專利名稱：：產(chǎn)生透明質(zhì)酸的植物的制作方法產(chǎn)生透明質(zhì)酸的植物
技術(shù)領(lǐng)域：
總的來說，本發(fā)明涉及在有能力產(chǎn)生透明質(zhì)酸的植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，以及制備這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物的方法。技術(shù)背景透明質(zhì)酸是1934年Meyer和Palmer從牛眼球的玻璃體中分離到的一種糖胺聚糖(粘多糖)(Meyer,K.和Palmer,J.W.(1934)J.Biol.Chem.:107,629-634)。高分子量的透明質(zhì)酸被用于骨關(guān)節(jié)炎的治療、眼外科輔助劑、預(yù)防粘連、加速傷口愈合等。也已經(jīng)有報(bào)道表明低分子量的透明質(zhì)酸具有生理活性效應(yīng)。預(yù)計(jì)將會發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸作為生物材料或在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的新用途。到目前為止，透明質(zhì)酸是通過從哺乳動物組織或通過微生物發(fā)酵中提取來生產(chǎn)。但是，在提取哺乳動物組織中，要顧慮例如可傳染的海綿狀腦病(朊病毒)的污染或病毒向人的傳播的風(fēng)險。哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)和維護(hù)成本高昂。它們需要昂貴的生長培養(yǎng)基，并且生長緩慢。同時，微生物發(fā)酵也有問題，例如需要含糖的生長培養(yǎng)基和昂貴的設(shè)備。在大腸桿菌(Escherichiacoli)中，問題在于蛋白未被加工，可能形成內(nèi)含體，蛋白被蛋白酶降解等(Petrides，D.等，(1995)Biotecno1.Bioeng.,48，529)。當(dāng)在微生物中生產(chǎn)治療性物質(zhì)時，為了防止內(nèi)毒素污染，純化的花費(fèi)變得極其昂貴。相反，植物是使用低能量負(fù)荷生產(chǎn)碳水化合物的理想系統(tǒng)，其中碳水化合物通過光合作用從水和二氧化碳生產(chǎn)。在專利文獻(xiàn)6中公開的發(fā)明顯示，可以通過將透明質(zhì)酸合酶基因?qū)胫参锘蛑参锛?xì)胞來生產(chǎn)透明質(zhì)酸。專利文獻(xiàn)1:日本未經(jīng)審查的專利申請No.1993-125103專利文獻(xiàn)2:日本未經(jīng)審查的專利公布No.1983-056692專利文獻(xiàn)3:日本未經(jīng)審查的專利申請No.1997-319579專利文獻(xiàn)4:日本未經(jīng)審查的專利申請No.1994-319580專利文獻(xiàn)5:日本未經(jīng)審査的專利申請No.1997-056394專利文獻(xiàn)6:WO05/012529非專利文獻(xiàn)1:Meyer，K.和Palmer,J.W.，J.Biol.Chem.，107:629-634,1934非專利文獻(xiàn)2:Petrides,D.等，Biotecnol.Bioeng.,48:529,1995附圖簡述圖1顯示了AtUGD在純化之前和之后的SDS-PAGE分析。圖2顯示了cvUGD在純化之前和之后的SDS-PAGE分析。圖3顯示了使用PROTEIOS(注冊商標(biāo))表達(dá)的GFAT。圖4顯示了使用Reissig方法測量的GFAT活性。圖5顯示了其中分別導(dǎo)入了cvHAS-cvGFAT基因和cvHAS基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物的透明質(zhì)酸生產(chǎn)水平。圖6顯示了其中導(dǎo)入了多個基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物中透明質(zhì)酸的生產(chǎn)水平。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明將要解決的問題本發(fā)明的主要目的是通過改進(jìn)現(xiàn)有的在植物中生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法來提供能夠更有效生產(chǎn)透明質(zhì)酸的植物和植物細(xì)胞、其生產(chǎn)方法、及其重組表達(dá)載體。解決問題的方法作為解決上述問題的廣泛研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過用編碼具有生產(chǎn)透明質(zhì)酸的酶活性的蛋白的基因和編碼具有合成糖-核苷酸的酶活性的蛋白的基因來轉(zhuǎn)化植物和植物細(xì)胞，可以在植物中大量生產(chǎn)透明質(zhì)酸，而進(jìn)一步的廣泛研究使本發(fā)明得以實(shí)現(xiàn)。也就是說，本發(fā)明涉及下列條目。1.生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，包括在植物細(xì)胞或植物中共表達(dá)具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有糖-核苷酸合酶活性的外源蛋白。2.生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，包括下列步驟(1)使用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，該重組表達(dá)載體含有編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA，這些DNA處于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下；(2)令通過轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化體生長；以及(3)分離轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的透明質(zhì)酸。3.條目2中生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中啟動子是器官特異性或組織特異性的啟動子。4.條目2或3中生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA是下面(a)或(b)的DNA:(a)由SEQIDNO:1或3表示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的DNA，并且該DNA編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白。5.條目l到3任一項(xiàng)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白是下面(a)或(b)的蛋白(a)由SEQIDNO:2或4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白；或(b)具有(a)的氨基酸序列、但帶有一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加的蛋白，并且該蛋白具有透明質(zhì)酸合酶活性。6.條目1到5任一項(xiàng)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中糖-核苷酸是尿苷-5'-二磷酸(UDP)-N-乙酰葡萄糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸。7.條目l到6任一項(xiàng)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是從選自下列的至少一種蛋白谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙?；?、UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶。8.條目1到6任一項(xiàng)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是選自下列的至少一種蛋白UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙?；?、UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶，以及谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶。9.條目1到6任一項(xiàng)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶和/或UDP-葡萄糖脫氫酶。10.條目2到9任一項(xiàng)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是來自小球藻病毒和/或擬南芥(Arabidopsisthaliana)的DNA。11.條目2到IO任一項(xiàng)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是下列(a)或(b)的DNA:(a)由SEQIDNO:5、7或9表示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的DNA，并且所述DNA編碼具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。12.條目1到IO任一項(xiàng)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是下列(a)或(b)的蛋白(a)由SEQIDNO:6、8或10表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白；或(b)由帶有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白，并且該蛋白具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性。13.條目2到IO任一項(xiàng)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是下列(a)或(b)的DNA:(a)由SEQIDNO:11、13、17、19或21表示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的DNA，并且該DNA編碼具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白。14.條目1到IO任一項(xiàng)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是下列(a)或(b)的蛋白(a)由SEQIDNO:12、14、16、18、20或22表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白；或(b)由帶有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白，并且該蛋白具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性。15.條目1到14任一項(xiàng)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中植物選自被子植物、裸子植物、蕨類植物和苔蘚植物。16.條目3中的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中的器官選自根、莖、塊莖、葉、花器官、塊根、種子和芽尖。17.條目3中的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中一種或多種組織選自表皮、靭皮部、軟組織、木質(zhì)部和維管束。18.通過共表達(dá)具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有糖-核苷酸合酶活性的外源蛋白而具有生產(chǎn)透明質(zhì)酸能力的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，或其后代，或其與在植物中具有相同性質(zhì)的器官或組織。19.具有生產(chǎn)透明質(zhì)酸能力的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，用含有編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，這些編碼DNA處于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下；其具有同樣性質(zhì)的后代，或其器官或組織。20.條目19中的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中啟動子是器官特異性或組織特異性啟動子。21.條目19或20中的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA是下面(a)或(b)的DNA:(a)由SEQIDNO:1或3表示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的DNA，并且該DNA編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白。22.條目18到20任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，其中具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白是下面(a)或(b)的蛋白(a)由SEQIDNO:2或4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白；或(b)由帶有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白，并且該蛋白具有透明質(zhì)酸合酶活性。23.條目18到22任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中糖-核苷酸是UDP-N-乙酰葡萄糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸。24.條目18到23任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是選自下列的至少一種蛋白谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙?；浮DP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶。25.條目18到23任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是從選自下列的至少一種蛋白UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙?；浮DP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶，以及谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶。26.條目18到23任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶和/或UDP-葡萄糖脫氫酶。27.條目19到26任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA來自小球藻病毒和/或擬南芥。28.