專利名稱：埃氏巨球形菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
導(dǎo)言本發(fā)明涉及埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)的一個(gè)新菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明此外涉及整合該菌株的制劑與方法。本發(fā)明也涉及反芻動(dòng)物飼料、以及預(yù)防和治療反芻動(dòng)物乳酸中毒癥(lacticacidosis)的制劑與方法。
背景乳酸中毒癥乳酸中毒癥是在突然過量攝入易發(fā)酵的碳水化合物、尤其是當(dāng)反芻動(dòng)物從粗飼料飲食轉(zhuǎn)向含有高水平淀粉的高能或能量豐富的精飼料飲食時(shí)可能發(fā)生的反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)疾病。該疾病以瘤胃內(nèi)有機(jī)酸、尤其是乳酸的蓄積為特征(Dawson和Allison，1988)。研究顯示，飲食中易發(fā)酵碳水化合物比例的突然增加帶來的乳酸生產(chǎn)細(xì)菌與乳酸利用細(xì)菌數(shù)量之間的總體失衡，是乳酸中毒癥發(fā)作的主要原因(Slyter，1976)。
通過給予含有高數(shù)量乳酸利用細(xì)菌的物質(zhì)來控制瘤胃微生物數(shù)量，從而預(yù)防乳酸中毒癥，此方法在幾十年中得到提倡，但是從未在大范圍內(nèi)得以實(shí)踐。在瘤胃中加強(qiáng)乳酸鹽利用，這通過給以已適應(yīng)動(dòng)物的瘤胃液(Allison等，1964；Braun等，1992)和給以乳酸利用者的純化或混合的細(xì)菌培養(yǎng)物(1,251,483 Wilker等，1971；3,857,971Abdo & Cahilly，1974；4,138,498 Das，1979；5,380,525Leedle等，1991；Hession & Kung，1992；Robinson等，1992；Wiryawan &Brooker，1995)得以實(shí)現(xiàn)。
一些含有活細(xì)菌培養(yǎng)物的飼料添加劑取得了專利(1,251,483Wilker等，1971；3,857,971 Abdo & Cahilly，1974；4,138,498Das，1979；5,380,525 Leedle等，1991)，但是沒有廣泛的、或者根本沒有得到商業(yè)化。在這些專利其中三個(gè)(1,251,483Wilker等，1971；3,857,971 Abdo & Cahilly，1974；4,138,498Das，1979)中，這些培養(yǎng)物來自于使用最初瘤胃液接種體的連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵罐。然而，供體動(dòng)物不必適應(yīng)高精飼料飲食(concentrate diet)。任何這些培養(yǎng)物的pH耐受性也未提及。在另一個(gè)專利(5,380,525 Leedle等，1991)中，培養(yǎng)物從適應(yīng)高精飼料飲食的反芻動(dòng)物富集后，在pH 5.3得以直接或間接分離。
奶牛亞急性和急性酸中毒的發(fā)病率因?yàn)槟膛Ｍǔ１伙曇院懈咚焦任锏娘嬍常詠喖毙粤鑫杆嶂卸臼侨橹破饭I(yè)常見和嚴(yán)重的健康及生產(chǎn)問題。亞急性和急性瘤胃酸中毒僅僅是同一個(gè)問題的不同程度。急性瘤胃酸中毒更為嚴(yán)重，生理功能可能顯著削弱。受影響的動(dòng)物精神萎靡，通常共濟(jì)失調(diào)、食欲不振、瞳孔擴(kuò)大、心率增加。腹瀉將明顯，動(dòng)物可能變得不活動(dòng)，并在病發(fā)后2至5天內(nèi)死亡(Nordlund，1995)。急性酸中毒以瘤胃pH急劇降低(≤5.0)、乳酸濃度的巨大增加和原生動(dòng)物的大幅減少為特征(Nocek，1997)。
亞急性瘤胃酸中毒的體征非常不同于急性酸中毒。群體圈養(yǎng)或群體飼養(yǎng)的現(xiàn)代乳業(yè)管理系統(tǒng)使識(shí)別這些癥狀變得困難，因?yàn)樵谌后w中具有這些問題的個(gè)別母牛通常不被注意。亞急性瘤胃酸中毒畜群將表現(xiàn)出下列體征的部分或全部蹄葉炎、間歇性腹瀉、食欲不振或周期采食量低、未明確定義的健康問題的高畜群淘汰率、即使能量攝入足夠卻身體狀況不佳、無明顯原因的膿腫和咯血(咳血)或鼻衄(鼻出血)。這些體征大多繼發(fā)于酸中毒，大多在最初的酸中毒事件后數(shù)周或數(shù)月才出現(xiàn)。與飼育場(chǎng)牛(feedlot cattle)相反，奶牛要看養(yǎng)數(shù)年，因此酸中毒的管理對(duì)增加利益是重要的。
