專利名稱：：金鐘藤提取物在制備殺菌劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)藥領(lǐng)域，具體涉及金鐘藤提取物在制備殺菌劑中的應(yīng)用，同時涉及金鐘藤植物提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
：眾所周知，農(nóng)藥是植物病害防治的保障手段之一，即使在今天，雖然抗病基因的利用在分子生物學(xué)有關(guān)技術(shù)推動下得到了快速的發(fā)展，但是，化學(xué)農(nóng)藥仍然在植物病害防治中起著不可代替作用。1934年殺菌劑福美雙(Thiram)的問世，揭開了有機(jī)合成殺菌劑的時代。從此，植物病害的防治更為高效，化學(xué)合成的殺菌劑在植物病害防治中作出了積極的貢獻(xiàn)。但是，自上世紀(jì)60年代以來，公眾對農(nóng)藥毒性和農(nóng)藥對環(huán)境的污染問題越來越重視。一些毒性高、殘留長的殺菌劑品種，如有機(jī)汞制劑和敵菌丹(captafol)等相繼被禁用。到了上世紀(jì)90年代，人們對食品安全和環(huán)境保護(hù)的要求越來越高。1996年，美國通過的環(huán)保法案，將4種重要的保護(hù)性殺菌劑代森錳(maneb)、代森錳鋅(mancozeb)、百菌清(chlorothalonil)和克菌丹(captan)列為B2致癌物質(zhì)而禁止在美國使用。隨后，歐盟也作出了相應(yīng)的禁用限制?，F(xiàn)在，特別是在我國加入了WTO后，農(nóng)藥殘留問題，已經(jīng)成為限制我國農(nóng)產(chǎn)品出口的國際貿(mào)易壁壘；有些發(fā)達(dá)國家甚至明確禁止從我國進(jìn)口曾經(jīng)使用過某種有機(jī)合成化學(xué)農(nóng)藥品種的農(nóng)產(chǎn)品。所以，面對日益擴(kuò)大的經(jīng)濟(jì)全球化的影響，尋求高效、安全和對環(huán)境友好的農(nóng)藥(包括殺菌劑)是我國廣大農(nóng)藥科學(xué)工作者的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。自從1960年代末內(nèi)吸劑商品化以來，殺菌劑抗藥性的問題已經(jīng)成為生產(chǎn)上的嚴(yán)重問題，一些重要的殺菌劑品種，比如多菌靈(carbendazim)和甲霜靈(metalaxyl)等都是在使用1-2年后就在生產(chǎn)上出現(xiàn)嚴(yán)重的抗藥性問題。根據(jù)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位的有關(guān)研究報(bào)道，多菌靈等多種殺菌劑在我國已經(jīng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的抗藥性問題。對于殺菌劑抗藥性的治理，主要的措施包括(1)與傳統(tǒng)的保護(hù)劑混合使用或者交替使用；(2)使用作用機(jī)理不同的殺菌劑。由于上面提到的問題，目前最重要的傳統(tǒng)保護(hù)劑均被歐美等發(fā)達(dá)國家禁用。因此，使用不同作用機(jī)理的殺菌劑就成為解決殺菌劑抗藥性問題的主要措施之一。但是，目前在世界上，可以獲得的作用機(jī)理不同的殺菌劑品種還比較少。因此，發(fā)現(xiàn)新的具有不同作用機(jī)理的殺菌劑是殺菌劑科學(xué)工作者的另一個機(jī)遇和挑戰(zhàn)。植物性或者植物源的化合物自古以來就被廣泛的應(yīng)用在人類的醫(yī)藥和農(nóng)藥上。在發(fā)展中國家，植物是藥品的主要來源，世界上有80％的人口主要依賴于植物和植物提取成分來維護(hù)生命和健康，即使在美國，也有120種以上重要的處方藥來源于植物，大約占美國藥物總用量的25％。