條目19到27任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是下列(a)或(b)的DNA:(a)由SEQIDNO:5、7或9表示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的DNA，并且該DNA編碼具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。29.條目18到27任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是下列(a)或(b)的蛋白(a)由SEQIDNO:6、8或10表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白；或(b)由帶有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白，并且該蛋白具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性。30.條目19到27任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是下歹ij(a)或(b)的DNA:(a)由SEQIDNO:U、13、15、17、19或21表示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與由(a)的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA，并且該DNA編碼具有DP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白。31.條目18到27任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是下列(a)或(b)的蛋白(a)由SEQIDNO:12、14、16、18、20或22表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白；或(b)由帶有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)中的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白，并且所述蛋白具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性。32.條目18到31任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中植物是選自被子植物、裸子植物、蕨類植物和苔蘚植物的任何植物。33.條目18到31任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中的器官是選自根、莖、塊莖、葉、花器官、塊根、種子和芽尖的一種或多種器官。34.條目18到31任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中的組織是選自表皮、靭皮部、軟組織、木質(zhì)部和維管束的一種或多種組織。35.從條目18到34任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織獲得的植物提取物。36.條目35中的植物提取物，其中植物提取物含有透明質(zhì)酸。37.重組表達(dá)載體，含有編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA的，這些DNA處于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下。38.條目37的重組表達(dá)載體，其中啟動子是器官特異性或組織特異性啟動子。39.條目37或38的重組表達(dá)載體，其中編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA是下面(a)或(b)的DNA:(a)由SEQIDNO:1或3表示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與由(a)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA，并且該DNA編碼具有透明質(zhì)酸活性的蛋白。40.條目37或38的重組表達(dá)載體，其中具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白是下面(a)或(b)的蛋白(a)由SEQIDNO:2或4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白；或(b)具有由帶有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白，并且該蛋白具有透明質(zhì)酸合酶活性。41.條目37到40任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體，其中糖-核苷酸是UDP-N-乙酰葡萄糖胺禾口/或UDP-葡萄糖醛酸。42.條目37到41任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是選自下列的至少一種蛋白谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙?；浮DP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶。43.條目37到41任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是選自下列蛋白的至少一種蛋白UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙?；浮DP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶，以及谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶。44.條目37到41任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶和/或UDP-葡萄糖脫氫酶。45.條目37到41任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是來自小球藻病毒和/或擬南芥的DNA。46.條目37到44任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是下列(a)或(b)的DNA:(a)由SEQIDNO:5、7或9表示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與由(a)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA，并且所述DNA編碼具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。47.條目37到44任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是下列(a)或(b)的蛋白(a)由SEQIDNO:6、8或10表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白；或(b)具有，由帶有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白，并且該蛋白具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性。48.條目37到44任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是下列(a)或(b)的DNA:(a)由SEQIDNO:11、13、15、17、19或21表示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與由(a)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA，并且所述DNA編碼具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白。49.條目37到44任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是下列(a)或(b)的蛋白(a)由SEQIDNO:12、14、16、18、20或22表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白；或(b)由帶有一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加的(a)的氮基酸序列構(gòu)成的蛋白，并且所述蛋白具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性。50.生產(chǎn)具有產(chǎn)生透明質(zhì)酸能力的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括使用條目37到49任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物。51.含有透明質(zhì)酸作為活性劑的化妝品組合物，其中透明質(zhì)酸通過條目1到17任一項(xiàng)的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法來獲得。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，在植物中生產(chǎn)不能天然在植物中產(chǎn)生的透明質(zhì)酸。根據(jù)本發(fā)明，在植物中表達(dá)編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的基因和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的基因，使得在植物中大量生產(chǎn)透明質(zhì)酸。比常規(guī)方法能夠生產(chǎn)更多的透明質(zhì)酸的植物或培養(yǎng)的植物細(xì)胞、其方法及其重組表達(dá)載體能夠被提供。因此，本發(fā)明能以低成本提供植物產(chǎn)生的安全的透明質(zhì)酸。本發(fā)明具體實(shí)施方式本發(fā)明的特點(diǎn)是生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，包括在植物細(xì)胞或植物中共表達(dá)具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有糖-核苷酸合酶活性的外源蛋白，以便獲得透明質(zhì)酸。本發(fā)明的另一個特點(diǎn)是生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，包括(1)使用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，該重組表達(dá)載體含有編碼具有透明質(zhì)酸合酵活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA，這些DNA處于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下；(2)令通過轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化體生長；以及P)分離轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的透明質(zhì)酸。本發(fā)明的再一個特點(diǎn)是含有透明質(zhì)酸作為活性劑的化妝品組合物，其中透明質(zhì)酸通過上述的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法來獲得。本發(fā)明的再一個特點(diǎn)是生產(chǎn)透明質(zhì)酸的重組表達(dá)載體，其中重組表達(dá)載體含有編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA，這些DNA處于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下。本發(fā)明的某些特點(diǎn)是轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中轉(zhuǎn)化體通過共表達(dá)具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有糖-核苷酸合酶活性的外源蛋白而獲得生產(chǎn)透明質(zhì)酸的能力。本發(fā)明的一個特點(diǎn)是轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中轉(zhuǎn)化體使用重組表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該重組表達(dá)載體含有編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA，這些DNA處于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下。本發(fā)明的另一個特點(diǎn)是生產(chǎn)有能力產(chǎn)生透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法包括使用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，該重組表達(dá)載體含有編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA，這些DNA處于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下。下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的解釋。透明質(zhì)酸合酶在本發(fā)明中，使用編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，這些DNA處于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下。在本發(fā)明中，具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白使用UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰葡萄糖胺作為底物來合成透明質(zhì)酸。透明質(zhì)酸具有由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的重復(fù)單位構(gòu)成的聚合物結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明中，具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白沒有具體的限制，只要所述蛋白具有上面提到的性質(zhì)?？梢允褂脕碜詣游?、微生物、病毒等的透明質(zhì)酸合酶(在后文中有時簡寫為HAS)。具體來說，可以使用來自脊椎動物例如人類、小鼠、兔、雞、牛以及非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、微生物例如鏈球菌和巴氏桿菌、病毒例如小球藻病毒等的透明質(zhì)酸合酶。