專利名稱：：一種蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗蝗蟲的蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因，該基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)對(duì)直翅目的東亞飛蝗等有活性毒性，基于該基因構(gòu)建的工程菌制備的殺蝗劑可用于直翅目害蟲如蝗蟲等的防治，該基因在抗蟲轉(zhuǎn)基因植物中的用途。
背景技術(shù)：
：蝗蟲(Locust)是世界性的重大農(nóng)業(yè)害蟲?；葹?zāi)與水災(zāi)、旱災(zāi)常相間或伴隨發(fā)生而成為人類歷史上三大自然災(zāi)害。自80年代起，全球的蝗蟲災(zāi)害進(jìn)入頻發(fā)階段，除南極外，各大洲均有蝗災(zāi)發(fā)生，常年發(fā)生面積達(dá)4680萬平方公里，有八分之一的人口常年受到蝗災(zāi)的襲擾。我國的蝗災(zāi)也隨之加重，從1997年起，我國連續(xù)幾年大面積爆發(fā)蝗災(zāi)，最高蟲口密度可達(dá)到3000-10000頭/m2。蝗蟲中的東亞飛蝗(Zoc""yw>ratoria/H3/Lz7e/757'50主要分布在東亞、東南亞地區(qū)，如中、日、菲、泰、越等國，在我國分布范圍最廣、成災(zāi)最頻繁、最嚴(yán)重?；葹?zāi)的頻發(fā)，不僅給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大損失，而且為了治理蝗災(zāi)，要花費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力。目前，對(duì)于蝗蟲的防治，仍然主要是采用飛機(jī)大面積噴灑化學(xué)農(nóng)藥或人工使用噴霧器噴灑化學(xué)農(nóng)藥，但是，這種大面積使用化學(xué)農(nóng)藥的防治方式在迅速有效地遏制蝗害的同時(shí)，也殺死了大量蝗蟲的天敵，破壞了生態(tài)平衡，還使蝗蟲產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致蝗災(zāi)的惡性循環(huán)，而且也嚴(yán)重污染了生態(tài)環(huán)境，給人類健康造成威脅。因此在化學(xué)防治的同時(shí)，加大生物方法治蝗力度，建立與生態(tài)友好、資源可持續(xù)利用的蝗蟲治理體系和技術(shù)規(guī)范，已成為我國蝗蟲防治工作的當(dāng)務(wù)之急。近50年來，采用微生物防治蝗蟲發(fā)展較快。早在20世紀(jì)60年代末，美國開始研究和應(yīng)用微生物一--蝗蟲微孢子蟲防治蝗蟲，到20世紀(jì)80年代初期，該項(xiàng)生物防治技術(shù)被列入美國防治蝗蟲的計(jì)劃，蝗蟲微孢子蟲是世界上第一個(gè)注冊(cè)的防治蝗蟲的生物制劑，也是世界廣泛應(yīng)用的治蝗生物制劑。美國注冊(cè)了白僵菌用于防治蝗蟲的制劑，英國和澳大利亞分別注冊(cè)綠僵菌制劑，并在很多國家進(jìn)行田間試驗(yàn)。除此之外，印度、美國成功地開發(fā)出了植物源殺蟲劑-印楝素。我國是較早開展生物治蝗的國家，在明清時(shí)期就有采用養(yǎng)雞、養(yǎng)鴨防治蝗蟲的實(shí)例，而且至今仍在一些地方應(yīng)用。有關(guān)蝗蟲天敵的記錄，可以追溯到東晉時(shí)期，距今有1700多年。然而，直到20世紀(jì)80年中期，我國才真正開展蝗蟲生物防治的研究和應(yīng)用。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)首先從美國引入了蝗蟲微孢子蟲，經(jīng)過近10年的努力，在深入研究了微孢子蟲致病機(jī)理、疾病傳播途徑和流行規(guī)律的基礎(chǔ)上，成功地研制出了人工大量繁殖蝗蟲微孢子蟲的技術(shù)、防治草原蝗蟲和東亞飛蝗的田間應(yīng)用技術(shù)及其配套技術(shù)體系，累計(jì)示范應(yīng)用IOOO多萬畝次，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益，該項(xiàng)技術(shù)在國際上處于領(lǐng)先水平。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、重慶大學(xué)等單位開發(fā)研究了綠僵菌(ifeterr力iii'柳朋i's叩h'ae)制劑，經(jīng)過多年室內(nèi)實(shí)驗(yàn)后，近年來也較為廣泛地開展了田間試驗(yàn)示范。這些微生物制劑，均可以采用噴霧或噴粉的方法施用。同時(shí)，國內(nèi)也有幾個(gè)廠家在生產(chǎn)印楝素、苦參堿等生物制劑。蘇云金芽孢桿菌(Saw7J"st/"rj'/^ie"w's，簡稱Bt)由于具有殺蟲效果好，特異性強(qiáng)，生產(chǎn)和使用方便，不污染環(huán)境等特點(diǎn)而在害蟲生物防治中發(fā)揮了重要作用。不同的Bt菌株產(chǎn)生不同的殺蟲晶體蛋白質(zhì)(InsecticidalCrystalProteins,簡稱ICPs)，使得菌株間的殺蟲譜和殺蟲活性存在明顯差異?，F(xiàn)已報(bào)道，蘇云金芽孢桿菌對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等9個(gè)目的昆蟲和螨類、植物線蟲、原生動(dòng)物、扁形動(dòng)物等有特異性殺蟲活性。