慢性蹄葉炎也許是亞急性瘤胃酸中毒畜群的最持久的臨床體征。盡管酸中毒和蹄葉炎的關(guān)聯(lián)沒有得到完全理解，其聯(lián)系得到廣泛的臨床承認(rèn)及研究試驗(yàn)證明(Kelly & Leaver，1990；Manson & Leaver，1988；Nocek，1997)。此外，大多乳業(yè)管理者、獸醫(yī)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)家傾向于低估或者忽視乳畜群蹄葉炎和蹄病(lameness)的異常發(fā)病率。明尼蘇達(dá)州的一個(gè)調(diào)查證明蹄病的平均發(fā)病率為15％，范圍為0-33％(Nordlund，Garret和Oetzel，1995)。歐洲的研究中確定蹄病為乳腺炎和生殖之后的第三位花費(fèi)最多的健康問題(McDaniel和Wilk，1989)。因此，酸中毒的管理顯然是極度重要的。
亞急性酸中毒的主要癥狀是采食量減少和奶生產(chǎn)效率的降低。因?yàn)樵\斷該問題的困難，亞急性酸中毒傾向于像其他問題一樣被排除，例如不良管理、不良草料質(zhì)量等，導(dǎo)致許多乳畜牧者最大的經(jīng)濟(jì)降低，因?yàn)樗瞧毡榇嬖诘?，特別出現(xiàn)于高產(chǎn)的乳畜群。
由于營(yíng)養(yǎng)與代謝障礙在高產(chǎn)奶牛中的高發(fā)病率，用于提高以谷物為基礎(chǔ)的飲食的性能的營(yíng)養(yǎng)策略聚焦于通過控制酸產(chǎn)物或通過刺激更有效的微生物生長(zhǎng)來預(yù)防瘤胃功能紊亂。目前，飼料添加劑在這方面扮演了重要角色(Hutjens，1999)。使用特異性刺激乳酸利用細(xì)菌生長(zhǎng)的酵母培養(yǎng)株產(chǎn)生了許多利益，最近的一個(gè)調(diào)查顯示，酵母培養(yǎng)在威斯康星州33％的高產(chǎn)畜群中得到使用。多個(gè)研究結(jié)果提示，當(dāng)用于高乳酸鹽飼料和高濃縮飼料時(shí)，Yea Sacc株84170似乎特別適于改變瘤胃發(fā)酵和動(dòng)物生產(chǎn)(Dawson，1995)。然而，生產(chǎn)結(jié)果卻非常不一致。在美國(guó)，酵母培養(yǎng)物添加劑的花費(fèi)為每只母牛每天4-6分(Hutjens，1999)。離子載體也因其防止重要乳酸生產(chǎn)者生長(zhǎng)的能力而在亞急性酸中毒的管理中扮演角色。盡管花費(fèi)相對(duì)低廉(1-2美分/奶牛/天，Hutjens，1999)，但是由于最近一些離子載體毒性病例，離子載體的使用似乎受到抵制。此外，離子載體尚未在美國(guó)注冊(cè)用于奶牛飲食。
實(shí)驗(yàn)上，有幾種細(xì)菌具有作為反芻動(dòng)物的直接飼料微生物的潛力，但是由于許多原因沒有得以商業(yè)化。例如，埃氏巨球形菌(ME)是對(duì)飼以高谷物飲食適應(yīng)的牛瘤胃中的主要乳酸利用生物。當(dāng)牛從高草料轉(zhuǎn)為高精飼料飲食時(shí)，ME的數(shù)量常常不足以預(yù)防乳酸中毒癥。Kung和Hessian(1995)顯示，在用高度發(fā)酵碳水化合物挑戰(zhàn)期間，添加ME B159防止了乳酸蓄積。Robinson等(1992)證實(shí)，添加ME的不同菌株，在食用牛中預(yù)防了乳酸中毒癥。
盡管與亞臨床瘤胃酸中毒有關(guān)的花費(fèi)難以精確確定，乳制品工業(yè)潛在的花費(fèi)是巨大的(Hall，1999)。Donovan(1997)保守估計(jì)美國(guó)乳業(yè)亞臨床酸中毒的花費(fèi)為每年500百萬至10億美元。