更具體來說，具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的例子是來自小球藻病毒PBCV-1的HAS(A98R);來自人類的透明質(zhì)酸合酶(hHAS)HASl、HAS2和HAS3;來自小鼠透明質(zhì)酸合酶(mHAS)的HAS1、HAS2和HAS3;來自雞透明質(zhì)酸合酶(gHAS)的HAS1、HAS2和HAS3;來自大鼠透明質(zhì)酸合酶(rHAS)的HAS2;來自牛透明質(zhì)酸合酶(bHAS)的HAS2;來自非洲爪蟾透明質(zhì)酸合酶(xHAS)的HAS1、HAS2禾BHAS3、來自多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)的透明質(zhì)酸合酶(pmHAS);來自化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的透明質(zhì)酸合酶(spHAS);以及來自似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)的透明質(zhì)酸合酶(seHAS)基因。透明質(zhì)酸合酶(HAS)基因具有不同的類型，例如HAS1、HAS2和HAS3，但是，對類型沒有特別的限制。任何上述的HAS都可以使用，其中來自小球藻病毒的HAS是優(yōu)選的，由SEQIDNO:2或4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白顯示的小球藻病毒來源的HAS是更加優(yōu)選的。由SEQIDNO:2或4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白可以是具有一個或多個氨基酸缺失、取代或添加的蛋白，只要透明質(zhì)酸合酶的活性沒有喪失就行。例如，SEQIDNO:2或4表示的氨基酸序列可以具有至少一個氨基酸、優(yōu)選1到10個氨基酸、更優(yōu)選1到5個氨基酸的缺失，至少一個氨基酸、優(yōu)選1到10個氨基酸、更優(yōu)選1到5個氨基酸的添加，或至少一個氨基酸、優(yōu)選1到10個氨基酸、更優(yōu)選1到5個氨基酸被其它氨基酸的取代。但是，突變不限于上述。這樣的突變除了天然發(fā)生的突變之外還包括人工突變。例如，已經(jīng)報(bào)道了來自多殺性巴氏桿菌的透明質(zhì)酸合酶即使在推測的膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域和推測的跨膜結(jié)構(gòu)域中缺失大約270個氨基酸后，仍具有透明質(zhì)酸合酶活性(Jing等，2000，Glycobiology，10,883-889)。突變的氨基酸的數(shù)量沒有限制，只要透明質(zhì)酸合酶活性沒有喪失就行。HAS可以是由SEQIDNO:2或4表示的氨基酸序列的一部分構(gòu)成的、具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白。透明質(zhì)酸合酶的活性如下進(jìn)行測定。為了進(jìn)行反應(yīng)，將樣品在0.2ml50mMTris-HCl緩沖液(pH7.0)中孵育1小時，緩沖液中含有l(wèi)mM二硫蘇糖醇、20mM氯化鎂、lmM乙二醇雙(p-氨基乙基醚)-N，N,N，N-四乙酸、15%甘油、0.5mM尿苷-5'-二磷酸葡萄糖醛酸(后文中簡寫為UDP-GlcA)、0.5mM尿苷-5'-二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺(后文中簡寫為UDP-GlcNAc)、O.l岸UDP-[14C]GlcA、0.24岸UDP-[3H]GlcNAc和125pg葡萄糖醛酸。孵育后，通過煮沸10分鐘終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物分為兩份，在一份溶液中加入0.5單位來自停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)的透明質(zhì)酸酶(SeikagakuCorporation),然后在30°C孵育4小時。然后將反應(yīng)溶液煮沸10分鐘以使透明質(zhì)酸酶失活。使用SuperdexPeptideHR10/30(AmarshamPharmaciaBiotechInc.帝iJ造)柱層析(洗脫液0.2M乙酸銨)，將每0.5ml反應(yīng)混合物分級成級份。對每個級份測量放射活性。結(jié)果，可以根據(jù)透明質(zhì)酸酶消化的低分子量產(chǎn)物的量，從樣品反應(yīng)混合物確定透明質(zhì)酸的活性。透明質(zhì)酸酶活性也可以使用三明治方法進(jìn)行測定，其中產(chǎn)生的透明質(zhì)酸使用透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白進(jìn)行測量。根據(jù)本發(fā)明，編碼具有透明質(zhì)酸合酶的蛋白的DNA，是編碼從作為底物的UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰葡萄糖胺合成透明質(zhì)酸的蛋白的DNA，其中透明質(zhì)酸具有由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的重復(fù)單位構(gòu)成的聚合物結(jié)構(gòu)。按照本發(fā)明，編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA沒有具體的限制，只要蛋白具有上述的性質(zhì)就行。可以使用來自動物、微生物、病毒等的透明質(zhì)酸合酶(在后文中有時簡寫為HAS)基因。例如可以使用來自脊椎動物例如人類、小鼠、兔、雞、牛以及非洲爪蟾、微生物例如鏈球菌和巴氏桿菌、以及病毒例如小球藻病毒等的透明質(zhì)酸合酶基因。更具體來說，包括了來自小球藻病毒株P(guān)BCV-1的HAS(A98R)基因；來自人類的透明質(zhì)酸合酶(hHAS)基因HAS1、HAS2和HAS3;來自小鼠透明質(zhì)酸合酶(mHAS)基因的HAS1、HAS2和HAS3;來自雞透明質(zhì)酸合酶(gHAS)基因的HAS1、HAS2和HAS3;來自大鼠透明質(zhì)酸合酶(rHAS)基因的HAS2;來自牛透明質(zhì)酸合酶(bHAS)基因的HAS2;來自非洲爪蟾透明質(zhì)酸合酶(xHAS)基因的HAS1、HAS2和HAS3;來自多殺性巴氏桿菌的透明質(zhì)酸合酶(pmHAS)基因；來自化膿性鏈球菌的透明質(zhì)酸合酶(spHAS)基因；以及來自似馬鏈球菌的透明質(zhì)酸合酶(seHAS)基因。透明質(zhì)酸合酶(HAS)基因具有各種類型，例如HAS1、HAS2禾口HAS3，但是，對類型沒有特別的限制。可以使用任何上述的HAS，其中來自小球藻病毒的HAS基因是優(yōu)選的，由SEQIDNO:1或3表示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA所示的小球藻病毒來源的HAS基因是更加優(yōu)選的。DNA可以是在嚴(yán)緊條件下與由SEQIDNO:1或3表示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA雜交、并編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA。上述的術(shù)語"嚴(yán)緊條件"是指在該條件下，其中只有這樣的核苷酸序列才能與特定的序列形成特定雜交體(也就是特異性雜交體)，即所述核苷酸序列編碼的多肽與具有SEQIDNO:1或3所示的核苷酸序列的透明質(zhì)酸合酶具有同等的透明質(zhì)酸合酶活性，而編碼活性不等同的多肽的核苷酸序列不會與特定的序列形成特定雜交體(也就是非特異性雜交體)。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員通過改變雜交反應(yīng)和清洗的溫度、雜交反應(yīng)溶液和清洗溶液的鹽濃度等，能夠容易地選擇這樣的條件。具體來說，本發(fā)明的嚴(yán)緊條件的一個例子是其中在6xSSC(0.9MNaCl，0.09M檸檬酸三鈉)或6XSSPE(3MNaCl，0.2MNaH2P04，20mMEDTA.2Na，pH7.4)中于42°C下進(jìn)行雜交，然后使用0.5XSSC在42°C下進(jìn)行清洗的條件，但是，嚴(yán)緊條件并不限于這樣的條件。嚴(yán)緊條件優(yōu)選為高度嚴(yán)緊條件。對高度嚴(yán)緊條件沒有特別的限制，只要編碼A98R的基因不雜交就行。例如，高度嚴(yán)緊條件是其中在鹽濃度等效于0.1xSSC或04SDS下在60。C進(jìn)行清洗的條件。糖-核苷酸可以使用的糖-核苷酸的例子是UDP-N-乙酰葡萄糖胺、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-N-乙酰半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-木糖、GDP-海藻糖、GDP-甘露糖、CMP-神經(jīng)氨酸等，但是，糖-核苷酸不限于這些。在這些糖-核苷酸中，UDP-糖是優(yōu)選的，更加優(yōu)選的是UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-葡萄糖醛酸。通過提高這些糖-核苷酸的生產(chǎn)水平，在植物細(xì)胞或植物中用作透明質(zhì)酸合酶底物的UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰葡萄糖胺的量增加了。為了提高這些糖-核苷酸的生產(chǎn)水平，在植物細(xì)胞或植物中導(dǎo)入了糖-核苷酸生物合成途徑的酶，即具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白。此外，在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，在植物細(xì)胞或植物中同時導(dǎo)入具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白，能夠使用增加的UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰葡萄糖胺作為底物，增加透明質(zhì)酸的合成，其中透明質(zhì)酸具有由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的重復(fù)單位構(gòu)成的聚合物結(jié)構(gòu)。與糖-核苷酸生物合成途徑有關(guān)的酶根據(jù)本發(fā)明，植物細(xì)胞或植物用編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這些DNA處于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下?？梢允褂镁哂刑?核苷酸合酶活性的蛋白，例如UDP-N-乙酰葡萄糖胺、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-N-乙酰半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-木糖、GDP-海藻糖、GDP-甘露糖和CMP-神經(jīng)氨酸。在這些糖-核苷酸中，具有涉及UDP-N-乙酰葡萄糖胺、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-N-乙酰半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-木糖的合酶活性的蛋白是優(yōu)選的。具有涉及糖、UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-葡萄糖醛酸的糖-核苷酸合酶活性的蛋白是更加優(yōu)選的。本發(fā)明的具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白可以是催化與糖-核苷酸生物合成途徑有關(guān)的反應(yīng)的酶。酶的例子是谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙?；?、UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶等。選自這些具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的至少一種蛋白可以在植物細(xì)胞或植物中表達(dá)。作為具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白，也可以至少選擇谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶，并在植物細(xì)胞或植物中與具有其它的糖-核苷酸合酶活性的蛋白組合表達(dá)。谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶以外的其它具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的例子選自下列的至少一種氨基酸蛋白UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙酰化酶、UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶等。為了達(dá)到本發(fā)明的預(yù)期效果，至少選擇谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶作為具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白，從而獲得比常規(guī)方法更好的效果。更優(yōu)選下，選擇谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶(后文中有時簡寫為GFAT)和UDP-葡萄糖脫氫酶(后文中有時簡寫為UGD)二者。單獨(dú)使用UDP-葡萄糖脫氫酶也顯示出比常規(guī)方法更增強(qiáng)的效果。谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶本發(fā)明的具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白是以L-谷氨酰胺和果糖-6-磷酸作為底物合成葡萄糖胺-6-磷酸的蛋白。本發(fā)明的具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白沒有具體的限制，只要具有上面提到的性質(zhì)就行。這樣的蛋白的例子是來自真核生物、原核生物、病毒等的GFAT?？梢允褂脕碜哉婧松锢缛祟悺⑿∈?、玉米、擬南芥、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的GFAT，來自原核生物例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和大腸桿菌的GFAT，以及來自病毒例如小球藻病毒的GFAT，但是，蛋白并不限于這些?？梢詢?yōu)選使用上述的GFAT，其中來自小球藻病毒或擬南芥的GFAT是更加優(yōu)選的。由SEQIDNO:6或8表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白所示的來自小球藻病毒的GFAT、和由SEQIDNO:IO表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白所示的來自擬南芥的GFAT，是特別優(yōu)選的。蛋白也可以是由SEQIDNO:6、8或10表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白，或者是其氨基酸序列中具有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的蛋白，只要谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶的活性沒有喪失就行。例如，SEQIDN0:6、8或10表示的氨基酸序列可以具有至少一個氨基酸、優(yōu)選1到10個氨基酸、更優(yōu)選1到5個氨基酸的缺失。SEQIDNO:6、8或10表示的氨基酸序列可以具有至少一個氨基酸、優(yōu)選1到10個氨基酸、更優(yōu)選1到5個氨基酸的添加。SEQIDNO:6、8或10表示的氨基酸序列可以具有至少一個氨基酸、優(yōu)選1到10個氨基酸、更優(yōu)選1到5個氨基酸被其它氨基酸的取代。