最重要的三大類殺蟲劑擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類以及近幾年迅速發(fā)展起來的新煙堿類，其合成先導(dǎo)化合物都來自高等植物；而且，魚藤酮、異羊角扭甙和印楝素等許多新的植物性殺蟲劑都已經(jīng)商品化。1998年，孟昭禮等從銀杏中分離出對植物病原菌有很高活性的化合物，已開發(fā)出“綠帝”農(nóng)用殺菌劑系列產(chǎn)品。由于植物性農(nóng)藥來自天然，具有容易生物降解，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。目前，從植物中尋找抗菌化合物并開發(fā)出植物性殺菌劑正越來越受到世界各國的重視。金鐘藤(Merremiaboisiana(Gagnep.)vanOoststr.)，是旋花科(Convolvulaceae)，茉欒藤屬(魚黃草屬)(MerremiaDennst.ExEndl.)植物，中文名亦稱多花山豬菜或假白薯。金鐘藤分布于印度尼西亞的加里曼丹，馬來西亞的沙老越，越南北部(原東京，沙巴，先安)和老撾北部等地；我國分布于海南、廣西、云南和廣東。金鐘藤為多年生，陰性，喜陰的木質(zhì)藤本植物。近年來，金鐘藤在廣東廣州市呈現(xiàn)突發(fā)性大面積危害，是林業(yè)有害植物，是生態(tài)有害種。金鐘藤的繁殖力強(qiáng)，生長速度快，多分枝，攀纏林木，覆蓋樹冠，造成林木連片枯死，對森林生態(tài)破壞極大。1994年首次報(bào)道在廣東廣州市郊的林場危害林木，近年危害日益嚴(yán)重。至2004年底，在廣州市天河區(qū)太和嶂山上300公頃山林受害。因而，廣州及其附近地區(qū)正逐漸成為金鐘藤新崛起的一個分布中心。對于金鐘藤的危害，防治極為困難。人工防除和使用除草劑的方法效果均不理想砍斷的藤莖只要與地面接觸，很快生長出不定根和萌芽條；使用森草凈和滅藤威等多種除莠劑進(jìn)行噴霧，僅能殺傷部分幼嫩的莖葉，對其它根莖均無明顯作用。因此，如何對金鐘藤進(jìn)行綜合利用來控制金鐘藤爆發(fā)蔓延，尋找防治解決金鐘藤的危害的有效的新方法，從而變害為利，是目前林業(yè)生產(chǎn)上亟待研究解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供金鐘藤提取物在制備殺菌劑中的應(yīng)用，同時提供金鐘藤提取物的制備方法。(二)技術(shù)方案本發(fā)明申請人通過對金鐘藤提取物抑制多種植物病原菌的抑菌作用和抑菌作用機(jī)理的深入研究，發(fā)現(xiàn)其提取物不僅對多種植物病原菌都有很高和很廣譜的離體抑菌活性，而且對多種重要的植物病害具有很好的活體保護(hù)作用；并且，金鐘藤植物提取物對植物病原菌的作用機(jī)理與現(xiàn)有的一些重要的殺菌劑品種(如甲霜靈、烯酰嗎啉、嘧菌酯等)的作用機(jī)理不同，有助于治理生產(chǎn)實(shí)際上殺菌劑嚴(yán)重的抗藥性問題。在上述研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了金鐘藤提取物在制備殺菌劑中的應(yīng)用。其中金鐘藤提取物是金鐘藤植物的根、莖和/或葉片的提取物。所用提取溶劑是水或中等極性至大極性有機(jī)溶劑如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇等。所述金鐘藤提取物是通過溶劑提取法、水蒸汽蒸餾法、或者升華法制備的。其中溶劑提取法包括室溫下浸漬泡提取、滲漉法提取、煎煮法提??；還可以采用一些新的提取方法，如超臨界流體萃取提取、微波提取、超聲波提取、酶法提取、半仿生提取、破碎提取、或空氣爆破提取等方法。本發(fā)明所述的應(yīng)用可以將金鐘藤提取物制備成水劑(aqueoussolutions)、可溶性粉劑(solublepowders)、可濕性粉劑(wettablepowders)、濃懸浮劑(suspensionsconcentrates)和粒劑(granules)。