Elsden和Lewis(1953)首先描述了一種從綿羊瘤胃分離出的嚴(yán)格厭氧、革蘭氏陰性、產(chǎn)生脂肪酸、不運(yùn)動(dòng)的球菌。然而，原始的分離株在得到詳細(xì)表型特征描述之前就被丟失。幾年后，一種類似原始分離株的生物被Elsden及其同事從綿羊瘤胃內(nèi)容物中分離(Elsden等，1956)。該生物的特征與當(dāng)時(shí)任何已知物種的描述均不符合，但是，從所研究的少數(shù)分離株的角度而言，作者避免了將該生物指定為一個(gè)新的種屬，而是將其稱為L(zhǎng)C。Gutierrez等(1959)在腫脹牛(bloating cattle)瘤胃中遇到相似的生物，認(rèn)為其屬于消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)的定義內(nèi)，并建議創(chuàng)造一個(gè)新種埃氏消化鏈球菌(P.elsdenii)。隨后，Rogosa(1971)證實(shí)LC型分離株為革蘭氏陰性，因此不應(yīng)包括于消化鏈球菌屬內(nèi)。他建議將埃氏消化鏈球菌移入一個(gè)新屬巨球菌屬(Mehasphaera)，并改為新組合埃氏巨球形菌(M.elsdenii)，以Elden等的LC1分離株(1956)作為模式菌株。埃氏巨球形菌是主要發(fā)現(xiàn)于乳酸發(fā)酵特別顯著的幼小動(dòng)物和接受高精飼料飲食動(dòng)物瘤胃中的嚴(yán)格厭氧性生物。該生物偶爾也從人類糞便中分離(Sugihara等，1974)，它將乳酸主要發(fā)酵為丁酸、丙酸、異丁酸、戊酸、CO2、H2，有時(shí)還有痕量的己酸(Stewart和Bryant，1988)。既然埃氏巨球形菌不像月形單胞菌(Selenomonas)(也是出現(xiàn)在瘤胃中的乳酸利用者)那樣由葡萄糖或麥芽糖進(jìn)行分解代謝阻遏，它對(duì)乳酸分解代謝的貢獻(xiàn)在飼以可溶性碳水化合物之后顯著增強(qiáng)(Stewart和Bryant，1988)。
美國(guó)專利3,956,482(Hahn等，1976)公布了在反芻動(dòng)物中增加奶產(chǎn)量的方法，包括步驟向泌乳母牛瘤胃給予產(chǎn)生醋酸的微生物，此微生物由培養(yǎng)并適應(yīng)于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的0-4％埃氏巨球形菌、30-42％牛鏈球菌(Streptococcus bovis)、3-10％嗜酸乳酸菌(Lactobacillusacidophilus)、12-20％青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、18-44％棲瘤胃擬桿菌(Bacteroides ruminicola)和3-12％溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)的混合物組成。
公布在上述專利中的發(fā)明的主要缺點(diǎn)是牛鏈球菌的相對(duì)高百分比(30-42％之間)，牛鏈球菌和乳桿菌是反芻動(dòng)物乳酸中毒癥的主要原因。該混合物另外含有相對(duì)低百分比的埃氏巨球形菌(0-4％)，給予該混合物可能會(huì)加重或引發(fā)瘤胃乳酸中毒癥，而不是預(yù)防或治療此病。該混合物此外還暴露于大氣中，致使大部分埃氏巨球形菌死亡。而且，微生物混合物比純培養(yǎng)物更難控制。
美國(guó)專利4,138,498(Das，1979)公布了一種給予反芻動(dòng)物的飼料添加劑，當(dāng)反芻動(dòng)物從粗飼料飲食轉(zhuǎn)為淀粉時(shí)，可預(yù)防乳酸中毒癥或?qū)⑵浣抵磷畹?，該添加劑包括與可吸收動(dòng)物飼料添加劑混合的埃氏巨球形菌細(xì)菌培養(yǎng)物。埃氏巨球形菌為嚴(yán)格厭氧的，除了下文所述的缺點(diǎn)之外，在此專利中公布的該飼料添加劑的一個(gè)缺點(diǎn)是埃氏巨球形菌被暴露于大氣中，導(dǎo)致添加劑中可利用活性細(xì)胞數(shù)量的迅速降低。
美國(guó)專利5,380,525(Leedle等，1991)公布了生物學(xué)純的埃氏巨球形菌培養(yǎng)物NRRL-18624及其在幫助反芻動(dòng)物適應(yīng)從粗飼料或標(biāo)準(zhǔn)牧場(chǎng)到富含淀粉的高能飲食中的用途。該培養(yǎng)物受到下述缺點(diǎn)的損害。
美國(guó)專利5,529,793(Graner等，1996)公布了乳酸生成細(xì)菌和埃氏巨球形菌之類的乳酸利用細(xì)菌與干粉制劑或動(dòng)物飼育場(chǎng)飲食的混合物，用于改善反芻動(dòng)物對(duì)飼料的利用。此發(fā)明的缺點(diǎn)是，埃氏巨球形菌通常是嚴(yán)格厭氧的，因此將其用于干飼料將導(dǎo)致大部分細(xì)胞死亡。