但是，突變不限于上述的例子。這樣的突變除了天然發(fā)生的突變之外還包括人工突變。對突變的氨基酸的數(shù)量沒有具體的限制，只要GFAT活性沒有喪失就行。天然發(fā)生的突變的例子是來自小球藻病毒株Hirosaki的GFAT，其具有SEQIDNO:5的序列，由于突變，所述序列與已知的小球藻病毒株P(guān)BCV-1和K21在氨基酸序列中至少有2。/。的不同。蛋白可以是具有SEQIDNO:6、8或10表示的氨基酸序列的一部分、并具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性可以通過下面的方法來評估將酶溶液加入到反應(yīng)混合物(pH7.0)中，反應(yīng)混合物中含有果糖-6-磷酸(15mM)、L-谷氨酰胺(15mM)、EDTA(lmM)、DTT(lmM)和KH2PO4(60mM)，然后在37°C孵育幾小時，然后測量產(chǎn)生的葡萄糖胺-6-磷酸或谷氨酸的量。具體來說，方法的例子是Reissig方法(J.Biol.Chem,1955，217(2)，959-66)，這是測定葡萄糖胺-6-磷酸的Morgan&Elson方法的修改版本；使用谷氨酸脫氫酶測量谷氨酸的酶法分析(JBiochemBiophysMethods,2004,59(3)，201-8)等。本發(fā)明的編碼具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白的DNA是編碼具有以1^谷氨酰胺和果糖-6-磷酸為底物合成葡萄糖胺-6-磷酸的酶活性的蛋白的DNA。本發(fā)明的編碼具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白的DNA沒有具體的限制，只要蛋白具有上面提到的性質(zhì)就行。這樣的GFAT基因的例子是來自真核生物、原核生物、病毒等的GFAT基因?？梢允褂脕碜哉婧松锢缛祟?、小鼠、玉米、擬南芥、秀麗隱桿線蟲和釀酒酵母的GFAT基因，來自原核生物例如枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的GFAT基因，以及來自病毒例如小球藻病毒的GFAT基因。GFAT基因具有不同的類型，例如GFAT1和GFAT2，但是，對類型沒有具體的限制?？梢詢?yōu)選使用上述的GFAT基因，其中來自小球藻病毒或來自擬南芥的GFAT基因是更加優(yōu)選的。來自小球藻病毒并由SEQIDNO:5或7表示的核苷酸序列構(gòu)成的GFAT基因、或來自擬南芥并由SEQIDNO:9表示的核苷酸序列構(gòu)成的GFAT基因，是特別優(yōu)選的。DNA也可以是在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:5、7或9表示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列雜交、并編碼具有GFAT活性的蛋白的DNA。上述的術(shù)語"嚴(yán)緊條件"是指在該條件下，只有編碼的多肽的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性與SEQIDNO:5、7或9表示的谷氨酰胺果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性同等的核苷酸序列才能與特定的序列形成雜交體(即特異性雜交體)，而編碼活性不等同的多肽的核苷酸序列不會與特定的序列形成雜交體(也就是非特異性雜交體)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過改變雜交反應(yīng)和清洗的溫度、雜交反應(yīng)溶液和清洗溶液的鹽濃度等，能夠容易地選擇這樣的條件。本發(fā)明的嚴(yán)緊條件的一個例子是用6xSSC(0.9MNaCl，0.09M檸檬酸三鈉)或6XSSPE(3MNaCl，0.2MNaH2PO4，20mMEDTA2Na，pH7.4)中于42。C下進(jìn)行雜交、然后使用0.5XSSC在42。C下進(jìn)行清洗的條件，但是，嚴(yán)緊條件并不限于這些。嚴(yán)緊條件優(yōu)選為高度嚴(yán)緊條件。"高度嚴(yán)緊條件"例如是在鹽濃度等效于0.1xSSC或0.!SDS在60。C進(jìn)行清洗的條件。UDP-葡萄糖脫氫酶本發(fā)明的具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白可以是以UDP-葡萄糖為底物合成UDP-葡萄糖醛酸的蛋白。對本發(fā)明的具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白沒有具體的限制，只要蛋白具有上面提到的性質(zhì)就行。蛋白的例子是來自真核生物、原核生物、病毒等的UGD?？梢允褂脕碜哉婧松锢缛祟?、牛、小鼠、白楊、甘蔗和擬南芥的UGD，來自原核生物例如大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)的UGD，以及來自病毒例如小球藻病毒的UGD，但是，本發(fā)明的蛋白并不限于這些?？梢詢?yōu)選使用上述的UGD，其中來自小球藻病毒或擬南芥的UGD是更加優(yōu)選的。來自小球藻病毒并由SEQIDNO:12或14表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白的UGD、和由SEQIDNO:16、18、20或22表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白的來自擬南芥的UGD，是特別優(yōu)選的。蛋白可以是由SEQIDNO:12、14、16、18、20或22表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白，或者是具有突變例如一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的蛋白，只要UDP-葡萄糖脫氫酶的活性沒有喪失就行。例如，SEQIDNO:12、14、16、18、20或22表示的氨基酸序列可以具有至少一個氨基酸、優(yōu)選1到10個氨基酸、更優(yōu)選1到5個氨基酸的缺失。SEQIDNO:12、14、16、18、20或22表示的氨基酸序列可以具有至少一個氨基酸、優(yōu)選1到IO個氨基酸、更優(yōu)選1到5個氨基酸的添加。SEQIDNO:12、14、16、18、20或22表示的氨基酸序列也可以具有至少一個氨基酸、優(yōu)選1到10個氨基酸、更優(yōu)選1到5個氨基酸被其它氨基酸的取代。但是，突變不限于上述。這樣的突變除了天然發(fā)生的突變之外還包括人工突變。對突變的氨基酸的數(shù)量沒有具體的限制，只要UGD活性沒有喪失就行。蛋白也可以是具有SEQIDNO:12、14、16、18、20或22表示的氨基酸序列的一部分、并具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白UDP-葡萄糖脫氫酶活性可以通過下面的方法來評估將酶溶液加入到反應(yīng)混合物(pH8.0)中，反應(yīng)混合物含有UDP-葡萄糖(4mM)、NAD+(lmM)、EDTA(lmM)和Tris-HCl(20mM)，在37°C進(jìn)行反應(yīng)，然后測量產(chǎn)生的UDP-葡萄糖醛酸或NADH。具體來說，NADH可以按照Tenhaken和Thulke的報(bào)告(PlantPhysiol.1996,112:1127-34)來測量。本發(fā)明的編碼具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白的DNA是編碼具有以UDP-葡萄糖為底物合成UDP-葡萄糖醛酸的酶活性的蛋白的DNA。對本發(fā)明的編碼具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白的DNA沒有具體的限制，只要蛋白具有上面提到的性質(zhì)就行。DNA的例子是來自真核生物、原核生物、病毒等的UGD基因?？梢允褂脕碜哉婧松锢缛祟?、牛、小鼠、白楊、甘蔗和擬南芥的UGD基因，來自原核生物例如大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和乳酸乳桿菌的UGD基因，以及來自病毒例如小球藻病毒等的UGD基因，但是，UGD基因并不限于這些?？梢詢?yōu)選使用上述的UGD基因，其中來自小球藻病毒或擬南芥的UGD基因是更加優(yōu)選的，特別優(yōu)選來自小球藻病毒并具有SEQIDNO:11或13表示的核苷酸序列的UGD基因、或來自擬南芥并具有SEQIDNO:15、17、19或21表示的核苷酸序列的UGD基因。DNA可以是在嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:11、13、15、17、19或21表示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA雜交、并編碼具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白的DNA。上述的"嚴(yán)緊條件"是指在該條件下，只有編碼的多肽的活性與SEQIDNO:ll、13、15、17、19或21表示的UDP-葡萄糖脫氫酶等同的核苷酸序列才能與特定的序列形成特定的雜交體(即特異性雜交)，而編碼的多肽的活性不等同的核苷酸序列不能與特定序列形成雜交體(即非特異性雜交)。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員可以通過改變雜交反應(yīng)和清洗的溫度、調(diào)整雜交反應(yīng)溶液和清洗溶液的鹽濃度等，容易地選擇這樣的條件。嚴(yán)緊條件的一個例子是用6xSSC(0.9MNaCl，0.09M檸檬酸三鈉)或6XSSPE(3MNaCl，0.2MNaH2P04，20mMEDTA2Na，pH7.4)中于42°C下進(jìn)行雜交，然后使用0.5XSSC進(jìn)行清洗的條件。但是，嚴(yán)緊條件并不限于這些。嚴(yán)緊條件優(yōu)選為高度嚴(yán)緊條件。高度嚴(yán)緊條件是，例如，在鹽濃度等效于O.lxSSC或0.!SDS下在60。C進(jìn)行清洗的條件。重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化能夠生產(chǎn)透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、后代、或具有其同樣性質(zhì)的其器官或組織，可以通過使用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主來獲得。重組表達(dá)載體含有編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA，這些DNA處于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下。具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白被表達(dá)在上述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、后代、具有其同樣性質(zhì)的其器官或組織中。"具有糖-核苷酸合酶活性的外源蛋白"與內(nèi)源蛋白不同，是具有糖-核苷酸合酶活性并且新近從外部被引入到植物細(xì)胞或植物中的外來蛋白。"新近從外部引入這樣的基因"的方法的例子包括使用重組表達(dá)載體等進(jìn)行轉(zhuǎn)化。"新近從外部引入基因"包括使用重組表達(dá)載體從細(xì)胞外部轉(zhuǎn)化內(nèi)源基因。因?yàn)樵谥参锛?xì)胞和植物中尚沒有發(fā)現(xiàn)具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白，無需說明，顯然蛋白是外源的。上述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、后代、或具有其同樣性質(zhì)的其器官或組織能夠高水平產(chǎn)生透明質(zhì)酸。這將在下面論證。在本發(fā)明中，宿主是指任何完整的植物、種子、植物器官(例如花瓣、根、莖、塊莖、葉、花器官、塊根、種子、芽尖等)、植物組織(例如表皮、靭皮部、軟組織、木質(zhì)部和維管束等)、或培養(yǎng)的植物細(xì)胞。在本發(fā)明中，植物是指任何多細(xì)胞植物，包括種子植物、裸子植物、蕨類植物、苔蘚植物、地衣等，包括任何整株植物、種子、植物器官(例如花瓣、根、莖、塊莖、葉、花器官、塊根、種子、芽尖等)、植物組織(例如表皮、靭皮部、軟組織、木質(zhì)部和維管束等)、或培養(yǎng)的植物細(xì)胞。因此，也可以通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化體、并分離從中產(chǎn)生的透明質(zhì)酸來生產(chǎn)透明質(zhì)酸。通常用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的載體可以被用作重組表達(dá)載體。對這樣的載體沒有具體的限制，只要載體含有能夠在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子序列和穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本所需的多聚腺苷化位點(diǎn)就行。例如，可以使用載體如"pBI121"、"pBI221"、"pBI101"和"pIG121Hm"。當(dāng)使用培養(yǎng)的植物細(xì)胞作為宿主時，可以通過采用電穿孔方法、土壤桿菌雙載體方法或微粒轟擊方法，將用于生產(chǎn)透明質(zhì)酸的重組表達(dá)載體導(dǎo)入培養(yǎng)的植物細(xì)胞來進(jìn)行轉(zhuǎn)化。載體含有編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA，這些DNA置于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下。其中導(dǎo)入了表達(dá)載體的植物細(xì)胞是，例如，在對抗生素如卡那霉素等的抗性的基礎(chǔ)上選擇的。轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以用于細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。也可能使用已知的植物組織培養(yǎng)方法再生植物。經(jīng)受轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的例子包括來自煙草的BY-2細(xì)胞和T-13細(xì)胞、來自胡蘿卜的kurodagosun細(xì)胞、來自葡萄的VR細(xì)胞和VW細(xì)胞、來自美洲商陸(PhytolaccaamericanaL.)的PAR細(xì)胞、PAP細(xì)胞和PAW細(xì)胞、來自擬南芥的T87細(xì)胞、來自蘆筍的Asp-86細(xì)胞、A.per細(xì)胞、A.pas細(xì)胞和A.pIo細(xì)胞、來自西瓜的Cba-l細(xì)胞、來自西紅柿的Sly-l細(xì)胞、來自胡椒的l-Mar細(xì)胞、來自長春花(Madagascarperiwinkle)的CRA細(xì)胞和V208細(xì)胞、來自菠菜的Spi-WT細(xì)胞、Spi-I-1細(xì)胞和Spi-12F細(xì)胞、來自葫蘆的Lcy-l細(xì)胞、LcyD6細(xì)胞和LcyD7細(xì)胞、來自水稻(Oryzasativa)的OS-l細(xì)胞、來自長春花(Vincarosea)的Vma-l細(xì)胞、來自芝麻的PSB細(xì)胞、PSW細(xì)胞和PSG細(xì)胞、以及來自百日草(Zinniaelegans)的ZE3細(xì)胞。