以上各種劑型的制備方法為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，各劑型制備過程中所用助劑均為農(nóng)藥領(lǐng)域中的常用助劑。各劑型在使用時所配制的溶液中金鐘藤提取物的濃度為1μg/ml-1000mg/ml。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明金鐘藤提取物對多種植物病原菌如低等真菌、高等真菌以及細(xì)菌都有很強(qiáng)的離體抗菌活性，表現(xiàn)出較廣的殺菌譜；金鐘藤甲醇提取物在加入少量助劑(如吐溫20等)制成水劑后，對黃瓜霜霉病具有很好的活體防病作用，防病效果與商品農(nóng)藥甲霜靈錳鋅相當(dāng)，且對植物無藥害。金鐘藤正丁醇提取物在加入少量助劑(如吐溫20等)制成水劑后，對水稻紋枯病具有很好的防病作用，其效果與商品農(nóng)藥嘧菌酯(azoxystrobin，先正達(dá)公司的商品為25％阿米西達(dá)懸浮劑)、多菌靈的防治效果相當(dāng)，而且對植物無藥害。金鐘藤的乙酸乙酯提取物的抑菌作用方式和機(jī)理導(dǎo)致黃瓜疫霉病菌絲畸形分枝增多、粗短和膨大；對荔枝霜疫霉病菌具有殺菌作用，表現(xiàn)為抑制孢子的萌發(fā)，而且抑制休止孢子萌發(fā)的有效作用濃度低至50μg/ml；特別地，能夠使游動孢子爆裂。金鐘藤中抑菌活性成分還可以進(jìn)一步采用植物化學(xué)的方法進(jìn)行分離和鑒定，以發(fā)現(xiàn)新的具有殺菌和抗菌活性的化合物，并且可以在此基礎(chǔ)上，以該化合物結(jié)構(gòu)為模板，進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)改造，研究其構(gòu)效關(guān)系，以便得到更高活性的化合物，并將其開發(fā)成新的殺菌劑品種。(三)有益效果本發(fā)明的以金鐘藤提取物為有效成分的新的廣譜高效殺菌劑具有如下特點(diǎn)(1)提取方法簡單；(2)有效成分是天然抗菌化合物，無毒、無副作用，不污染環(huán)境；(3)具有廣譜活性，殺菌活性高，使用量低，防病效果顯著；(4)殺菌作用機(jī)理獨(dú)特，有助于治理生產(chǎn)實(shí)際上殺菌劑嚴(yán)重的抗藥性問題；(5)原料來源廣，而且變害為利。具體實(shí)施例方式通過下面給出的本發(fā)明的具體實(shí)施例可以進(jìn)一步清楚地理解本發(fā)明，但下述實(shí)施例不是對本發(fā)明的限定。實(shí)施例1將金鐘藤植物按照老藤(含皮層)和綠色的嫩藤(含葉片)分別采集，陰干(或在攝氏50度下烘干)，機(jī)械粉碎，過篩40-60目。粉碎物在室溫條件下，用5倍量的有機(jī)溶劑甲醇冷浸提取3次，浸泡時間分別是3天、2天、和1天，依次過濾收集濾液，合并3次濾液，在攝氏溫度低于55度下減壓濃縮，除去甲醇，即可得到金鐘藤甲醇粗提取物干物質(zhì)，冷藏保存、備用。實(shí)施例2將試驗(yàn)實(shí)施例1所獲得的金鐘藤老藤(含皮層)的甲醇粗提取物用5倍量的80％乙醇溶解，所得溶液置分液漏斗中，在室溫條件下，加入同體積的有機(jī)溶劑石油醚進(jìn)行萃取，先放出下層的乙醇溶液，再放出上層的石油醚溶液。將石油醚溶液在攝氏溫度低于55度下減壓濃縮，回收石油醚后，再次將同體積的石油醚加入到乙醇溶液中進(jìn)行萃取，和石油醚的濃縮回收，直到石油醚萃取液的顏色變成無色透明為止。石油醚溶液經(jīng)濃縮后即獲得石油醚提取物，冷藏保存、備用。剩下的乙醇溶液先在攝氏55度的溫度下，減壓濃縮，蒸去所含有的乙醇后加入水補(bǔ)充至原來的體積。將水溶液置分液漏斗內(nèi)，加入同體積的有機(jī)溶劑氯仿進(jìn)行萃取。濃縮回收氯仿然后再次萃取，具體方法和條件同上，直到氯仿萃取液的顏色變成無色透明為止。氯仿萃取液在減壓濃縮除去氯仿后，即獲得金鐘藤的氯仿提取物。根據(jù)上述方法和條件，依次用同體積的有機(jī)溶劑乙酸乙酯和正丁醇分別進(jìn)行萃取，濃縮回收和再萃取。就可以分別獲得金鐘藤的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。