申請(qǐng)人對(duì)上述埃氏巨球形菌菌株進(jìn)行評(píng)價(jià)，并且推導(dǎo)出這些菌株由于如下缺點(diǎn)而一般不適于商業(yè)化及對(duì)反芻動(dòng)物乳酸中毒癥的大規(guī)模預(yù)防性治療，即他們不是-在高濃度飲食動(dòng)物瘤胃中高度活躍并適于增殖；-可以在pH5.0以下和低至4.5(作為急性酸中毒的特征)的相對(duì)低pH值增殖；-抵抗通常加入到飼育場(chǎng)飲食中的離子載體抗生素；以及-即使在可溶性碳水化合物(例如葡萄糖和麥芽糖)存在時(shí)，也可優(yōu)先使用乳酸作為碳源。
這些菌株此外的缺點(diǎn)為，通常它們-具有相對(duì)低的生長(zhǎng)速率，即低于0.938小時(shí)-1；-不具備在乳酸和還原糖上生長(zhǎng)的能力；-具有相對(duì)低的生物量產(chǎn)出率，即低于0.39克(升·小時(shí))-1；-不是離子載體抗性的；以及-主要產(chǎn)生丙酸和丁酸，而不是醋酸。
發(fā)明目的本發(fā)明目的因此是提供埃氏巨球形菌的一種新菌株及其應(yīng)用，以及整合此菌株的制劑和方法，使用該菌株可以將前述缺點(diǎn)克服或至少降至最低。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供生物學(xué)純的埃氏巨球形菌細(xì)菌培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物含有與保藏于英國(guó)蘇格蘭阿伯丁NCIMB、保藏號(hào)為NCIMB 41125的埃氏巨球形菌菌株基本相同的16S核糖體RNA序列。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供保藏在英國(guó)蘇格蘭阿伯丁NCIMB、保藏號(hào)為NCIMB4 1125的埃氏巨球形菌菌株的生物純細(xì)菌培養(yǎng)物。
與本發(fā)明第一和第二方面一致的埃氏巨球形菌菌株還以其下述特點(diǎn)為特征-即使在糖的存在下，也能非常有效的利用乳酸；-抵抗離子載體；-相對(duì)高的生長(zhǎng)速率；-主要產(chǎn)生醋酸的能力；以及-在5.0以下并低至4.5的相對(duì)低pH值增殖的能力。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供幫助反芻動(dòng)物適應(yīng)從以粗飼料為基礎(chǔ)的飲食到以高能量精飼料為基礎(chǔ)的飲食的組合物，該組合物基本由本發(fā)明第一或第二方面的細(xì)菌培養(yǎng)物組成。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供促進(jìn)反芻動(dòng)物適應(yīng)從以粗飼料為基礎(chǔ)的飲食到以高能量精飼料為基礎(chǔ)的飲食的方法，包括步驟有對(duì)所述反芻動(dòng)物瘤胃給以有效量的根據(jù)本發(fā)明第一或第二方面的細(xì)菌培養(yǎng)物。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供反芻動(dòng)物飼料添加劑，其包括載體和有效量的根據(jù)本發(fā)明第一或第二方面的細(xì)菌培養(yǎng)物。
培養(yǎng)物優(yōu)選置于無氧容器中。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供用于治療瘤胃乳酸中毒癥并預(yù)防下述之一或更多的方法，即瘤胃乳酸中毒癥、瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引發(fā)的蹄葉炎、瘤胃乳酸中毒癥引發(fā)的腫脹和肝膿腫，該方法包括步驟將有效量的根據(jù)本發(fā)明第一或第二方面的細(xì)菌培養(yǎng)物無氧條件下給予反芻動(dòng)物瘤胃。
根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供用于治療瘤胃乳酸中毒癥并預(yù)防下述之一或更多的獸醫(yī)學(xué)試劑，即瘤胃乳酸中毒癥、瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引發(fā)的蹄葉炎、瘤胃乳酸中毒癥引發(fā)的腫脹和肝膿腫，該試劑包括有效量的根據(jù)本發(fā)明第一或第二方面的細(xì)菌培養(yǎng)物。