當(dāng)使用培養(yǎng)的植物細(xì)胞作為宿主時，可以通過采用土壤桿菌雙載體方法將用于生產(chǎn)透明質(zhì)酸的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物、或微粒轟擊方法或電穿孔方法將其導(dǎo)入原生質(zhì)體來進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中的載體含有編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA，這些DNA處于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下，然后分離轉(zhuǎn)化獲得的瘤組織、新芽和毛根等。上述獲得的瘤組織、新芽和毛根等可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)或器官培養(yǎng)。這些轉(zhuǎn)化體也可以通過目前已知的植物組織培養(yǎng)方法、通過添加適當(dāng)濃度的植物激素等再生成植物。為了從導(dǎo)入了透明質(zhì)酸合酶基因的細(xì)胞再生植物，可以將這樣的植物細(xì)胞培養(yǎng)在再生培養(yǎng)基、無激素MS培養(yǎng)基或其它類似培養(yǎng)基上。產(chǎn)生的生根幼株可以被栽種在土壤中生長。再生的方法根據(jù)植物細(xì)胞的類型而不同，但使用目前已知的植物組織培養(yǎng)方法是可能的。例如，F(xiàn)ujimura等的方法(Fujimura等(1955)，PlantTissueCultureLett.，Vol.2:p.74)可以用于水稻，Shillito等的方法(Shillito等(1989),Bio/Technology,Vol.7:p.581，以及Gorden-Kamm(1990),PlantCell,2，603)可以用于玉米，Visser等的方法(Visser等(1989)，Theor.Appl.Genet,Vol.78:p589)可以用于土豆。Nagata等的方法(Nagata等(1971)，Planta99，12)可以用于煙草，Akama等的方法(Akamaetal.(1992),PlantCellRep.，Vol.12:p.7)可以用于擬南芥。通過這樣的方法產(chǎn)生的植物，或后代；例如，來自具有其同樣性質(zhì)的種子、塊莖、插條等再生的植物，也是本發(fā)明的目標(biāo)。為了在植物中產(chǎn)生具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白，并進(jìn)一步生產(chǎn)和積累或分泌透明質(zhì)酸，編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA，優(yōu)選被置于能夠在植物中起作用的啟動子的控制之下，從而DNA在所需的組織或器官中被特異性表達(dá)。為了像這樣控制表達(dá)，可以進(jìn)一步在重組表達(dá)載體中插入組織特異性或器官特異性啟動子。如果使用階段特異性啟動子來代替，靶基因只能在特定的時期內(nèi)表達(dá)。因此，產(chǎn)量只有在特定的時期內(nèi)才能增加。例如，使用植物生長階段-特異性啟動子只能在植物生長階段增加產(chǎn)量。器官特異性啟動子的例子是根特異性啟動子、塊莖啟動子塊莖特異性啟動子、葉特異性啟動子、種子特異性啟動子、莖特異性啟動子等<=組織特異性啟動子的例子是綠色組織特異性啟動子等。更具體來說，可用的啟動子包括組成型高表達(dá)啟動子例如CaMV35S啟動子，它是花椰菜花葉病毒35SRNA的啟動子，等。綠色組織特異性啟動子包括，例如，編碼核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶小亞基蛋白的基因的rbs啟動子、編碼葉綠素a/b-結(jié)合蛋白的基因的CAB啟動子、以及編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的A亞基蛋白的基因的GapA啟動子。種子特異性啟動子包括脂氧合酶基因的LOX啟動子、植物凝集素基因的Psl啟動子、淀粉酶基因的AmylA啟動子等。根特異性啟動子包括茛菪堿6b-羥化酶基因的A6H6H啟動子、腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶的PMT啟動子等。莖特異性啟動子包括蔗糖合酶的Sus4啟動子、編碼糖蛋白的基因的patatin啟動子等。也可以設(shè)想使用可誘導(dǎo)的啟動子來控制編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA的表達(dá)。誘導(dǎo)性啟動子的例子在下面描述?？烧T導(dǎo)的啟動子的例子包括PRla啟動子，這是疾病抗性相關(guān)基因的啟動子，其表達(dá)水平被受傷或加入水楊酸所增強(qiáng)；rd29A啟動子，其表達(dá)水平被干旱、低溫、高鹽濃度、添加脫落酸等所增強(qiáng)。由用作農(nóng)業(yè)化學(xué)物質(zhì)的化合物誘導(dǎo)表達(dá)的啟動子的例子包括編碼谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的27KDa亞基蛋白的基因的GST-27啟動子，它受除草劑安全劑的誘導(dǎo)；激酶啟動子和基因的PR啟動子，受苯并(l,2，3)-噻二唑-7-硫代羥酸S-甲基酯(BTH)的誘導(dǎo)。此外，為了在植物中更穩(wěn)定地表達(dá)編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA，可以使用隔離子，可以加入信號肽以將具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白定位到靶細(xì)胞器中，可以取代或缺失一部分透明質(zhì)酸合酶，等等。接受轉(zhuǎn)化的植物包括其中可能進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的任何植物。本發(fā)明的植物或植物體包括被子植物中的單子葉植物和雙子葉植物，以及裸子植物。這樣的植物也可以包括任選的有用的植物，特別是作物、蔬菜植物、開花植物和木本埴物。本發(fā)明的植物或植物體也包括蕨類植物和苔蘚植物?？捎糜诒景l(fā)明的植物物種的例子具體包括屬于茄科、禾本科、十字花料、薔薇科、豆科、葫蘆科、唇形科、百合科、藜科、傘形科、桃金娘科、旋花科等的植物。屬于茄科的植物的例子包括屬于煙草屬、茄屬、曼陀羅屬、番茄屬或矮牽牛屬的植物，例如包括煙草、茄子、土豆、西紅柿、辣椒、矮牽牛等。屬于禾本科的植物的例子包括屬于稻屬、大麥屬、黑麥屬、蔗屬、稗屬或玉蜀黍?qū)俚闹参?，例如包括水稻、大麥、黑麥、山楂、高梁、玉米、甘蔗等。屬于十字花料的植物的例子包括屬于蘿卜屬、蕓苔屬、擬南芥屬、山葵屬或薺屬的植物，例如包括蘿卜、油菜籽、擬南芥、日本辣根、薺菜等。屬于薔薇科的植物的例子包括屬于杏屬、蘋果屬、梨屬、草莓屬或薔薇屬的植物，例如包括梅、桃、蘋果、梨、草莓、玫瑰等。屬于豆科的植物的例子包括屬于大豆屬、豇豆屬、菜豆屬、豌豆屬、蠶豆屬、落花生屬、車軸草屬、紫花苜蓿屬或苜蓿屬的植物，例如包括大豆、紅豆、青豆、豌豆、蠶豆、花生、三葉草、齒狀苜蓿等。屬于葫蘆科的植物的例子包括屬于絲瓜屬、南瓜屬或黃瓜屬的植物，例如包括葫蘆、南瓜、黃瓜、甜瓜等。屬于唇形科的植物的例子包括屬于薰衣草屬、薄荷屬或紫蘇屬的植物，例如包括薰衣草、薄荷、日式紫蘇葉等。屬于百合科的植物的例子包括屬于蔥屬、百合屬或郁金香屬的植物，例如包括大蔥、大蒜、百合、郁金香等。屬于藜科的植物的例子包括屬于菠菜屬的植物，例如包括甜菜、菠菜等。屬于傘形科的植物的例子包括屬于白芷屬、胡蘿卜屬、鴨兒芹屬或Apitum的植物，例如包括shishiudos、胡蘿卜、角苔、芹菜等。屬于旋花科的植物的例子包括屬于番薯屬的植物，例如包括甘薯等。與上述的轉(zhuǎn)基因植物具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織也是本發(fā)明的主題。產(chǎn)生具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞包括在本發(fā)明中。還包括產(chǎn)生具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織。透明質(zhì)酸的提取下面是通過將具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有合成糖-核苷酸的活性的外源蛋白共表達(dá)，并從獲得了生產(chǎn)透明質(zhì)酸的能力的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其后代、或具有其同樣性質(zhì)的其器官或組織中提取透明質(zhì)酸的分離或獲得透明質(zhì)酸的方法的例子。培養(yǎng)或生長轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，產(chǎn)生透明質(zhì)酸，然后任選通過己知的方法從轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物提取透明質(zhì)酸。檢驗(yàn)提取物的透明質(zhì)酸。例如，轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、其器官或組織等可以隨后被干燥、碾磨，然后用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑抽提。含有透明質(zhì)酸的提取物被過濾，獲得含有透明質(zhì)酸并不含植物細(xì)胞的濾液。將該濾液通過滲濾純化，以除去低分子量的雜質(zhì)。通過將含有溶解的透明質(zhì)酸的濾液用純水滲濾，然后連續(xù)棄去濾液，分離透明質(zhì)酸是可能的。當(dāng)透明質(zhì)酸被用于制藥時，可以進(jìn)一步進(jìn)行從溶液中沉淀核酸的步驟。該步驟可以通過，例如，加入陽離子表面活性劑例如氯化十六烷基吡啶的季銨化合物來迸行。在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中積累的透明質(zhì)酸也可以通過已知的分離方法進(jìn)行純化。透明質(zhì)酸的應(yīng)用本發(fā)明獲得的透明質(zhì)酸可以有效地用于化妝品和藥物組合物或生物材料。具體來說，透明質(zhì)酸在化妝品中可以用作保濕成分，用作關(guān)節(jié)炎、慢性風(fēng)濕病、燒傷和割傷的治療藥劑，或者眼藥水的成分。通過本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的透明質(zhì)酸可以用作活性劑，制造化妝品組合物。例如，透明質(zhì)酸可以以液體形式例如水溶液、油溶液、乳濁液和懸浮液，半固體的形式例如凝膠和霜劑，以及固體的形式例如粉末、顆粒、膠囊、微膠囊和固體來使用。透明質(zhì)酸可以使用已知的方法制備成那些形式，并制造成洗液、乳液、凝膠、霜劑、軟膏、硬膏、糊劑、氣霧劑、栓劑、注射劑、粉末、顆粒、片劑、丸劑、糖漿、錠劑等制劑。這些制劑可以通過敷用、黏貼、噴灑、飲用等使用。在這些制劑中，特別是洗液、乳液、霜劑、軟膏、硬膏、糊劑、氣霧劑等適合于皮膚使用。對于化妝品來說，透明質(zhì)酸可以用于皮膚護(hù)理美容品例如化妝水、化妝膏、乳液、面霜和面膜，化妝美容品如化妝液、化妝霜、乳液、霜和油膏形式的粉底、口紅、眼影和腮紅，身體護(hù)理美容品例如護(hù)手霜、護(hù)腿霜、全身潤膚液等，洗浴液，口腔護(hù)理化妝品和頭發(fā)護(hù)理化妝品。透明質(zhì)酸可以按照制造化妝品的通用方法生產(chǎn)成這樣的制劑。實(shí)施例下面的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說明了本發(fā)明，但是并不意欲對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。實(shí)施例l來自擬南芥的UGD基因的分離已經(jīng)從擬南芥中分離到了UDP-葡萄糖脫氫酶(BT006380:AtUGDl，SEQIDNO:15)基因，并顯示出具有活性(PlantJ.200021(6):537-46)。此外，NCBIBLAST(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)數(shù)據(jù)庫顯示出預(yù)測有三種類型的來自擬南芥的基因編碼UGD(AF424576:AtUGD2(SEQIDNO:17)、AY056200:AtUGD3(SEQIDNO:19)和AY070758:AtUGD4(SEQIDNO:21))。將這四種類型的UGD基因克隆，以證實(shí)它們的UGD活性。按照RNeasy(QIAGEN)方案從擬南芥中提取RNA。為了進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將2g總RNA溶解在5.5L無菌水中，與lL10M的寡聚d(T)引物混合，在70°C熱變性10分鐘?？焖倮鋮s后，使用ReverTraAce試劑盒(Toyobo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在42°C進(jìn)行30分鐘，在99°C進(jìn)行5分鐘。為了對來自擬南芥的UGD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的四個核苷酸序列設(shè)計(jì)PCR引物。導(dǎo)入表達(dá)載體pMAL-c2(NewEnglandBiolab)所必需的限制性酶切位點(diǎn)被添加到引物上。EcoRI或HindIII(SEQIDNO:23或24)被添加到AtUGDl上；EcoRI或PstI(SEQIDNO:25或26)添加到AtUGD2上；EcoRI或Pstl(SEQIDNO:27或28)添加到AtUGD3上；EcoRI或XbaI(SEQIDNO:29或30)添加到AtUGD4上。PCR使用KOD-plus-DNA聚合酶(Toyobo)進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?4°C2分鐘1個循環(huán)，94°C15秒、45°C30秒和68°C1分鐘3個循環(huán)，94°C15秒、55°C30秒和68°C1分鐘30個循環(huán)。使用1微升逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物作為模板DNA。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示出具有預(yù)期大小的PCR擴(kuò)增條帶。每個PCR擴(kuò)增的片段用限制性酶進(jìn)行酶切(AtUGDl:EcoRI禾口HindIII;AtUGD2和AtUGD3:EcoRI和Pstl;AtUGD4:EcoRI禾卩Xbal)，然后使用LigationHigh(Toyobo)克隆到用同樣的限制性酶消化的pMAL-c2中。使用連接混合物，通過上述的已知方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，轉(zhuǎn)化體加到含有氨芐青霉素(50g/mL)的Luria-Bertani(LB)瓊脂培養(yǎng)基上(10g/L細(xì)菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化鈉，15g/L瓊脂)，在37°C培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化體的生長的菌落中使用已知的方法提取質(zhì)粒。使用DNA測序儀測定插入片段的核苷酸序列，證實(shí)擴(kuò)增的基因是SEQIDNOS:15、17、19和21中表示的基因。這樣就構(gòu)建了質(zhì)粒pMAL-c2/AtUGDl、pMAL-c2/AtUGD2、pMAL-c2/AtUGD3和pMAL-c2/AtUGD4。上述證明，除了已經(jīng)被報(bào)道的AtUGDl之外，三種類型的UGD基因也在擬南芥中表達(dá)。帶有上述表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌JM109株在含有氨芐青霉素(50g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中于37。C培養(yǎng)過夜。用300L預(yù)培養(yǎng)物接種含有氨芐青霉素(50g/mL)和0.2%葡萄糖的LB培養(yǎng)基(30mL)，在37°C培養(yǎng)2小時。