最后剩下的水溶液，自然風(fēng)干，或者在攝氏55度的溫度下烘干，即可獲得金鐘藤水提取物。實(shí)施例3稱取實(shí)施例1的金鐘藤甲醇粗提取物1克，加水溶解并定容至100毫升，并加入100μl吐溫20，即可制備成1％金鐘藤甲醇粗提取物水劑。同理，稱取實(shí)施例2的金鐘藤正丁醇提取物1克，加水溶解并定容至100毫升，并加入100μl吐溫20，即可制備成1％金鐘藤正丁醇提取物水劑。實(shí)施例4金鐘藤植物不同部位的甲醇粗提取物對植物病原真菌菌絲生長的抑菌活性1.供試病原菌水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、荔枝霜疫霉病菌(Peronophthoralitchii)、絲核菌(Rhizoctoniasolani)、黃瓜疫霉菌(Phytophthoramelonis)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.sp.vineum)、煙葉點(diǎn)霉菌(Phyllostictanicotinanae)、菠蘿黑腐病菌(Ceratocystisfimbriata)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、腐霉菌(Pythiumspp.)、柑桔擬莖點(diǎn)霉菌(Phomopsiscitri)、羅氏白絹病菌(Sclerotiumrolfsii)。2.試驗(yàn)方法采用含毒介質(zhì)的生長速率法測定金鐘藤植物甲醇粗提取物對植物病原菌菌絲生長的抑制作用。具體方法見參考文獻(xiàn)(黃桂榮，李有志，徐大高，潘汝謙，徐漢虹。9種湘西植物甲醇提取物抗真菌活性[J]。仲凱農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，18(4)49-52)。簡述為將金鐘藤甲醇粗提取物干物質(zhì)用滅菌蒸餾水溶解后，配制成一定濃度的母液，然后取1ml母液加入到9ml熔融的、冷卻至約50℃左右的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中，充分搖勻，迅速倒入直徑為6cm的培養(yǎng)皿中，靜置待凝結(jié)，制成含甲醇粗提取物干物質(zhì)濃度為10mg/ml的PDA含毒培養(yǎng)平板。設(shè)加無菌蒸餾水為對照。供試病菌均預(yù)先在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用孔徑為0.5cm的打孔器在菌落邊緣切取生長一致的菌塊作為接種體。將接種體移入PDA含毒培養(yǎng)平板中央。置25℃恒溫培養(yǎng)。用十字交叉法測量菌落直徑，并校正，計(jì)算抑菌百分率。抑菌率(％)＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑)×1003.試驗(yàn)結(jié)果金鐘藤不同部位甲醇粗提取物對植物病原菌菌絲生長的抑制作用測試結(jié)果見表1。表1金鐘藤不同部位的甲醇粗提取物對植物病原菌菌絲生長的抑制作用**注測定濃度為10mg/ml；菌落直徑是3次重復(fù)的平均值±S.E.從表1可見，在含有金鐘藤甲醇粗提取物干物質(zhì)10mg/ml的測定濃度下，金鐘藤不同部位的甲醇粗提取物對供試的多種植物病原菌的菌絲生長都表現(xiàn)出抑菌活性。比較而言，老藤(含皮層)部位的甲醇粗提取物的抑菌活性高于嫩藤(含葉片)的抑菌活性。在供試的植物病原菌中，金鐘藤老藤(含皮層)的甲醇粗提取物對荔枝霜疫霉菌和黃瓜疫霉菌的抑菌率均是100％、對水稻稻瘟病菌的抑菌率也達(dá)98.48％、對柑桔擬莖點(diǎn)霉的抑制率為72.34％、對絲核菌和羅氏白絹病菌的抑菌活性分別是65.40％和63.16％、對煙葉點(diǎn)霉菌、香蕉炭疽病菌和番茄早疫病菌的抑制率分別是58.49％、55.88％和52.38％、對腐霉菌、菠蘿黑腐病菌和西瓜枯萎病菌的抑菌活性分別為45.90％、36.67％和33.68％。