目前，篩選高效特異性Bt菌株，發(fā)掘新的ICP基因，對(duì)菌株進(jìn)行遺傳改良或構(gòu)建高效廣譜基因工程菌是世界性的課題，也是Bt研究的發(fā)展趨勢(shì)，據(jù)報(bào)道，全世界已分離出了71個(gè)H血清型84個(gè)亞種的數(shù)萬株蘇云金芽孢桿菌，從分離的菌株中篩選出了多株對(duì)鱗翅目和鞘翅目等害蟲有毒效的菌株。在殺蟲基因克隆和分類方面，自Schnepf等在1981年將蘇云金桿菌庫爾斯達(dá)克變種HD-1菌株的殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因分離、克隆，并在1985年完成其核苷酸序列分析以來，已有380多個(gè)殺蟲晶體蛋白基因被分離、克隆(http:〃www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Nei1—Crickmore/Bt)。Hofte禾卩Whiteley(1989)將殺蟲蛋白質(zhì)命名為Cry，其編碼基因?yàn)閏r》在活體外具溶昆蟲細(xì)胞和脊椎動(dòng)物紅血球細(xì)胞的蛋白質(zhì)及其基因分別為Cyt和并根據(jù)殺蟲譜將42種晶體蛋白質(zhì)歸為5類14個(gè)亞類。I類為特異抗鱗翅目昆蟲；II類為特異抗雙翅目和鱗翅目昆蟲；m類為特異地抗鞘翅目昆蟲；IV類為特異抗雙翅目昆蟲；V類為無毒性的結(jié)晶蛋白。隨著新的基因不斷被克隆和發(fā)現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)有些殺蟲蛋白質(zhì)序列相似，但其殺蟲活性卻不同，而有些基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)具有相同的殺蟲活性，相似性卻又相差很大，所以以序列相似性和生物活性劃分類別的分類系統(tǒng)很難高度統(tǒng)一。1995年0^10110^等將已發(fā)現(xiàn)的殺蟲基因按其5-內(nèi)毒素氨基酸序列的相似性確定其不同的分類等級(jí)，而與基因的生物活性無關(guān)，這個(gè)系統(tǒng)用計(jì)算機(jī)比較晶體蛋白氨基酸序列的相似性，以45%、78%和95%為界，將基因分為4個(gè)分類等級(jí)，同時(shí)還對(duì)新基因的命名提出了要求(l)具有殺蟲活性的殺蟲晶體蛋白可以來自蘇云金芽孢桿菌，也可是與已知的蛋白有明顯相似序列的任何蛋白質(zhì)；(2)表達(dá)的毒素蛋白必須在伴胞晶體內(nèi)；(3)基因的核苷酸序列必須在主要的國際數(shù)據(jù)庫中登記。由于近年來分子生物學(xué)及核酸測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Cryl-Cry51及Cytl-Cyt2共53個(gè)大類群殺蟲晶體蛋白基因'然而，這些基因所編碼的殺蟲晶體蛋白質(zhì)大多數(shù)是殺鱗翅目或鞘翅目等害蟲，到目前為止，國際上還沒有有關(guān)殺蝗蟲的蘇云金芽孢桿菌(Bt)殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因及其編碼的殺蟲晶體蛋白質(zhì)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供了一種蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因，該基因來源于殺蝗蟲的蘇云金芽孢桿菌菌株((保藏號(hào)CCTCCM206061))。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白質(zhì)，該殺蟲蛋白質(zhì)對(duì)直翅目的蝗蟲等有特異性的毒殺作用，但對(duì)人、畜和環(huán)境安全。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供了一種蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因在制備防治或預(yù)防蝗蟲制劑中的應(yīng)用，用該基因制備的殺蝗劑可用于危害未本科農(nóng)作物如水稻、小麥、玉米、高粱和牧草等的蝗蟲的防治，其特點(diǎn)是特異性強(qiáng),不殺傷昆蟲天敵，對(duì)人、畜無毒，對(duì)環(huán)境安全。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施(1)抗蝗蟲蘇云金芽孢桿菌菌株BTH-13的制備方法及其主要特性利用芽孢可耐8(TC高溫的特性，在8(TC高溫下通過彈土法分離蘇云金芽孢桿菌。以東亞飛蝗為試蟲，進(jìn)行毒力生物測(cè)定，經(jīng)過比較毒力致死中量Lc5。,篩選到該高毒力菌株^sc^^"s^"/^'y^7'e/w^ssp.BTH-13(菌種保藏號(hào)CCTCCM206061)。該菌株的細(xì)胞形態(tài)為桿狀，產(chǎn)生橢圓形芽孢和菱形伴孢晶體蛋白質(zhì)，伴孢晶體蛋白質(zhì)由128kD的殺蟲晶體蛋白質(zhì)組成。經(jīng)毒力生物測(cè)定，菌株BTH-13對(duì)東亞飛蝗等直翅目害蟲有較高殺蟲活性，其發(fā)酵液和晶體蛋白質(zhì)經(jīng)過堿和蛋白酶處理后，可明顯提高抗蝗蟲的活性。