然后將溫度降低到25。C，加入終濃度為0.3mM的異丙基-Z3-硫代半乳糖苷(IPTG)，重組蛋白的表達(dá)被誘導(dǎo)24小時。通過離心從lmL培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，通過超聲碎裂進(jìn)行破碎以制備粗提取物。使用MagExtractor-MBP-(Toyobo)純化MBP融合蛋白。圖1顯示了表達(dá)的MBP融合蛋白的SDS-PAGE分析。在克隆的所有酶溶液中都觀察到了預(yù)期大小的條帶。按照Tenhaken和Thulke報(bào)道的方法(PlantPhysiol.1996，112:1127-34)測定了獲得的MBP融合蛋白的UGD活性。在該方法中，UGD反應(yīng)引起的NADH的增加作為Abs340的增加而被檢測。具體來說，將15L酶溶液(MBP-UGD融合蛋白)加入到含有UDP-葡萄糖(4mM)、NAD+(1mM)、EDTA(lmM)和Tris-HC1(20mM)的反應(yīng)混合物中(pH8.0);反應(yīng)在37°C下進(jìn)行；隨著時間測量反應(yīng)混合物的吸光度(Abs340)。表1顯示了MBP融合蛋白的酶活性。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>結(jié)果表明，AtUGDl、AtUGD2、AtUGD3和AtUGD4的所有酶溶液都具有UGD活性，說明在擬南芥中，AtUGD2、AtUGD3禾nAtUGD4基因、以及已經(jīng)報(bào)道的AtUGDl基因，都編碼UGD。實(shí)施例2來自小球藻病毒的UGD基因的分離為了通過PCR分離來自小球藻病毒的UDP-葡萄糖脫氫酶(cvUGD)基因，根據(jù)小球藻病毒PBCV-1株的已知的序列信息，設(shè)計(jì)SEQIDNOS:31和32的引物。為了導(dǎo)入表達(dá)載體pMAL-c2，EcoRI和Pstl位點(diǎn)被分別添加到5，-末端和3，-末端引物上。PCR使用KOD-plus-DNA聚合酶進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?4°C2分鐘1個循環(huán)，94°C15秒、60°C30秒和68°C1分鐘30個循環(huán)。小球藻病毒Hirosaki株(CVHI1)和Kakunodate株(CVKA1)的基因組DNA被用作模板DNA。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示出具有預(yù)期大小的PCR擴(kuò)增條帶。將每個PCR擴(kuò)增的片段用EcoRI和Pstl酶切，并使用LigationHigh克隆到用同樣的限制性酶消化的pMAL-c2中。使用連接混合物，根據(jù)上述的已知方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，轉(zhuǎn)化體加到含有50g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化體的生長菌落中使用己知的方法提取質(zhì)粒。使用DNA測序儀測定插入片段的核苷酸序列，獲得了來自CVHI1株和CVKA1株的新的UGD基因，分別命名為"cvUGD-HI基因"和"cvUGD-KA基因"。cvGFAT-HI禾BcvUGD-KA基因的核苷酸序列顯示在SEQIDNOS:11禾卩13中。這樣就構(gòu)建了質(zhì)粒pMAL-c2/cvUGD-HI和pMAL匿c2/cvUGD-KA。MBP融合蛋白按照與實(shí)施例1中相同的方式進(jìn)行表達(dá)和純化。圖2顯示了獲得的MBP融合蛋白的SDS-PAGE分析。在克隆的所有酶溶液中都觀察到了預(yù)期大小的條帶。表達(dá)的MBP融合蛋白的UGD活性按照與實(shí)施例1中相同的方式進(jìn)行測量。表1顯示了MBP融合蛋白的酶活性。通過上述方法進(jìn)行的UGD活性測量證明了cvUGD-HI和cvUGD-KA二者都編碼功能性酶。實(shí)施例3來自擬南芥的GFAT基因的分離作為植物來源的GFAT基因，已經(jīng)報(bào)道分離了來自玉米的GFAT基因(AccessionNo.AY106卯5)(WO00/11192)，但是還沒有從其它種類的植物中分離到GFAT基因。NCBIBLAST(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)數(shù)據(jù)庫顯示了一個來自擬南芥的GFAT基因(AccessionNo.NM—113314)，它與已知的基因高度同源。來自擬南芥的GFAT基因的核苷酸序列顯示在序列表的SEQIDNO:9中。按照RNeasy(QIAGEN)方案從擬南芥中提取RNA。為了進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將2g總RNA溶解在5.5L無菌水中，與lL10M的寡聚d(T)引物混合，在70°C熱變性10分鐘?？焖倮鋮s后，使用ReverTraAce試劑盒(Toyobo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在42°C進(jìn)行30分鐘，在99°C進(jìn)行5分鐘。為了對來自擬南芥的GFAT基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列設(shè)計(jì)SEQIDNOS:33和34的引物。為了導(dǎo)入無細(xì)胞表達(dá)載體pEU-NII(Toyobo)，在3'-末端引物上添加了Sail位點(diǎn)。PCR使用KOD-plus-DNA聚合酶進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?4°C2分鐘1個循環(huán)，94°C15秒、45°C30秒和68°C1分鐘3個循環(huán)，94°C15秒、55°C30秒和68。Cl分鐘30個循環(huán)。使用1微升逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)物作為模板DNA。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示出具有預(yù)期大小的PCR擴(kuò)增條帶。PCR擴(kuò)增的片段用限制性酶Sall進(jìn)行酶切，并使用LigationHigh克隆到用限制性酶EcoRV和SalI消化的pEU-NII中。使用連接混合物，根據(jù)上述的已知方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，轉(zhuǎn)化體加到含有50g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化體的生長菌落中使用已知的方法提取質(zhì)粒。這樣就構(gòu)建了質(zhì)粒pEU-NII/AtGFAT。使用DNA測序儀測定插入片段的核苷酸序列，證實(shí)了擴(kuò)增出的片段是SEQIDNO:9表示的基因。上述表明GFAT基因在擬南芥中表達(dá)。使用PROTEIOS(Toyobo的注冊商標(biāo))，表達(dá)了AtGFAT的重組蛋白。具體來說，反應(yīng)使用5g質(zhì)粒pEU/AtGFAT作為模板和T7RNA聚合酶，在37°C進(jìn)行4小時以合成mRNA。然后，將6gmRNA與麥胚提取物混合，反應(yīng)通過雙層方法在26°C進(jìn)行24小時。將反應(yīng)混合物懸浮在樣品緩沖液中(50mMTris-HCl(pH6.8)，2%SDS，10%甘油，0.6%-巰基乙醇)，煮沸5分鐘，然后通過SDS-PAGE分析表達(dá)的蛋白。觀察到了預(yù)期大小(大約75kDa)的條帶，表明了AtGFAT蛋白的表達(dá)(圖3)。對蛋白表達(dá)溶液進(jìn)行GFAT反應(yīng)。具體來說，將50L蛋白表達(dá)溶液加到含有果糖-6-磷酸(15mM)、L-谷氨酰胺(15mM)、EDTA(1mM)、DTT(lmM)和KH2PO4(60mM)的溶液中(pH7.0)，在37。C反應(yīng)4小時。使用Reissig方法(J.Biol.Chem,1955，217(2),959-66)測量反應(yīng)混合物中的葡萄糖胺-6-磷酸以評估GFAT活性，這種方法是Morgan&Elson方法的一種改進(jìn)方法。圖4顯示了結(jié)果。在用作對照的pEU-NII/DHFR中沒有檢測到葡萄糖胺-6-磷酸，而在pEU-NII/AtGFAT中觀察到了葡萄糖胺-6-磷酸的增加，這證實(shí)了在蛋白表達(dá)溶液中存在有活性的GFAT酶。上述表明在擬南芥中AtGFAT基因編碼功能性酶。實(shí)施例4來自小球藻病毒的GFAT基因的分離制備PCR引物，通過PCR分離來自小球藻病毒的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶基因(cvGFAT)。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的小球藻病毒PBCV-1株的核苷酸序列信息，設(shè)計(jì)SEQIDNOS:35和36的引物，以從推測的GFAT區(qū)域之外100bp開始進(jìn)行擴(kuò)增。PCR使用KOD-plus-DNA聚合酶進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?4°C2分鐘1個循環(huán)，94°C15秒、60°C30秒和68°C1分鐘30個循環(huán)。小球藻病毒Hirosaki株(CVHI1)和Kakunodate株(CVKA1)的基因組DNA被用作模板DNA。PCR擴(kuò)增的片段被克隆到pPCR-ScriptAmpSK(+)克隆載體(Stratagene)中。使用DNA測序儀測定插入片段的核苷酸序列，并鑒定來自CVHI1株和CVKA1株的新的GFAT基因，命名為"cvGFAT-HI基因"和"cvGFAT-KA基因"。cvGFAT-HI和cvGFAT-KA基因的核苷酸序列顯示在SEQIDNOS:5和7中。SEQIDNOS:5和7表示的cvGFAT-HI和cvGFAT-KA基因的開放閱讀框架被克隆到用于無細(xì)胞蛋白合成的載體中以表達(dá)蛋白。使用含有cvGFAT-HI基因作為模板以及SEQIDNOS:37和38表示的引物的pPCR-ScriptAmpSK(+)克隆載體，在上面描述過的條件下進(jìn)行PCR。使用含有cvGFAT-KA基因作為模板以及SEQIDNOS:37和39表示的引物的pPCR-ScriptAmpSK(+)克隆載體，在上面描述過的條件下進(jìn)行PCR。對于PCR來說，使用KOD-plus-DNA聚合酶，反應(yīng)周期為94°C2分鐘1個循環(huán)，94°C15秒、60°C30秒和68°C1分鐘30個循環(huán)。每個PCR擴(kuò)增片段用Xbal酶切，并克隆到pEU-NII載體的EcoRV和Xbal位點(diǎn)中。使用連接混合物，根據(jù)上述的已知方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5株，轉(zhuǎn)化體加到含有50g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化體的生長菌落中使用已知的方法提取質(zhì)粒。這樣就構(gòu)建了質(zhì)粒pEU-NII/cvGFAT-HI和pEU-麗/cvGFAT-KA。使用pEU-NII/cvGFAT-HI禾BpEU-NII/cvGFAT-KA以及PROTEIOS(注冊商標(biāo))，以與實(shí)施例3中相同的方式表達(dá)蛋白。表達(dá)的蛋白的SDS-PAGE分析證實(shí)了預(yù)期大小的條帶(大約65kDa)，表明了cvGFAT蛋白的表達(dá)(圖3)。蛋白表達(dá)溶液以與實(shí)施例3中相同的方式進(jìn)行GFAT反應(yīng)。圖4顯示了結(jié)果。在用作對照的pEU/DHFR中沒有檢測到葡萄糖胺-6-磷酸，而在pEU/cvGFAT-HI中觀察到了葡萄糖胺-6-磷酸的增加，這證實(shí)了在蛋白表達(dá)溶液中存在有活性的GFAT酶。實(shí)施例5將來自小球藻病毒的HAS基因克隆到pBI121中為了將來自小球藻病毒的透明質(zhì)酸合酶基因(cvHAS,SEQIDNO:l)克隆到植物轉(zhuǎn)化載體(在后文中也稱為"表達(dá)載體")pBI121中(Jefferson等，1987，EMBOJ，6，3901-3907)，制備了SEQIDNOS:40和41表示的引物。使用含有cvHAS的質(zhì)粒DNA作為模板、KOD-plus-DNA聚合酶進(jìn)行PCR，反應(yīng)程序?yàn)?4°C2分鐘1個循環(huán)，94°C15秒、45°C30秒和68。Cl分鐘3個循環(huán)，94°C15秒、55°C30秒和68°C1分鐘30個循環(huán)。純化PCR擴(kuò)增的片段，用BamHI和Dral酶切。隨后，如下將cvHAS插入到表達(dá)載體pBI121中將pBI121用限制性酶Sacl消化，用BluntingHigh(Toyobo)進(jìn)行平端，然后用BamHI消化；然后對限制性酶消化的cvHAS基因進(jìn)行克隆。使用連接混合物，根據(jù)上述的已知方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5株，轉(zhuǎn)化體加到含有50g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化體的生長菌落中使用已知的方法提取質(zhì)粒。這樣就制備了含有cvHAS的pBI121/cvHAS(在后文中有時稱為pBIHA)。實(shí)施例6將來自小球藻病毒的GFAT基因克隆到pBI121中使用SEQIDNOS:42和38表示的引物和含有cvGFAT-HI的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行PCR。對于PCR來說，使用KOD-plus-,反應(yīng)程序?yàn)?4°C2分鐘1個循環(huán)，94°C15秒、50°C30秒和68°C1分鐘2個循環(huán)，94°C15秒、60°C30秒和6S。Cl分鐘28個循環(huán)。PCR擴(kuò)增的片段用BamHI消化。隨后，如下將cvGFAT-HI插入到表達(dá)載體pBI121中將pBI121用Sacl消化，用BluntingHigh(Toyobo)進(jìn)行平端，用BamHI消化，然后對上述限制性酶消化的cvGFAT-HI基因進(jìn)行克隆。使用連接混合物，根據(jù)上述的已知方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5株，轉(zhuǎn)化體加到含有50g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化體的生長的菌落中使用已知的方法提取質(zhì)粒。這樣就制備了含有cvGFAT-HI的pBI121/cvGFAT-HI(在后文中有時稱為pBIGF)。實(shí)施例7將來自小球藻病毒的GFAT基因和HAS基因亞克隆到pBluescript中將pBIHA用限制性酶PvuII和Pstl依次消化，然后亞克隆到pBluescript的Pstl禾卩Smal位點(diǎn)中，從而獲得pBluescript/35S-cvHAS-NOS(在后文中有時稱為pBSHA)。將pBIGF用限制性酶PvuII禾BSphl依次消化。在用BluntingHigh(Toyobo)平末端之后，將pBIGF亞克隆到pBluescript的EcoRV位點(diǎn)中，從而獲得pBluescript/35S-cvGFAT-NOS(在后文中有時稱為pBSGF)。將pBSGF用限制性酶Kpnl禾卩Notl依次消化。在用BluntingHigh(Toyobo)平末端之后，將35S-cvGFAT-NOS亞克隆到前面依次用Spel消化、平末端、和脫磷酸化的pBSHA中，從而獲得pBluescript/cvHAS-cvGFAT(在后文中有時稱為pBSHG)。實(shí)施例8將來自小球藻病毒的GFAT基因和HAS基因克隆到pBI121中將pBSHG用限制性酶Kpnl和Notl依次消化，將cvHAS-cvGFAT的表達(dá)盒酶切并平末端。