金鐘藤嫩藤(含葉片)甲醇粗提取物表現(xiàn)最高抑菌活性的是對黃瓜疫霉病菌，抑菌率為83.33％，其次為對荔枝霜疫霉病菌，抑菌率為62.27％，對其它供試病原菌的抑菌率均小于60％。實(shí)施例5金鐘藤植物不同部位的甲醇粗提取物對植物病原真菌、食品霉菌和植物病原細(xì)菌的抑菌活性1.供試病原菌植物病原真菌番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、柑桔青霉菌(Penicilliumitalicum)。食品霉菌黑曲霉(Aspergillusniger)植物病原細(xì)菌水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)、番茄青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)2.試驗(yàn)方法采用抑菌圈法測定金鐘藤植物不同部位甲醇粗提取物對植物病原真菌(番茄灰霉菌和柑桔青霉菌)、食品霉菌(黑曲霉)和植物病原細(xì)菌(水稻白葉枯病菌和番茄青枯病菌)的抑菌活性。番茄灰霉病菌、柑桔青霉菌和黑曲霉都是用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，水稻白葉枯病菌和番茄青枯病菌則用細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)。用滅菌蒸餾水洗下真菌孢子和細(xì)菌菌苔，分別配制成一定濃度的孢子懸浮液和細(xì)菌懸浮液。取200μl懸浮液滴加到中PDA培養(yǎng)基平板或者細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，用滅菌的曲玻璃棒將懸浮液均勻的涂布于平板上。金鐘藤甲醇粗提取物干物質(zhì)用滅菌蒸餾水溶解，配制成濃度為含金鐘藤甲醇粗提取物干物質(zhì)100mg/ml的藥液，取直徑為0.5cm的濾紙片蘸上藥液，室溫下將含藥液的濾紙片晾干，然后，將含有藥液的濾紙片放置到涂布有病原菌的培養(yǎng)平板上，置27度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。出現(xiàn)抑菌圈的表示藥液對供試的病原菌有抑菌活性；量取抑菌圈的大小，并以抑菌圈的大小來表示抑菌活性的強(qiáng)弱。3.試驗(yàn)結(jié)果金鐘藤不同部位甲醇粗提取物對植物病原真菌、食品霉菌和植物病原細(xì)菌的抑菌活性見表2。表2金鐘藤不同部位的甲醇粗提取物對植物病原菌的抑制作用**注測定濃度為100mg/ml；抑菌圈直徑是3次重復(fù)的平均值±S.E.；“+++”表示抑菌活性較強(qiáng)、“++”表示抑菌活性強(qiáng)、“+”表示有抑菌活性、“-”表示無抑菌活性從表2可見，金鐘藤不同部位的甲醇粗提取物對番茄灰霉病菌和柑桔青霉病菌都有較強(qiáng)的活性；對黑曲霉則僅有嫩藤表現(xiàn)出較弱的抑菌活性；對兩種植物病原細(xì)菌也表現(xiàn)出抑菌活性。從表1和表2可見，金鐘藤植物提取物的抗菌活性譜相當(dāng)廣譜。實(shí)施例6金鐘藤植物不同部位的甲醇粗提取物水劑對黃瓜霜霉病的防治效果測定1.供試病原菌黃瓜霜霉病菌(Pseudoperonosporacubensis)2.試驗(yàn)方法采用葉碟法測定金鐘藤植物甲醇粗提取物水劑對黃瓜霜霉病菌引起的黃瓜霜霉病病害的防治效果。供試的黃瓜品種是長春密刺。取完全張開的黃瓜葉片，用1.5cm的打孔器打出葉碟。接種用黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液的準(zhǔn)備方法參考潘汝謙的方法(潘汝謙，古希昕。黃瓜不同品種對霜霉病的抗性研究[J]。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，14(2)61-67)，孢子囊懸浮液的濃度為105個孢子囊/ml。