(duì)序列進(jìn)行排列，利用Mega中的鄰接法(Neighbor-Joining)建立16SrDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，其中的遺傳距離用Tamura-Nei公式計(jì)算，枝長代表了分歧程度，各枝上的數(shù)字是1000次bootstrap重抽樣分析的支持百分比。2.7菌株制劑在土壤中的有效性試驗(yàn)將該菌附〃'osp.2006-DZY-Xl接種到無氮Ashby液體培養(yǎng)基中，直至濃度為108cell/ml，待用。采用2種紅樹植物一木欖和紅海欖進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)。每種紅樹10個(gè)平行樣。外加對(duì)照。塑料盆放在露天條件下，用已準(zhǔn)備好的菌液浸泡紅樹根部3-4h后栽種入塑料盆。45天后測量各個(gè)指標(biāo)。對(duì)比實(shí)驗(yàn)指標(biāo)為植物根、葉面積、植株重量、光合色素等。結(jié)果如表2所示。權(quán)利要求1、一種紅樹植物根際促生固氮菌，該菌是從熱帶紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中篩選出來的弧菌屬Vibriosp.2006-DZY-X1，含有16SrDNA序列和固氮基因nifH，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNOM207118。2、權(quán)利要求1所述的紅樹植物根際促生固氮菌在制備促進(jìn)紅樹林植物生長的生物固氮菌肥的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種紅樹植物根際促生固氮菌(DZY-X1)及其應(yīng)用，該菌是從熱帶紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中篩選出來的弧菌屬Vibriosp.2006-DZY-X1，含有16SrDNA序列和固氮基因nifH，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCCNOM207118。該菌種具有較高的生物固氮活性，用含有該菌的菌劑接種紅海欖和木欖等紅樹植物可以明顯促進(jìn)植株生長，因此可以作為制備促進(jìn)紅樹林植物生長的生物固氮菌肥的應(yīng)用。文檔編號(hào)C05F11/08GK101298601SQ20081002897公開日2008年11月5日申請(qǐng)日期2008年6月23日優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日發(fā)明者孫翠慈,偲張,張燕英,斌楊,楊志浩,王友紹,董俊德申請(qǐng)人:中國科學(xué)院南海海洋研究所