根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供用于治療反芻動(dòng)物瘤胃乳酸中毒癥和預(yù)防下述之一或更多的制劑，即瘤胃乳酸中毒癥、瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引發(fā)的蹄葉炎、瘤胃乳酸中毒癥引發(fā)的腫脹和肝膿腫，該制劑包括-根據(jù)本發(fā)明第一或第二方面的細(xì)菌培養(yǎng)物種菌；以及
-分開的厭氧生長(zhǎng)培養(yǎng)基，該制劑成分置于無氧容器的分隔的室中，這些室彼此無氧連接，以將培養(yǎng)物無氧接種于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在反芻動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)下述改進(jìn)之一或更多的方法，即-增加的奶產(chǎn)量；-改進(jìn)的飼育場(chǎng)性能；-提高的生長(zhǎng)速率；-育肥時(shí)間(finishing time)的縮短；-較低的消化系統(tǒng)發(fā)病率和死亡率；-較低的乳酸中毒癥及相關(guān)疾病發(fā)病率；-改進(jìn)的飼料轉(zhuǎn)化效率；以及-以相對(duì)較高精飼料飲食飼養(yǎng)的能力，包括步驟為向反芻動(dòng)物瘤胃給以有效量的根據(jù)本發(fā)明第一或第二方面的細(xì)菌培養(yǎng)物。
培養(yǎng)物優(yōu)選無氧給予。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在比傳統(tǒng)方法相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)分離高等瘤胃微生物(superior ruminal microorganism)的生物純培養(yǎng)物的方法，該方法包括步驟為-獲得瘤胃液樣品；以及-在預(yù)先選擇的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)該樣品，該方法特征在于，預(yù)先選擇選自生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分、稀釋率、pH、溫度、抗微生物試劑、氣體環(huán)境、氧化還原電位、缺乏營(yíng)養(yǎng)素和攻擊生物的多個(gè)參數(shù)，以有利于高等瘤胃微生物但不利于次等瘤胃微生物。
現(xiàn)在，本發(fā)明將結(jié)合下面的實(shí)施例及附圖得到更詳細(xì)的描述，其中
圖1為乳酸利用者在多個(gè)pH值的生長(zhǎng)速率曲線圖；圖2為乳酸利用分離株在多個(gè)pH值于葡萄糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率(小時(shí)-1)曲線圖；和圖3為根據(jù)本發(fā)明的埃氏巨球形菌的系統(tǒng)發(fā)生樹。
根據(jù)本發(fā)明，能夠利用乳酸的生物直接分離自適應(yīng)高精飼料飲食的反芻動(dòng)物。目的是為作為大量培養(yǎng)的保藏接種體的目的，選擇具有最佳特征組合的培養(yǎng)物，用于預(yù)防和/或治療性處理乳酸中毒癥。
乳酸利用細(xì)菌必須高度活躍并且適于在高精飼料飲食的動(dòng)物瘤胃中繁殖，以使其有效。該生物應(yīng)該能夠在低于pH 5.0的pH值下繁殖。選擇的分離株還應(yīng)該抵抗通常添加于飼育場(chǎng)飲食中的離子載體抗生素。即使在可溶性碳水化合物例如葡萄糖和麥芽糖(在高精飼料飲食中將大比例存在)存在下，乳酸應(yīng)該優(yōu)先作為碳源使用。
方法1.分離期間使用的動(dòng)物瘤胃內(nèi)容物樣品來自對(duì)乳酸利用細(xì)菌進(jìn)行預(yù)選擇的動(dòng)物，即DairyCow Nutrition單位(Irene，the Agricultural Council，南非)的泌乳瘺奶牛(lactating fistulated dairy cow)和Chalmar Beef的飼育場(chǎng)牛(比勒陀利亞，南非)，它們?cè)谟势谀┍煌涝?。所有?dòng)物均適應(yīng)于高精飼料飲食，該飲食增加了天然出現(xiàn)的乳酸利用細(xì)菌的數(shù)量。