金鐘藤甲醇粗提取物用滅菌蒸餾水溶解，加入助劑吐溫20(0.1％)配制成濃度為含金鐘藤甲醇粗提取物干物質(zhì)10mg/ml的水劑藥液。加5ml水劑藥液于9cm的培養(yǎng)皿中，然后放入10片葉碟，每片葉碟上滴加1滴10μl的孢子囊懸浮液。置24度下黑暗培養(yǎng)24小時，然后在16小時光照下培養(yǎng)6～8天后檢查發(fā)病情況，用葉面積測量儀測定病斑面積。計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。設(shè)商品農(nóng)藥58％甲霜靈錳鋅可濕性粉劑1000倍液，即含有效成分濃度為580μga.i./ml和清水處理為對照。病情的分級標(biāo)準(zhǔn)如下0級無病斑；1級病斑面積占整張葉碟的面積小于5％；3級病斑面積占整張葉碟的面積介于6-25％之間；5級病斑面積占整張葉碟的面積介于26-50％之間；7級病斑面積占整張葉碟的面積大于51％以上3.試驗(yàn)結(jié)果金鐘藤植物不同部位甲醇粗提取物水劑對黃瓜霜霉病的防治效果見表3。表3金鐘藤不同部位甲醇粗提取物水劑對黃瓜霜霉病的防治效果注金鐘藤提取物水劑的處理濃度是含甲醇粗提取物干物質(zhì)10mg/ml由表3可見，金鐘藤老藤(含皮層)和嫩藤(含葉片)的甲醇粗提取物水劑對黃瓜霜霉病都有防治效果，在10mg/ml濃度下的防治效果分別是80.28％和60.93％。金鐘藤老藤甲醇粗提取物水劑對黃瓜霜霉病的防治效果與商品農(nóng)藥甲霜靈錳鋅的藥效相當(dāng)。此外，金鐘藤老藤和嫩藤的甲醇粗提取物水劑都沒有對黃瓜葉片有藥害，處理的葉片保持青綠。結(jié)果表明，金鐘藤甲醇提取物水劑對植物安全。從表1、表2和表3可見，除了在離體下有廣譜的抑菌活性外，金鐘藤植物提取物還具有較好的活體防病效果。實(shí)施例7金鐘藤植物不同有機(jī)溶劑提取物的抑菌活性1.供試病原菌水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、荔枝霜疫霉病菌(Peronophthoralitchii)、絲核菌(Rhizoctoniasolani)、黃瓜疫霉菌(Phytophthoramelonis)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)。2.試驗(yàn)方法采用含毒介質(zhì)的生長速率法測定金鐘藤植物提取物對病原菌菌絲生長的抑制作用。試驗(yàn)方法與實(shí)施例4所述的方法相同。石油醚提取物、氯仿提取物和乙酸乙酯提取物先用少量的丙酮(1％v/v)溶解然后用水稀釋至所需濃度，正丁醇提取物可以直接用水溶解和稀釋。最終測定濃度除乙酸乙酯提取物為5mg/ml外，其它提取物均為10mg/ml。3.試驗(yàn)結(jié)果金鐘藤不同有機(jī)溶液提取物對植物病原菌菌絲生長的抑制作用測試結(jié)果見表4。從表4可見，金鐘藤不同有機(jī)溶劑提取物對病原菌的抑制作用不同。表明抑菌活性物質(zhì)的分布不同。在10mg/ml濃度下，石油醚提取物僅對香蕉炭疽病菌有一點(diǎn)點(diǎn)抑制作用，對水稻稻瘟病菌、荔枝霜疫霉病菌、黃瓜疫霉菌和絲核菌都沒有抑菌作用，反而促進(jìn)病原菌的生長，并且促進(jìn)產(chǎn)孢(特別是對水稻稻瘟病菌和香蕉炭疽病菌，數(shù)據(jù)未列出)；氯仿提取物的活性提高了，對兩種供試的低等真菌，荔枝霜疫霉菌和黃瓜疫霉菌都有較高的活性，抑菌率分別是85.76％和100％；乙酸乙酯提取物的抑菌活性最高，在5mg/ml濃度下，對水稻稻瘟病菌、荔枝霜疫霉菌和黃瓜疫霉菌的抑菌率都是100％；正丁醇提取物則對絲核菌的抑菌率為100％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甲醇粗提取物的抑菌活性，同時正丁醇提取物對兩種低等真菌都表現(xiàn)出較高的活性；水提取物也有一定的抑菌活性，對黃瓜疫霉病菌和荔枝霜疫霉病菌的抑菌活性分別為60.40％和54.33％。