(2)抗蝗蟲蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因的克隆與應(yīng)用根據(jù)蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質(zhì)的氨基酸序列的五個(gè)保守序列，設(shè)計(jì)四條簡并引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)從殺蝗蟲的蘇云金芽孢桿菌菌株BTH-13的總DNA中擴(kuò)增一個(gè)基因片段并測(cè)序。在該基因片段的兩端設(shè)計(jì)兩條反方向的特異性引物，用BDGenomeWalkerUniversalKit進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得約900bp和3000bp的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與載體pGEM-TEasy(購自Promega公司)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1(本領(lǐng)域的技術(shù)人員均知該大腸桿菌TG1的來源)，挑選陽性克隆子提取質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序。用NCBIBlast分析獲得的DNA序列，確定殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因的大小、開放讀碼框，啟動(dòng)子。再根據(jù)所獲得的全基因(包括啟動(dòng)子)序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物引入Sal聰切位點(diǎn)，下游引物引入BamHI酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與經(jīng)過SalI/BamHI處理的載體pHT304[pHT304是蘇云金芽孢桿菌基因克隆中常用的一個(gè)既可在大腸桿菌中復(fù)制、又可在蘇云金芽孢桿菌中復(fù)制的載體，該載體在90年代即已成功構(gòu)建，文獻(xiàn)"Constructionofcloningvectorsfor泡cj77u51t/〃ri"《ie"57.51，，(Gene,108:115-119，1991)中，詳細(xì)描述了蘇云金芽孢桿菌常用載體的構(gòu)建，其中在第116頁，第117頁和第118頁都描寫了pHT304的構(gòu)建方法及其該載體的特點(diǎn)。在文獻(xiàn)"蘇云金芽孢桿菌菌株YBT—1535轉(zhuǎn)crylC基因的構(gòu)建"(生物工程學(xué)報(bào)，16(5):587—590,2000)中也有記載。該pHT304載體由法國巴斯德研究所提供，巴斯德研究所是全球最大的菌種鑒定與保藏中心，可以向全世界研究人員提供各種用途的菌種和載體，其中pHT304載體在法國巴斯德研究所有保藏；中國科學(xué)院武漢病毒研究所等、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院等許多實(shí)驗(yàn)室均保存有該載體)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1和蘇云金芽孢桿菌無質(zhì)粒突變株BMB171，獲得含有全長基因的大腸桿菌克隆子(TGl/7Cal)和蘇云金芽孢桿菌工程菌(BMB171/7Cal)。文獻(xiàn)"蘇云金芽孢桿菌無質(zhì)粒突變株BMB171的轉(zhuǎn)化和表達(dá)性能"，應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)1999,5(4):395399，中有關(guān)于該突變株的報(bào)道。(3)基因及其編碼的殺蟲蛋白質(zhì)的特征BTH-13的殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因(c/y^a7)全長為3729bp(包括啟動(dòng)子和終止密碼子)，開發(fā)讀碼框?yàn)?432bp,其序列為SEQIDNO.1所示的DNA序列；該基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)為Cry7Ca，殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)為1144，其序列為SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。毒素區(qū)域基因片段為1761bp,編碼587氨基酸。蘇云金芽孢桿菌BTH-13具有殺東亞飛蝗等直翅目害蟲的特點(diǎn)，國內(nèi)目前尚無殺東亞飛蝗等直翅目害蟲的蘇云金芽孢桿菌商品制劑，BTH-13的殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因可用于Bt菌株的遺傳改良和構(gòu)建高效抗蝗蟲的Bt工程菌，并可用于轉(zhuǎn)基因植物的研究以獲得抗蝗蟲的牧草和農(nóng)作物。因而，從優(yōu)越而獨(dú)特的殺蟲特性、生產(chǎn)和使用成本低、工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)成熟、對(duì)人和動(dòng)植物安全、不污染環(huán)境及市場(chǎng)需求等方面考慮，蘇云金芽孢桿菌BTH-13的殺蟲基因及其編碼的殺蟲蛋白質(zhì)具有巨大潛在的應(yīng)用價(jià)值。