2.樣品的收集及制備瘤胃內(nèi)容物樣品收集自經(jīng)飼養(yǎng)和擠奶后約09h00的奶牛。來自飼育場(chǎng)動(dòng)物的瘤胃內(nèi)容物樣品在動(dòng)物被屠宰15-30分鐘后獲得。塑料螺旋帽樣品瓶中被充以經(jīng)兩層粗紗布過濾的瘤胃液。瘤胃液直接轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐。
pH助恒器(auxostat)通過將pH定量泵改變?yōu)榕囵B(yǎng)基添加泵，New Brunswick ScientificBioflo1連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)得以改良為pH助恒器。pH使用連接到DigitalData Systems 302 pH計(jì)和滴定管的Schott S23158 pH電極監(jiān)控。只要pH增加至超過設(shè)定值，低緩沖的培養(yǎng)基即被加入，直至達(dá)到要求的數(shù)值。培養(yǎng)容器的工作體積為270ml。對(duì)于特定生物，在助恒器培養(yǎng)期間獲得的最大稀釋速率是該生物在此條件下最大生長(zhǎng)速率的量度標(biāo)準(zhǔn)。
4.通過助恒器分離瘤胃乳酸利用細(xì)菌4.1.生長(zhǎng)條件和培養(yǎng)基過濾的瘤胃液首先用于填充發(fā)酵罐(270毫升)，經(jīng)激活的滴定管按比例向培養(yǎng)體系添加消毒培養(yǎng)基(培養(yǎng)基1)來提高培養(yǎng)pH。培養(yǎng)基1為半確定的不含瘤胃液的培養(yǎng)基，其組成為乳酸鈉(70％)，10克/升；蛋白胨2克/升；KH2PO41克/升；(NH4)2SO43克/升；MgSO4·7H2O0.2克/升；CaCl2·2H2O 0.06克/升；維生素(吡哆醇鹽酸鹽，4毫克/升；吡哆胺，4毫克/升；核黃素，4毫克/升；維生素B1鹽酸鹽，4毫克/升；煙酰胺，4毫克/升；Ca-D-泛酸鹽，4毫克/升；4-氨基苯甲酸，0.2毫克/升；生物素，0.2毫克/升，葉酸，0.1毫克/升，以及維生素B12，0.02毫克/升)；Na2S·9H2O，0.25克/升；半胱氨酸，0.25克/升；防沫劑0.07毫升/升，以及莫能菌素，10毫克/升。乳酸鈉和礦物溶液均被加于貯液瓶中，并高壓滅菌60分鐘。蛋白胨溶解于300毫升蒸餾水中，在底部出口安裝Quick-fit玻璃連接管的1.0升Schott瓶中單獨(dú)高壓滅菌。兩個(gè)還原試劑和維生素溶液也預(yù)先經(jīng)過過濾除菌。高壓滅菌后，貯液瓶以無氧氣體充氣過夜，其他成分在冷卻后分別加入。pH使用5N鹽酸調(diào)節(jié)到要求值。
隨后連續(xù)培養(yǎng)直至在顯微鏡下觀察到純培養(yǎng)物。使用消毒注射器將樣品從發(fā)酵罐中取出，注射器被密封并轉(zhuǎn)移至無氧柜(FormaScientific model 1024)中。用一滴培養(yǎng)物在皮氏培養(yǎng)皿中劃線，該培養(yǎng)皿中含有用2％瓊脂凝固的培養(yǎng)基1。隨后于39℃孵育過夜，使用消毒針和注射器將單菌落轉(zhuǎn)移至容納于30毫升血清瓶的新鮮培養(yǎng)基1中。于39℃孵育24小時(shí)后，培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到幾個(gè)含有培養(yǎng)基1的斜面上并培養(yǎng)過夜。這些斜面在液氮上長(zhǎng)期保存。
4.2.分離株在發(fā)酵罐中的分批生長(zhǎng)速率分離株的生長(zhǎng)速率通過使用分批培養(yǎng)技術(shù)并監(jiān)控光密度隨時(shí)間的增加而得以證實(shí)。將光密度(OD)的自然對(duì)數(shù)對(duì)時(shí)間繪圖，曲線的線性部分被用來測(cè)定代表該生物最大生長(zhǎng)速率的斜率。分批生長(zhǎng)速率的測(cè)定在恒化培養(yǎng)物中進(jìn)行，培養(yǎng)物以消毒培養(yǎng)基稀釋，直至得到非常稀的培養(yǎng)物懸液，并切斷培養(yǎng)基供應(yīng)以開始分批生長(zhǎng)。使用恒化培養(yǎng)物對(duì)此工作的益處在于沒有滯后期，因?yàn)榧?xì)胞全都是活的并且適應(yīng)于該培養(yǎng)基。