表4金鐘藤不同有機(jī)溶劑提取物對植物病原菌菌絲生長的抑制作用(測定濃度為10mg/ml)*乙酸乙酯提取物的測定濃度為5mg/ml。實(shí)施例8金鐘藤植物乙酸乙酯提取物對黃瓜疫霉病菌抑菌作用機(jī)理觀察1.供試病原菌黃瓜疫霉菌(Phytophthoramelonis)2.試驗(yàn)方法將金鐘藤植物乙酸乙酯提取物制成500μg/ml的含毒平板(因?yàn)樵?000μg/ml下完全抑制菌絲生長)，在含毒平板上培養(yǎng)黃瓜疫霉病菌，同時做對照實(shí)驗(yàn)挑取菌絲，在光學(xué)顯微鏡下觀測菌絲的形態(tài)。3.試驗(yàn)結(jié)果在金鐘藤植物乙酸乙酯提取物的含毒平板上的黃瓜疫霉病菌的菌落比較稀疏，菌落異常。在光學(xué)顯微鏡下，明顯可見菌絲的形態(tài)畸形表現(xiàn)為分枝增多，菌絲粗短，分枝末端膨大等。實(shí)施例9金鐘藤植物正丁醇提取物水劑對水稻紋枯病菌的活體防治效果測定1.供試病原菌水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)融合群GA-12.試驗(yàn)方法采用改良的高坂氏離體葉片法測定金鐘藤植物正丁醇提取物水劑對水稻紋枯病菌的活體防治效果。用扁豆葉片作為離體葉片，因?yàn)楸舛谷~片感病，而且葉片面積較大。將金鐘藤正丁醇提取物用滅菌水溶解，并加入0.1％的助劑吐溫20，配制成含正丁醇提取物干物質(zhì)為1000μg/ml濃度的水劑藥液，然后涂布在離體扁豆葉片上。自然晾干后，在葉片中央接種一塊水稻紋枯病菌菌塊(0.5cm直徑)，每處理共接種10張葉片，設(shè)商品農(nóng)藥50％多菌靈可濕性粉劑(1000μg/ml)和25％阿米西達(dá)懸浮液(250μg/ml)和清水處理為對照。各處理在25度保濕培養(yǎng)4天，檢查病斑面積的大小，計(jì)算防治效果。3.試驗(yàn)結(jié)果金鐘藤植物正丁醇提取物水劑對水稻紋枯病菌的活體防治效果結(jié)果見表5。表5金鐘藤植物正丁醇提取物水劑對水稻紋枯病的活體防治效果由表5可見，加入一定的助劑后，金鐘藤正丁醇提取物在1000μg/ml濃度下，對水稻紋枯病菌的抑菌作用很強(qiáng)，能夠有效的保護(hù)紋枯病菌對扁豆葉片的致病作用，防治效果達(dá)到88.32％，效果略優(yōu)于商品農(nóng)藥嘧菌酯(25％阿米西達(dá)懸浮液是先正達(dá)公司的商品名)，而與同樣濃度的多菌靈的防效相當(dāng)。沒有觀察到任何不良的藥害現(xiàn)象。結(jié)果表明，金鐘藤正丁醇提取物水劑對植物安全。實(shí)施例10金鐘藤乙酸乙酯提取物對荔枝霜疫霉菌的作用方式和機(jī)理1.供試病原菌荔枝霜疫霉病菌(Peronophthoralitchii)2.試驗(yàn)方法2.1對荔枝霜疫霉菌孢子囊萌發(fā)的影響采用孢子萌發(fā)法測定金鐘藤乙酸乙酯提取物對荔枝霜疫霉菌孢子囊萌發(fā)的影響。提取物先用少量丙酮(1％v/v)溶解，然后用無菌水稀釋，配制成系列濃度的藥液。為了避免溶液中的少量雜質(zhì)干擾觀測，可以先用濾紙對溶液進(jìn)行過濾以除去雜質(zhì)。將藥液滴加到荔枝霜疫霉病菌孢子囊懸浮液中，吸取50μl含有藥液的孢子囊懸浮液于凹玻片上，置攝氏24度保濕培養(yǎng)6小時，然后在顯微鏡下檢查孢子囊的萌發(fā)情況，測定藥液的最低抑制濃度(MIC)。孢子囊間接萌發(fā)(孢子囊變空)和直接萌發(fā)(孢子囊產(chǎn)生芽管)均計(jì)為萌發(fā)。分別設(shè)1％丙酮和滅菌水為對照。2.2對游動孢子游動性以及對游動孢子的影響將金鐘藤乙酸乙酯提取物按上述方法稀釋成系列濃度藥液，并將藥液滴加入游動孢子懸浮液中，在顯微鏡下觀測不同濃度藥液對游動孢子的游動性以及對游動孢子的影響。2.3對休止孢子萌發(fā)的影響采用孢子萌發(fā)法測定金鐘藤乙酸乙酯提取物對荔枝霜疫霉菌休止孢子萌發(fā)的影響。處理方法同上。在顯微鏡下隨機(jī)檢查100個休止孢子，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，并校正，計(jì)算抑制萌發(fā)率。3.試驗(yàn)結(jié)果3.1對孢子囊萌發(fā)的影響金鐘藤乙酸乙酯提取物對荔枝霜疫霉病菌的孢子囊的萌發(fā)有強(qiáng)烈的抑制作用。藥液的最低抑制濃度為500μg/ml，在該濃度下，抑制萌發(fā)率達(dá)到100％。3.2對游動孢子的游動性以及對游動孢子的作用金鐘藤乙酸乙酯提取物在500μg/ml濃度下，可以立即使游動孢子停止游動；在250μg/ml濃度下，在10分鐘內(nèi)大多數(shù)游動孢子停止游動。在50μg/ml濃度下，游動孢子的游動基本不受影響，游動孢子能夠正常游動。我們觀察到一個非常特別的現(xiàn)象在250μg/ml濃度下，游動孢子在停止游動后，在30分鐘內(nèi)大多數(shù)游動孢子爆開破裂，被完全溶解。3.3對休止孢子萌發(fā)的作用在500μg/ml濃度下，98％的休止孢子的萌發(fā)被抑制；在50μg/ml濃度下，有73％的休止孢子的萌發(fā)被抑制。表現(xiàn)出很強(qiáng)的殺菌活性。本發(fā)明申請人比較了現(xiàn)有的一些新的殺菌劑，比如1990年商品化的烯酰嗎啉(dimethomorph)和1996年開始商品化的呼吸鏈復(fù)合體III抑制劑(又稱strobilurins類殺菌劑)的嘧菌酯對荔枝霜疫霉病菌生活史的不同階段的作用方式，前者對休止孢子的萌發(fā)有強(qiáng)烈的抑制作用，但是對游動孢子的游動性沒有影響；后者則對游動孢子的游動性以及休止孢子的萌發(fā)都有強(qiáng)烈的作用。實(shí)驗(yàn)證明金鐘藤乙酸乙酯提取物的作用方式兼有以上兩種殺菌劑的一些特點(diǎn)，對病原菌的各個生長階段都有很強(qiáng)的活性；并且有獨(dú)特的方式能夠使游動孢子爆裂。這是一個非常獨(dú)特的作用機(jī)理，值得進(jìn)一步研究。權(quán)利要求1.金鐘藤提取物在制備殺菌劑中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述金鐘藤提取物是金鐘藤植物的根、莖和/或葉片的提取物。3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述金鐘藤提取物是氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇或水的提取物。4.如權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述金鐘藤提取物是通過溶劑提取法、水蒸汽蒸餾法、或者升華法制備的，其中溶劑提取法包括室溫下浸漬泡提取、滲漉法提取、煎煮法提取。5.如權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述金鐘藤提取物是通過超臨界流體萃取提取法、微波提取法、超聲波提取法、酶法提取法、半仿生提取法、破碎提取法、或空氣爆破提取法制備的。全文摘要本發(fā)明提供了金鐘藤提取物在制備殺菌劑中的應(yīng)用，金鐘藤提取物具有廣譜、高效的抑菌活性對植物病原真菌、食品霉菌和植物病原細(xì)菌均表現(xiàn)抑菌作用；對重要的植物病害水稻紋枯病和黃瓜霜霉病有很高的防治效果。由于該提取物是天然物質(zhì)，對農(nóng)作物安全，易于生物降解，無殘留、無污染。同時，其對植物病原菌的作用機(jī)理不同于多種常用的殺菌劑，有助于治理生產(chǎn)實(shí)際上殺菌劑嚴(yán)重的抗藥性問題。因此，本發(fā)明不僅僅為生產(chǎn)上提供了一種優(yōu)良的新殺菌劑，而且開辟了一條控制治理森林生態(tài)有害植物金鐘藤爆發(fā)蔓延的新途徑。文檔編號A01P3/00GK1810124SQ20061001134公開日2006年8月2日申請日期2006年2月22日優(yōu)先權(quán)日2006年2月22日發(fā)明者潘汝謙,徐漢虹,黃桂榮,張慧,徐大高申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)