該基因編碼的殺蟲晶體蛋白質(zhì)Cry7Ca對(duì)東亞飛蝗的毒力如下表1及圖1,其中2.0mg/ml的晶體蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶處理后產(chǎn)生的毒性肽在72小時(shí)內(nèi)對(duì)東亞飛蝗的毒力可達(dá)到98.7%。表1Bt菌株BTH-13殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因編碼的蛋白質(zhì)對(duì)東亞飛蝗的毒力處理<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>圖1為Bt菌株BTH-13殺蟲晶體蛋白質(zhì)基編碼的殺蟲蛋白質(zhì)對(duì)東亞飛蝗的毒殺作用具體實(shí)施方式1.抗蝗蟲蘇云金芽孢桿菌菌株總DNA的提取經(jīng)活化的BTH-13菌株接種于平板上，30。C培養(yǎng)8h。用20mmol/lTris.cl(pH8.0)的緩沖液洗菌體，5000rpm離心5min，收集菌體。加入1倍體積的TES溶液(含15mg/ml的溶菌酶)，37'C溫育2h，加入2倍體積的溶液I1，充分混勻，輕微顛倒，加入蛋白酶K至其終濃度為70ug/ml。37'C溫育2h，直到溶液變清亮。加入1.5倍體積的溶液m，充分混勻，12000rpm離心15min，收集上情。加入等體積的酚/氯仿(1:1)，充分混勻，輕微顛倒，至少5min，以除去蛋白。常溫12000rpm離心5min，收集上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，重復(fù)上述操作。取上清，加入等體積的異丙醇沉淀DNA，4。C放置30min，12000rpm離心20min，棄上清，加入lml的70%乙醇洗滌DNA,離心收集沉淀，倒置干燥。加入適量體積的含50ug/mlRNAasA的無菌水，溶解DNA。2.Bt菌株BTH-13殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因的獲得(1)根據(jù)Hofte等(MicroRev1998,(53):242-245)所報(bào)道的Bt毒素蛋白的氨基酸序列的五個(gè)保守序列，設(shè)計(jì)四條簡并引物OL15TAHCANYATAYGCACARGCHGCMAAYTT3，OU5,AGAGAHRTGAHWDTDAHWDTDAHRGTATTRGAT3'OL45'AGCATADCGRAHNCYHRYDYVATA3，OL55，GGAATAAATTCRATTYTRTCTAATAAA3'先以BTH-13的DNA為模板，用引物0L1、0L5進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；再以第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為模板，用引物0L2、0L4進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。第二輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與載體pGEM-T-EasyVector(購于promeaga公司)連接，連接產(chǎn)物通過CaCl轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌TGI中，在含有X-gal、IPTG、Amp(100u1/ml)的LB培養(yǎng)基中篩選陽性克隆子[按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002)描述的方法進(jìn)行]。提取陽性克隆子的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序，獲得1100kb的BTH-13殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因片段序列。(2)根據(jù)所獲得的序列設(shè)計(jì)特異性引物H-13(F):5，AGTGCTACTTGGTATCAGGCGGTCCCTTTA3，，H-13(R):5，TCAGAACTGGCAGCTCCATACCAATCAGGA3，(3)按BDGenomeWalkerUniversalKitUserManual操著，獲得約900bp和3000bp的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與載體pGEM-TEasy連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，挑選陽性克隆子經(jīng)酶切、PCR檢測(cè)驗(yàn)證后提取質(zhì)粒進(jìn)行DNAWalking測(cè)序。(4)用NCBIBlast分析所獲得的DNA，確定殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因的大小、開放讀碼框，啟動(dòng)子。(5)根據(jù)所獲得的全基因(包括啟動(dòng)子)序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物引入SalI酶切位點(diǎn)，下游引物引入BamHI酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與經(jīng)過SalI/BamHI處理的載體pHT304連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI和蘇云金芽孢桿菌無晶體突變株BMB171，獲得含有全長基因?yàn)镾EQIDNO.1所示的DNA序列。