4.3.分析技術(shù)揮發(fā)性脂肪酸通過氣相色譜法，使用含有火焰離子化探測(cè)器和Tupelo 1-1825柱的Carlo Erba GC4200氣相色譜(Supelco Inc.，Bellefonte PA，美國(guó))測(cè)定。操作條件如下載氣，氮?dú)?；火焰氣，氫氣和空氣；柱?75℃，注射端口溫度200℃。Barspec數(shù)據(jù)系統(tǒng)用于峰整合。新戊酸做為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。酶學(xué)測(cè)定D-和L-乳酸異構(gòu)體的利用(試驗(yàn)組合1112 821，Boehringer Mannhe im GmbH，Mannheim)5.通過平板涂布法分離細(xì)菌5.1.培養(yǎng)基用于平板涂布法分離的經(jīng)孵育的瘤胃液乳酸(IRFL)培養(yǎng)基，其組成為400毫升來自紫花苜蓿飼養(yǎng)綿羊經(jīng)孵育的澄清瘤胃液(Olumeyan等，1986)、371毫升蒸餾水、2克蛋白胨(Merck)、15克瓊脂、100毫升10％(w/v)D、L-乳酸鈉溶液、100毫升0.04％(w/v)溴甲酚紫溶液以及25毫升含有40克/升KH2PO4、120克/升(NH4)2SO4、8克/升MgSO4·7H2O和2.4克/升CaCl2·2H2O的礦物溶液。在于121℃高壓滅菌25分鐘前，用乳酸(90％w/v)調(diào)節(jié)pH至5.5。滅菌后，培養(yǎng)基在50℃水浴中冷卻，同時(shí)以無氧氣體混合物充氣。無菌加入還原試劑Na2S·9H2O(12.5％w/v)和半胱氨酸·HCl·H2O(12.5％w/v)各2毫升。由于IRFL培養(yǎng)基對(duì)乳酸利用者并非是完全選擇的，溴甲酚紫被聯(lián)合使用來檢測(cè)乳酸利用者。當(dāng)乳酸被利用時(shí)，緊鄰菌落的附近出現(xiàn)導(dǎo)致pH升高的離子平衡的變化。與菌落同心區(qū)域的顏色由黃變紫時(shí)，指示pH高于6.3。
酸耐受在初始pH值為4.5、5.0和5.5的IRFL瓊脂平板上得到測(cè)定。
離子載體抗性在含有10ppm常用于高精飼料飲食中的離子載體(即莫能菌素(Sigma)和拉沙里菌素(Sigma))的IRFL瓊脂平板上得到測(cè)試。可溶性糖對(duì)乳酸利用的抑制在添加了終濃度為10克/升的麥芽糖或葡萄糖的IRFL瓊脂平板上得到測(cè)試。陽(yáng)性結(jié)果(即紫色的菌落同心區(qū)域)指示由于乳酸利用而產(chǎn)生的堿釋放速率超過來自所添加糖的酸產(chǎn)生。分離株也在不含乳酸、但是添加濃度為10克/升的葡萄糖或麥芽糖的IRFL瓊脂培養(yǎng)基上得到篩選，來測(cè)定這兩種糖的利用。
麥芽糖和葡萄糖上的生長(zhǎng)速率在類似于SDL培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上得到測(cè)定，但是在此培養(yǎng)基中，乳酸被10克/升葡萄糖或麥芽糖代替。
5.2.平板涂布法分離和篩選用于平板涂布法分離的樣品在無氧柜中稀釋(Mackie & Heath，1979)。IRFL培養(yǎng)基的涂布平板用10-4至10-6稀釋物制備，并于39℃無氧孵育。24小時(shí)后，顯現(xiàn)紫色區(qū)域的充分隔開的菌落被轉(zhuǎn)移至1.5ml小管內(nèi)的IRFL液體培養(yǎng)基中。在16小時(shí)內(nèi)顏色改變?yōu)樽仙慕?jīng)過接種的小管，對(duì)其酸耐受、離子載體抗性、代謝物阻遏以及葡萄糖和/或麥芽糖利用進(jìn)行篩選。篩選通過平板復(fù)制(Lederberg和Lederberg，1952)完成，使用多點(diǎn)接種器將20個(gè)分離株接種到一套上文所描述的成分不同的9個(gè)瓊脂平板上。
5.3.生長(zhǎng)速率測(cè)定生長(zhǎng)速率以578nm混濁度的增加來測(cè)定，在SDL、SDG或SDM培養(yǎng)基中進(jìn)行三重測(cè)量。在讀數(shù)之間，小瓶在39℃水浴中孵育。讀數(shù)持續(xù)直至混濁度達(dá)到與生物量的滿意關(guān)聯(lián)的限制。光密度(OD)的自然對(duì)數(shù)對(duì)孵育時(shí)間繪圖。借助電子數(shù)據(jù)表軟件包，通過線性回歸對(duì)代表特定生長(zhǎng)速率的指數(shù)生長(zhǎng)期斜率進(jìn)行計(jì)算。
在pH 5.7生長(zhǎng)于SDL培養(yǎng)基的培養(yǎng)物于是另外孵育24小時(shí)，此后，取出9毫升，加入1毫升10％(w/v)NaOH來分析形成的終產(chǎn)物和乳酸異構(gòu)體的利用。