然后，如下將cvHAS-cvGFAT插入到表達(dá)載體pBI121中將pBI121用限制性酶Sacl和HindIII消化，用BluntingHigh平末端，然后對使用上面的限制性酶消化的cvHAS-cvGFAT基因進(jìn)行克隆。使用連接混合物，根據(jù)上述的已知方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5株，轉(zhuǎn)化體加到含有50g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化體的生長的菌落中使用已知的方法提取質(zhì)粒。這樣就制備了含有cvHAS-cvGFAT的pBI121/cvHAS-cvGFAT(在后文中有時稱為pBIHG)。實(shí)施例9、電穿孔勝任細(xì)胞的制備用土壤桿菌LBA4404(根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404株)的單菌落接種5mLLB培養(yǎng)基，在28°C進(jìn)行搖動培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)液接種到500mLLB培養(yǎng)基中，在28°C進(jìn)行搖動培養(yǎng)直到600nm的濁度變成0.5。通過離心(5000rpm，IO分鐘，4°C)收獲培養(yǎng)液；除去上清液；加入500mL無菌水懸浮和清洗細(xì)胞；再次進(jìn)行離心(5000rpm，IO分鐘，4°C)收獲細(xì)胞，并除去上清液。在進(jìn)行上述的步驟兩次后，將沉淀懸浮在20mL冷卻的10%甘油溶液中，離心(5000rpm，IO分鐘，4°C)收獲細(xì)胞，除去上清液。將沉淀懸浮在3mL冷卻的10%甘油溶液中，將40L的等份懸浮液放置在1.5mL離心管中，用液氮冷凍，儲存在-80°C。實(shí)施例10將pBIHG導(dǎo)入土壤桿菌LBA4404株將1L表達(dá)質(zhì)粒pBIHG(200g/ml)與40L根瘤土壤桿菌LBA4404的電穿孔勝任細(xì)胞(Invitrogen)混合，獲得的懸浮液倒入預(yù)先在冰上冷卻的電擊杯(cuvette)(電極間的距離1mm)，施加脈沖電場(1.8kV，25F，200)。然后馬上加入500LSOC，得到的混合物在28°C孵育3小時。然后將孵育的細(xì)胞加到含有卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)3天以獲得帶有pBIHG的土壤桿菌細(xì)胞。實(shí)施例11用含有pBIHG的根瘤土壤桿菌LBA4404株感染煙草使用土壤桿菌按照葉盤方法(YasuyukiYamada和YoshimiOkada主編的"PlantBiotechnologyII"《植物生物技術(shù)II》，TokyoKagakuDojin，1991)轉(zhuǎn)化煙草(NicotianatabacumSR-1)。煙草葉盤用預(yù)先在5mL含有50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于28°C培養(yǎng)過夜的、帶有pBIHG或pBIHA的土壤桿菌培養(yǎng)液浸泡3分鐘。然后將過量的細(xì)胞用濾紙移除。將葉盤放置在分化培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基是在MS(Murashige和Skoog)無機(jī)鹽(Murashige和Skoog,1962,Physiol.Plant.,15,473)中添加3%蔗糖、維生素B5、1mg/L芐氨基嘌呤、1mg/L萘乙酸和0.3%結(jié)冷膠，并將pH調(diào)整到5.7獲得的，然后在暗處于28。C下放置2天。用無菌水將感染的葉盤清洗3次，過量的水分用濾紙移除。然后將葉盤放置在含有卡那霉素(100mg/L)和頭孢噻肟(250mg/L)作為抗生素的分化培養(yǎng)基中，在16小時光照條件下在25。C誘導(dǎo)愈合組織的形成。在開始誘導(dǎo)3周后，選擇形態(tài)正常的新芽，切成含有莖和葉的形式，轉(zhuǎn)化到含有卡那霉素(100mg/L)和頭孢噻肟(250mg/L)的生根培養(yǎng)基中(MS無機(jī)鹽，3%蔗糖、維生素B5和0.3%結(jié)冷膠，pH5.7)，在16小時光照條件下在25。C誘導(dǎo)生根。2周后，生根的新芽被轉(zhuǎn)移到新鮮的生根培養(yǎng)基中，以獲得具有生長的莖和葉的株系。實(shí)施例12轉(zhuǎn)化的煙草產(chǎn)生的透明質(zhì)酸的定量將大約100mg如上所述用土壤桿菌感染獲得的轉(zhuǎn)化的煙草葉片轉(zhuǎn)移到2mL試管中，懸浮在200L緩沖液中(含有20mMpH7.5的Tris-HCl、0.2MNaCl、1mMEDTA禾卩10mM2-ME)，加入400mg不銹鋼珠(直徑4.8mm)。使用BeadSmash(Wakenyaku，BS-12)搖動和攪動試管(4,000rpm，2分鐘)粉碎煙草葉片。粉碎后的液體被離心(15,000rpm,IO分鐘)，上清液作為粗提液回收。將粗提液用水稀釋，用作測量樣品。透明質(zhì)酸的定量使用透明質(zhì)酸板"Chugai"(Fujirebio,Inc.)進(jìn)行。結(jié)果顯示在圖5中。其中導(dǎo)入了cvHAS-cvGFAT基因的轉(zhuǎn)化的煙草與導(dǎo)入了cvHAS基因的轉(zhuǎn)化煙草相比，具有顯著提高的透明質(zhì)酸產(chǎn)量。實(shí)施例13將小球藻病毒來源的UGD基因克隆到pBI121中使用SEQIDNO:43禾t]SEQIDNO:44表示的引物和含有cvUGD-HI的質(zhì)粒DNA作為模板，進(jìn)行PCR。對于PCR來說，使用KOD-plus-，反應(yīng)程序?yàn)?4°C2分鐘l個循環(huán)，94。C15秒、50。C30秒和68°C1分鐘2個循環(huán)，94°C15秒、60°C30秒和68°C1分鐘28個循環(huán)。PCR擴(kuò)增的片段用BamHI和Sacl消化。然后，如下將cvUGD-HI插入到表達(dá)載體pBI121中將pBI121用Sacl然后用BamHI消化，將用上述限制性酶消化的cvUGD-HI基因克隆到pBI121中。使用連接混合物，根據(jù)上述的已知方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5株，轉(zhuǎn)化體加到含有50g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化體的生長的菌落中使用已知的方法提取質(zhì)粒。這樣就制備了含有cvUGD-HI的pBIUG。實(shí)施例14將來自小球藻病毒的UGD基因亞克隆到pBluescript中將pBIUG用限制性酶EcoRI和HindIII消化，亞克隆到pBluescript的EcoRI和HindIII位點(diǎn)中以制備pBSUG。將pBSUG用Spel消化并用BluntingHigh平末端以破壞Spel位點(diǎn)。然后將pBSHA用Notl消化、平末端、用Kpnl消化以切除35S-cvHAS-NOS。將pBSUG用Xhol消化、平末端、并用KpnI消化；將已經(jīng)被切掉的35S-cvHAS-NOS連接以產(chǎn)生pBSHU。將pBSGF用Sail消化、平末端，并用Notl消化以切掉35S-cvGFAT-NOS。將pBHU用Spel消化、平末端，并用Notl消化，并將已經(jīng)切掉的35S-cvGFAT-NOS連接以產(chǎn)生pBSHUG。實(shí)施例15將來自小球藻病毒的UGD基因、GFAT基因和HAS基因克隆到pBI121中使用合成的DNA，產(chǎn)生了修飾的pBI121，其中SmaI位點(diǎn)被加入到pBI121的HindIII位點(diǎn)的下游，Kpnl位點(diǎn)被加入到EcoRI位點(diǎn)的上游。將pBSHUG用Notl消化、平末端，并用Kpnl消化；將HAS、UGD和GFAT的連鎖表達(dá)盒切下，并克隆到用Smal和Kpnl酶切的修飾的pBI121中。使用連接混合物，根據(jù)上述的已知方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5株，轉(zhuǎn)化體加到含有50g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化體的生長的菌落中使用已知的方法提取質(zhì)粒。這樣就制備了含有HAS、UGD和GFAT表達(dá)盒的pBIHUG。實(shí)施例16導(dǎo)入了pBIHUG的轉(zhuǎn)化的煙草的制備，以及透明質(zhì)酸的定量分析使用表達(dá)質(zhì)粒pBIHUG，按照在實(shí)施例10和11所示的步驟，將pBIHUG導(dǎo)入土壤桿菌LBA4404株，用含有pBIHUG的土壤桿菌LBA4404株感染煙草葉盤。結(jié)果獲得了20株煙草，其中HAS、UGD和GFAT基因的導(dǎo)入已經(jīng)被證實(shí)。按照在實(shí)施例12所示的步驟，制備了粗提液并對透明質(zhì)酸進(jìn)行定量。結(jié)果顯示在圖6中。其中導(dǎo)入了HAS、UGD和GFAT基因的轉(zhuǎn)化的煙草與其中導(dǎo)入了cvHAS基因的轉(zhuǎn)化的煙草和其中導(dǎo)入了cvHAS-cvGFAT基因的轉(zhuǎn)化的煙草相比，顯示出顯著增加的透明質(zhì)酸產(chǎn)量。實(shí)施例17轉(zhuǎn)化的煙草(T1代)產(chǎn)生的透明質(zhì)酸的定量從實(shí)施例12其中導(dǎo)入了cvHAS-cvGFAT基因的轉(zhuǎn)化的煙草收集種子，接種到含有卡那霉素(100mg/L)的MS分化培養(yǎng)基中。按照與實(shí)施例12中相同的方式從生長的轉(zhuǎn)化煙草(T1代)獲得了粗提液，對透明質(zhì)酸進(jìn)行了定量，證實(shí)了透明質(zhì)酸生產(chǎn)水平與TO代的水平相同。工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明，在植物中表達(dá)了透明質(zhì)酸合酶基因，具體來說，在植物中高產(chǎn)量生產(chǎn)透明質(zhì)酸。本發(fā)明提供了能夠比現(xiàn)有工藝更高產(chǎn)量地產(chǎn)生透明質(zhì)酸的植物或培養(yǎng)的植物細(xì)胞；生產(chǎn)植物或培養(yǎng)的植物細(xì)胞的方法；以及表達(dá)載體。因?yàn)榭梢缘统杀咎峁┰谥参镏猩a(chǎn)的安全的透明質(zhì)酸，預(yù)期本發(fā)明將對工業(yè)有極大的貢獻(xiàn)。權(quán)利要求1.生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，包括將具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有糖-核苷酸合酶活性的外源蛋白在植物細(xì)胞或植物中共表達(dá)，并且外源蛋白在植物細(xì)胞或植物中具有糖-核苷酸合酶活性。2.生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，包括下列步驟(1)使用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，該重組表達(dá)載體含有編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA，所述各DNA處于植物啟動子的控制之下；(2)令通過轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化體生長；以及(3)分離轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的透明質(zhì)酸。3.權(quán)利要求2中生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中的啟動子是器官特異性或組織特異性的啟動子。4.權(quán)利要求2或3中生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA是下面(a)或(b)的DNA:(a)具有SEQIDNO:1或3表示的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)的核苷酸序列互補(bǔ)雜交的DNA，并且該DNA編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白。5.權(quán)利要求1到3任何一個的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白是(a)或(b)的蛋白(a)具有SEQIDNO:2或4顯示的氨基酸序列的蛋白；或(b)具有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列的蛋白，并且該蛋白具有透明質(zhì)酸合酶活性。6.權(quán)利要求1到5任何一個的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中糖-核苷酸是尿苷-5'-二磷酸(UDP)-N-乙酰葡萄糖胺或UDP-葡萄糖醛酸。7.權(quán)利要求1到6任何一個的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是選自下列的至少一種蛋白谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙?；?、UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶。8.權(quán)利要求1到6任何一個的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是選自下列的至少一種蛋白UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙酰化酶、UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶，以及谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶。9.權(quán)利要求1到6任何一個的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶或UDP-葡萄糖脫氫酶。10.權(quán)利要求2到9任何一個的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是來自小球藻病毒和/或擬南芥的DNA。11.權(quán)利要求2到IO任何一個的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是下列(a)或(b)的DNA:(a)具有SEQIDNO:5、7或9顯示的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)的核苷酸序列互補(bǔ)雜交的DNA，并且所述DNA編碼具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。12.權(quán)利要求1到IO任何一個的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是下列(a)或(b)的蛋白(a)具有SEQIDNO:6、8或10顯示的氨基酸序列的蛋白；或(b)具有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列的蛋白，并且該蛋白具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性。13.權(quán)利要求2到IO任何一個的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是下列(a)或(b)的DNA:(a)具有SEQIDNO:11、13、17、19或21顯示的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)的核苷酸序列互補(bǔ)雜交的DNA，并且該DNA編碼具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白。