3.抗蝗蟲基因工程菌殺蝗劑的制備用上述構(gòu)建的基因工程菌(BMB171/7Cal)制備殺蝗劑的方法與抗蝗蟲Bt菌株BTH-13殺蝗劑的制備方法相同，所采用的培養(yǎng)基配方為淀粉4.0%、豆餅粉2.4%、棉餅子粉1.5%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.4%、玉米漿2.0%、MgS047H200.04%、KH2P040.2%、K2HP040.2%、CaCO:,0.1%、及a-淀粉酶(淀粉含量的1/400)。其殺蝗劑的制備過程如下乳劑生產(chǎn)40噸發(fā)酵罐，裝料25噸，每罐接種兩個(gè)茄子瓶菌種，接種溫度35-37'C和發(fā)酵溫度28-31°C(在此間中的溫度均可實(shí)現(xiàn))，恒速攪拌250r/min，通氣量1:0.5-1:1.5，發(fā)酵至芽孢晶體形成并有40-50%孢晶分離時(shí)終止。消泡劑為泡敵BAPE，適量(一般為1%。)加入。發(fā)酵液經(jīng)GF-105碟片式高速離心機(jī)循環(huán)離心后，僅去除約40%的上清液。在此種低倍濃縮的發(fā)酵液中按要求加入防腐劑和乳化劑等制成懸浮劑。粉劑生產(chǎn)低倍濃縮發(fā)酵液直接或加10%輕質(zhì)碳酸鈣后，以BLSA規(guī)格的高壓氣流噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥，噴霧塔進(jìn)口溫度195-200°C，出口溫度85—90°C。制得殺蝗劑可濕性粉劑。發(fā)酵罐中的發(fā)酵情況及殺蝗劑乳劑的殺蟲效果詳見表2。表2發(fā)酵罐中的發(fā)酵情況及殺蝗劑乳劑的殺蟲效果罐次菌體發(fā)育情況放罐pH生產(chǎn)周期乳劑毒力LC5020小時(shí)38小時(shí)(小時(shí))(W/ml)1整齊同步孢晶脫落50%8.0385.32發(fā)育良好65%孢晶脫落8.0386.13發(fā)育良好60%孢晶脫落8.0385.8平均8.0385.7SEQUENCELISTING<110>中國科學(xué)院武漢病毒研究所<120>—種蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因及應(yīng)用<130>—種蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因及應(yīng)用<160〉2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>3729<212>DNA<213>Bacillusthuringiensis<400>1agcggtatcaatgtgtatatgac犯atactcctacagggacaggtscatgattggcattc60tttacgctggtagtatttaaaacatgg朋atcgttgctccc犯tatccca120tgttattatta犯cgtttaaaatcgtattctaatattcaatgatattgtctgataaattg180aattttggtgacttacaaatattaatccttaaaaataacactgcatttca240cagtaatgcgagaaaatttactttccaaatattcaacaggagg犯tgtait300aaaca^aatgattegtgg犯tacattgaacgaagatttttct犯t3gtett360ctttggtaactgatcaaactaagattttttg犯tstg犯t420g鄉(xiāng)卿ttgcaccgtatgcgatgtaatttttagctcaat犯gtatcatt480cgtaccttcatgggttttgceigga^tggg3CtgCtgg3ggtattattggattatttacg540gaagtattaaga/ttactatggcctaat犯gcaaaatgatctttggg犯tcgtttatgaat600g犯gtagaggcacttattaaac8g犯gcggtagt肌gt3aagctttatca660g滅t卿gggtttaaggaacgctttggagggatatac犯gtgcactgga3gca1:ggca^720aataatcgtagtgata犯cttaagcagttactagtgtatgttctacagaa780aatttatttaaatttgcaatgccttctttt卿tcggtaggttttg犯ggtccattatta840acagtatatgcscaagccgcaaaccttcacttatttttattgaattattt900ggggc聊attacgtagaaga^g犯tgcaaatgacga/ttacctatggaaaggaatt犯tgatag肌aatccgtgct鄉(xiāng)gactcaatgtaactttaagtcgca.gcaaMaaaltccagta犯atgtaaa^tatggagattactgg眺tgaaattatatcgctggtgtegaatetatcttcgcgcatgscgctaactatgg犯ggcg犯tagag肌ttacaacagcgggac3tttt3gtgggattctatca站tgggg8tttalccaacctgggg威gC3aatatacagagtggagt犯atggtgttagacagt犯c兆agggcg咖cctagttgaaccctaaatctacatacttttgaatgtcctatcgcacatettctagagg犯taaaattatagactagc犯tcagggttcgttaaatattttacgt犯tgattacttcaaattggaaacgcactattgtgtatcatgcaaaacgttgtattcaaatctctatcatcattgtgtttctccttccagttg3C犯g3tcctgattggaa犯cctggtcaatgataggt3ctgag犯ttctactttctttggtatcagtg郷atgcgtagtgatcaatggtcaccggctccgcatccagtttttagatgcagc犯cttgca_acga_tgtgctgg犯cttactatctattcaattag犯兆g卿gtt3tttgagctatgg卿atggcatagacttgtaaatggtatatggg柳actttatttccaacaaattttcatatggagctgctattccaatttcgc犯tttgcggtcccttttctctttttttaccgatagtt肌gtt3tgtggacscELl:gcctgctgttaact卿鵬c3tgCgttt3tgg卿tgg3gaa兆肌ggaggc鄉(xiāng)柳gcaaagcacagELgtgacagattt3tCC犯3tgtcccgtaatttgg犯cgg犯ttaattttctg8gtCC犯3Ctttacaatga卿卿ggttataatcgttttctatgatgccagatccaatccagttctgaggtta^ct犯atggaacttcatc3gacttatattgagattcaaataatat犯ttgttggatttcag肌a/ttaagtgtaagca/ttttcagataatgagctt犯gcgttaaatttctatgctttgaattcat犯gccgtg^tt犯agtggagteatggtatcaggtaccaatcgcagag犯acgcacata/taggtcttacgattcgtattaaataaacgttcagtgtaigttttctggctctttc犯tagct&tatgg3a_ttaccatctagtcgaacctatttttta犯gaggcccgataettt3gtgg33ttatatagctatctatataatttccagtaga/ttaccttgttttcaagtg"tcaactactaagttgcaattggctacacgctat9601020108011401200126013201380144015001560162016801740180018601920198020402100216022202280234024002460252025802640aaactgagaggttttatcgagagtagtcaggatttagaagcatatgtgattcgttatgat2700gcaaaacatgaaacattggatgtatccaataatctattaccggatattcctcctgtgaat2760gcctgcggagaacccaatcgctgtgcggcattacaatacctggatgaaaatccaaaatta2820gaatgtagttcgatacaagatggtattttatctgattcacattcattttctctccata/ta2880gatacaggttcaattgatttcaatgagaacgtaggaatttgggtgttgtttaaaatttcc2940acaccagaaggatacgcgaaatttggaaatctagaagtgattgaagatggcccagtcatt3000ggagaagcattsgcccgtgtg犯acgccaaga犯cg犯gtggag犯3c犯gttg3C3C333060ctgcgaacggaaacacaagcaatttatacacgagcaaaacaagcactggataatcttttt3120acagatgcacaagactctcacttaaaaataggtgcaacatttgcggcaattgtggctgcg3180cgaaagattgtccaatcaatacgtgaagcgtatatgtcatggttatctgacgtcccaggc3240ttaaattatcctatttttacagagttgaatgacagagtacagcgcgcatttcaattatat3300g3tgtacaaaatgtcgtgcgt犯tggccgattcctcaatggagtattggactggattgtg3360acatctgatgta犯ggtacaagaagga犯tggg犯taacgtactagttctttccggatgg3420gatgcgcaagtattacaatgtctgaatctctatcaaaaccgcgggtacatcttgcgtgta3480acggcax;gtaaggaaggactgggagaaggatatot肌caattacggatgaagMgga肌t3540acagatcaattaacatttggttcatgtgaaaatatagattcatccaattctttcgtatct3600acaggatatettac肌aagaactagagttcttcccagatacagaccaaatacagattgaa3660attgg卿肌c卿aggaac3ttccaggtgga卿tgtagaattattcttgatggaa組3720ctatgttaa3729<210>2<211〉1144<212>PRT<213>Bacillusthuringiensis<400>2MetAspLysGinAsnAspSerGlylielieLysAlaThrLeuAsnGlu151015AspPheSerAsnSerlieGinArgTyrProLeuValThrAspGinThr202530lieAsnTyrLysAspPheLeuAsnMetAsnGluGlulieAlaProTyr354045AlaSerSerLysAspValliePheSerSerlieSerlielieArgThr505560PheMetGlyPheAlaGlyHisGlyThrAlaGlyGlylieHeGlyLeu65707580PheThrGuVaLeuArgLeuLeuTrpProAsnLysGinAsnAspLeu85卯95TrpGluSerPheMetAsnGluValGluAlaLeuHeAsnGinGlulie100105110ThrGluAlaValValSerLysAlaLeuSerGluLeuGluGlyLeuArg115120125AsnAlaLeuGluGlyTyrThrSerAlaLeuGluAlaTrpGinAsnAsn130135140ArgSerAspLysLeuLysGinLeuLeuValTyrGluArgPheValSer145150155160ThrGluAsnLeuPheLysPheAlaMetProSerPheArgSerValGly165170175PheGluGlyProLeuLeuThrValTyrAlaGinAlaAlaAsnLeuHis180185190LeuPheLeuLeuLysAsnAlaGluLeuPheGlyAlaGluTrpGlyMet195200205GinGinTyrGlulieAspLeuPheTyrAsnGluGinLysGlyTyrVal210215220GluGluTyrThrAspHisCysValLysTrpTyrLysGluGlyLeuAsn225230235240LysLeuLysAsnAlaSerGlyValLysGlyLysValTrpGluAsnTyr245250255AsnArgPheArgArgGluMetThrlieMetValLeuAspLeuLeuPro260265270LeuPheProlieTyrAspAlaArgThrTyrProMetGluThrValThr275280285GluLeuThrArgGinHePheThrAspProlieGlyLeuThrGlylie290295300AsnGluThrLysTyrProAspTrpTyrGlyAlaAlaSerSerGluPhe305310315320ValLeulieGluAsnArgAlalieProLysProGlyLeuPheGinTrp325330335LeuThrLyslieAsnValArgAlaArgValValGluProAsnAspArg340345350PheAlalieTrpThrArgHisSerValValThrGinCysThrLysSer355360365ThrThrGluAsnThrPheAsnTyrGlyThrSerSerGlySerThrIxu370375380SerHisThrPheAspLeuLeuSerLysAsplieTyrGinThrTyrSer385390395400lieAlaAlaAlaAsnLysSerAlaThrTrpTyrGinAlaValProLeu405410415LeuArgLeuTyrGlylieAsnSerSerAsnValLeuSerGluAspAla420425430PheSerPheSerAsnAsnlieProSerSerLysCysLysSerThrTyr435440445SerSerAspGinLeuProlieGluLeuLeuAspGluProlieTyrGly450455460AspLeuGluGluTyrGlyHisArgLeuSerTyrValSerGluliePhe465470475480LysGluThrGlySerGlyThrHeProValLeuGlyTrpThrHisVal485490495SerValArgProAspAsnLysLeuTyrProAspLyslieThrGinlie500505510ProAlaValLysAlaPheGluThrAsnThrAlaGlyValGluHeHe515520525AspSerAlaSerThrGlyGlyProlieLeuLyslieValAsnAsnAsn530535540LeuProSerAsnGinValPheArgMetArgLeuSerPheSerGluPro545550555560GinLyslieLysValArgValArgTyrAlaAlaThrGlyAspGlyVal565570575MetSerPheSerGlyHeAlaHisAspGluTyrPheThrAlaThrMet580585590LysGluGlyGluAlaLeuLysTyrSerTyrLeuThrMetGlyAsnAsp595600605TyrAlaGlyThrAlaAlaGluLeuSerMetLeuTyrHelieLysAla610615620AsnThrSerAsnCysThrlieTyrlieAspLyslieGluPheliePro625630635640ValAspGluAsnTyrAsnAsnArgValGinLeuGluLysAlaGinLys645650655AlaValAsnThrLeuPheThrAlaGlyArgAsnAlaLeuGinLysAsp660665670ValThrAspPheLysValAspGinValSerlieLeuValAspCysVal675680685SerGlyGluLeuTyrProAsnGluLysArgGluLeuLeuSerLeuVal6卯695700LysTyrAlaLysArgLeuSerTyrSerArgAsnLeuLeuLeuAspPro705710715720