14.權(quán)利要求1到IO任何一個的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是下列(a)或(b)的蛋白(a)具有SEQIDNO:12、14、16、18、20或22顯示的氨基酸序列的蛋白；或(b)具有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列的蛋白，并且該蛋白具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性。15.權(quán)利要求1到14任何一個的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中植物選自被子植物、裸子植物、蕨類植物和苔蘚植物。16.權(quán)利要求3的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中一種或多種器官選自根、莖、塊莖、葉、花器官、塊根、種子和芽尖。17.權(quán)利要求3的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其中一種或多種組織選自表皮、靭皮部、軟組織、木質(zhì)部和維管束。18.通過共表達(dá)具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有糖-核苷酸合酶活性的外源蛋白而具有產(chǎn)生透明質(zhì)酸能力的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，其后代，或其器官或組織。19.用含有編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，所述各DNA處于植物啟動子的控制之下；其具有同樣性質(zhì)的后代；或其器官或組織。20.權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中啟動子是器官特異性或組織特異性啟動子。21.權(quán)利要求19或20的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA是下面(a)或(b)的DNA:(a)具有SEQIDNO:1或3顯示的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與具有(a)的核苷酸序列的DNA互補(bǔ)雜交的DNA，并且該DNA編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白。22.權(quán)利要求18到20任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，其中具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白是下面(a)或(b)的蛋白(a)具有SEQIDNO:2或4顯示的氨基酸序列的蛋白；或(b)具有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列的蛋白，并且該蛋白具有透明質(zhì)酸合酶活性。23.權(quán)利要求18到22任何一個中轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中糖-核苷酸是UDP-N-乙酰葡萄糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸。24.權(quán)利要求18到23任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是選自下列的至少一種蛋白谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙?；?、UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶。25.權(quán)利要求18到23任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是選自下列的至少一種蛋白UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙?；?、UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶，以及谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶。26.權(quán)利要求18到23任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶和/或UDP-葡萄糖脫氫酶。27.權(quán)利要求19到26任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA來自小球藻病毒、擬南芥、或小球藻病毒和擬南芥。28.權(quán)利要求19到27任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是下列(a)或(b)的DNA:(a)具有SEQIDN0:5、7或9顯示的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)中的核苷酸序列互補(bǔ)雜交的DNA，并且該DNA編碼具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白；其具有同樣性質(zhì)的后代；或其器官或組織。29.權(quán)利要求18到27任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是下列(a)或(b)的蛋白(a)具有SEQIDNO:6、8或10顯示的氨基酸序列的蛋白；或(b)具有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列的蛋白，并且該蛋白具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性。30.權(quán)利要求19到27任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是下列(a)或(b)的DNA:(a)具有SEQIDNO:11、13、15、17、19或21顯示的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)的核苷酸序列互補(bǔ)雜交的DNA，并且該DNA編碼具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白。31.權(quán)利要求18到27任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是下列(a)或(b)的蛋白(a)具有SEQIDNO:12、14、16、18、20或22顯示的氨基酸序列的蛋白；或(b)具有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列的蛋白，并且所述蛋白具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性。32.權(quán)利要求18到31任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中植物是選自被子植物、裸子植物、蕨類植物和苔蘚植物的任何植物。33.權(quán)利要求18到31任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中器官是選自根、莖、塊莖、葉、花器官、塊根、種子和芽尖的一種或多種器官。34.權(quán)利要求18到31任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織，其中組織是選自表皮、靭皮部、軟組織、木質(zhì)部和維管束的一種或多種組織。35.從權(quán)利要求18到34任何一個的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物、其具有同樣性質(zhì)的后代、或其器官或組織獲得的植物提取物。36.權(quán)利要求35中的植物提取物，其中植物提取物含有透明質(zhì)酸。37.重組表達(dá)載體，含有編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA和編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA，所述各DNA處于植物啟動子的控制之下。38.權(quán)利要求37的重組表達(dá)載體，其中啟動子是器官特異性或組織特異性啟動子。39.權(quán)利要求37或38中的重組表達(dá)載體，其中編碼具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白的DNA是下面(a)或(b)中的DNA:(a)具有SEQIDNO:1或3中顯示的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)的核苷酸序列互補(bǔ)雜交的DNA，并且該DNA編碼具有透明質(zhì)酸活性的蛋白。40.權(quán)利要求37或38的重組表達(dá)載體，其中具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白是下面(a)或(b)的蛋白(a)具有SEQIDNO:2或4顯示的氨基酸序列的蛋白；或(b)具有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列的蛋白，并且該蛋白具有透明質(zhì)酸合酶活性。41.權(quán)利要求37到40任何一個的重組表達(dá)載體，其中糖-核苷酸是UDP-N-乙酰葡萄糖胺或UDP-葡萄糖醛酸。42.權(quán)利要求37到41任何一個的重組表達(dá)載體，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是選自下列的至少一種蛋白谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙?；?、UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶。43.權(quán)利要求37到41任何一個的重組表達(dá)載體，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是選自下列的至少一種蛋白UDP-N-乙酰葡萄糖胺二磷酸化酶、磷酸乙酰葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖胺-l-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸葡萄糖變位酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶、己糖激酶、N-乙酰葡萄糖胺乙酰化酶、UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、肌醇加氧酶、葡萄糖醛酸激酶和葡萄糖醛酸-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶，以及谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶。44.權(quán)利要求37到41任何一個的重組表達(dá)載體，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶或UDP-葡萄糖脫氫酶。45.權(quán)利要求37到41任何一個的重組表達(dá)載體，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是來自小球藻病毒、擬南芥、或小球藻病毒和擬南芥的DNA。46.權(quán)利要求37到44任何一個的重組表達(dá)載體，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是下列(a)或(b)的DNA:(a)具有SEQIDNO:5、7或9顯示的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)的核苷酸序列互補(bǔ)雜交的DNA，并且所述DNA編碼具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。47.權(quán)利要求37到44任何一個的重組表達(dá)載體，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是下列(a)或(b)的蛋白(a)具有SEQIDNO:6、8或10顯示的氨基酸序列的蛋白；或(b)具有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列的蛋白，并且該蛋白具有谷氨酰胺:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶活性。48.權(quán)利要求37到44任何一個的重組表達(dá)載體，其中編碼具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白的DNA是下列(a)或(b)的DNA:(a)具有SEQIDNO:11、13、15、17、19或21顯示的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)緊條件下與(a)的核苷酸序列互補(bǔ)雜交的DNA，并且所述DNA編碼具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性的蛋白。49.權(quán)利要求37到44任何一個的重組表達(dá)載體，其中具有糖-核苷酸合酶活性的蛋白是下列(a)或(b)的蛋白(a)具有SEQIDNO:12、14、16、18、20或22顯示的氨基酸序列的蛋白；或(b)具有一個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的(a)的氨基酸序列的蛋白，并且所述蛋白具有UDP-葡萄糖脫氫酶活性。50.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括使用權(quán)利要求37到49的任何一個載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，其中轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物具有產(chǎn)生透明質(zhì)酸的能力。51.含有透明質(zhì)酸作為活性劑的化妝品組合物，其中透明質(zhì)酸通過權(quán)利要求1到17任何一個的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法來獲得。全文摘要目的是通過改進(jìn)現(xiàn)有的在植物中生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，提供能夠以低成本和比以前更高的產(chǎn)量生產(chǎn)透明質(zhì)酸的植物或培養(yǎng)的植物細(xì)胞、制備它們的方法、用于轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體、使用植物或培養(yǎng)的植物細(xì)胞等生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法。提供了生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，包括將具有透明質(zhì)酸合酶活性的蛋白和具有糖-核苷酸合酶活性的外源蛋白在植物細(xì)胞或植物中共表達(dá)來獲得透明質(zhì)酸。文檔編號A01H1/00GK101248179SQ20068003109公開日2008年8月20日申請日期2006年8月10日優(yōu)先權(quán)日2005年8月25日發(fā)明者北澤宏明,曾我部敦,柴谷滋郎申請人:東洋紡織株式會社