ThrPheAspSerlieAsnSerSerGluGluAsnGlyTrpAsnGlySer725730735AsnGlyHeAlaHeGlySerGlyAspPheValPheLysGlyAsnTyr740745750LeuliePheSerGlyThrAsnAspGluGinTyrProThrTyrLeuTyr755760765GinLyslieAspGluSerLysLeuLysGluTyrThrArgTyrLysLeu770775780ArgGlyPhelieGluSerSerGinAspLeuGluAlaTyrVallieArg785790795800TyrAspAlaLysHisGluThrLeuAspValSerAsnAsnLeuLeuPro805810815AsplieProProValAsnAlaCysGlyGluProAsnArgCysAlaAla820825830LeuGinTyrLeuAspGluAsnProLysLeuGluCysSerSerlieGin835840845AspGlylieLeuSerAspSerHisSerPheSerLeuHislieAspThr850855860GlySerHeAspPheAsnGluAsnValGlylieTrpValLeuPheLys865870875880lieSerThrProGluGlyTyrAlaLysPheGlyAsnLeuGluVallie8858卯895GluAspGlyProVallieGlyGluAlaLeuAlaArgValLysArgGin900905910GluThrLysTrpArgAsnLysLeuThrGinLeuArgThrGluThrGin915920925AlalieTyrThrArgAlaLysGinAlaLeuAspAsnLeuPheThrAsp930935940AlaGinAspSerHisLeuLyslieGlyAlaThrPheAlaAlaHeVal945950955960AlaAlaArgLyslieValGinSerlieArgGluAlaTyrMetSerTrp965970975■LeuSerAspValProGlyLeuAsnTyrProliePheThrGluLeuAsn980985990AspArgValGinArgAlaPheGinLeuTyrAspValGinAsnValVal99510001005ArgAsnGlyArgPheLeuAsnGlyValLeuAspTrplieValThr101010151020SerAspValLysValGinGluGlyAsnGlyAsnAsnValLeuVal102510301035LeuSerGlyTrpAspAlaGinValLeuGinCysLeuAsnLeuTyr104010451050GinAsnArgGlyTyrlieLeuArgValThrAlaArgLysGluGly105510601065LeuGlyGluGlyTyrlieThrlieThrAspGluGluGlyAsnThr107010751080AspGinLeuThrPheGlySerCysGluAsnlieAspSerSerAsn108510901095SerPheValSerThrGlyTyrlieThrLysGluLeuGluPhePhe110011051110ProAspThrAspGinlieGinlieGlulieGlyGluThrGluGly111511201125ThrPheGinValGluSerValGluLeuPheLeuMetGluAsnLeu113011351140Cys權(quán)利要求1、一種分離的蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因，其序列為SEQIDNO.1所示的DNA序列。2、—種蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因所編碼的殺蟲蛋白質(zhì)，其序列為SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。3、一種蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因在制備防治或預(yù)防蝗蟲制劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因及應(yīng)用，殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因如SEQIDNO.1所示的DNA序列，其編碼的殺蟲蛋白質(zhì)如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。該基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)對(duì)直翅目的東亞飛蝗有特異性的毒殺作用，用該基因制備的殺蝗劑可用于危害禾本科作物如水稻、小麥、玉米、高粱和牧草等蝗蟲的防治，效果好，對(duì)人和動(dòng)植物安全，生產(chǎn)和使用成本低，不污染環(huán)境，具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)A01N63/00GK101126093SQ200710052688公開日2008年2月20日申請(qǐng)日期2007年7月11日優(yōu)先權(quán)日2007年7月11日發(fā)明者宋玲莉,戴順英,高梅影申請(qǐng)人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所