5.4.平板分離株生長(zhǎng)的生理學(xué)研究發(fā)酵罐說明。連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)通過3個(gè)容積各為約250毫升的發(fā)酵罐而建立。使用單個(gè)蠕動(dòng)泵以不同速率向三個(gè)發(fā)酵罐供應(yīng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)物溫度保持在39℃。培養(yǎng)基和發(fā)酵罐充以100％CO2以維持無氧環(huán)境。培養(yǎng)物的pH通過按需要添加20％(w/v)磷酸保持在pH5.5。稀釋速率設(shè)定為最大生長(zhǎng)速率的70％、80％和90％。80毫升樣品從每個(gè)處于穩(wěn)態(tài)的發(fā)酵罐中無菌取出。細(xì)胞干重和培養(yǎng)基中殘留乳酸從此樣品中測(cè)定。生物量產(chǎn)出速率，即稀釋速率和穩(wěn)態(tài)生物量的產(chǎn)物，使用實(shí)際稀釋速率和干重?cái)?shù)字計(jì)算。生長(zhǎng)產(chǎn)量系數(shù)，即穩(wěn)態(tài)生物量濃度對(duì)所利用底物的量的函數(shù)，使用乳酸殘留物和干重?cái)?shù)字計(jì)算。
6.使用綿羊評(píng)價(jià)分離株CH4預(yù)防瘤胃乳酸蓄積能力的試驗(yàn)6.1.方法在首次試驗(yàn)中，12只瘤胃插管的閹割公綿羊(平均活體重大約40公斤)被隨機(jī)分為處理組和對(duì)照組，每組包括6只動(dòng)物。所有動(dòng)物都不加限制飼以粗飼料喂養(yǎng)21天。在第21天，在供以每只動(dòng)物1000克玉米面、同時(shí)每只動(dòng)物瘤胃內(nèi)給以麥芽糖漿300克之前，動(dòng)物被禁食11小時(shí)。一小時(shí)后所有仍未被各動(dòng)物消耗的玉米面得以直接填充入其瘤胃。處理組的動(dòng)物其后立即經(jīng)瘤胃內(nèi)給以1×1011cfu的CH4，同時(shí)，對(duì)照組的動(dòng)物類似地給以CH4制劑的無細(xì)胞過濾液，即無CH4。瘤胃液樣品以2小時(shí)為間隔采集，直至給藥后12小時(shí)，用于測(cè)量瘤胃乳酸濃度。
在第二次試驗(yàn)中，使用另一組12只瘤胃插管的閹割公羊，平均活體重29公斤，先前沒有暴露于精飼料喂養(yǎng)。它們可以隨意使用埃塞俄比亞畫眉草(Eragrostis teff)碎干草和蛋白質(zhì)-礦物質(zhì)舐鹽。小羊被隨機(jī)分為每組6只動(dòng)物的兩組，即處理組和對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)第一天(Day 1)，所有小羊不加限制的得到如下飲食玉米，888；糖蜜，69；尿素，17；石灰石，11；磷酸氫二鈣，6；鹽，4；硫酸胺，4；含有莫能菌素的礦物質(zhì)-維生素預(yù)混合料，1(克/公斤DM)的。在精飼料喂養(yǎng)的第一天，處理組的每只動(dòng)物在12:00(即飼食后3小時(shí))瘤胃內(nèi)接受CH4。對(duì)照組動(dòng)物類似地給以水。在精飼料喂養(yǎng)開始(Day 1)的前一天以及精飼料喂養(yǎng)的第一、第二、第三和第七天的多個(gè)時(shí)間獲取瘤胃樣品，用于測(cè)量瘤胃乳酸濃度。
7.分離株CH4在高產(chǎn)奶牛中的評(píng)價(jià)7.1.用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的乳酸利用者的培養(yǎng)使用Watson-Marlow 505S定量給樣泵將工作體積為10升的BraunBiostat B發(fā)酵罐改造為恒化器，該泵裝備有55rpm驅(qū)動(dòng)器，用于從50升不銹鋼桶轉(zhuǎn)運(yùn)消毒的培養(yǎng)基。
經(jīng)汲取管和蠕動(dòng)泵(Watson-Marlow 505S)持續(xù)將超過發(fā)酵罐10升水平的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到在膛式冷藏器中冷卻的50升聚丙烯玻璃瓶中，從而保持工作體積恒定。此收獲泵的傳送速率設(shè)定為培養(yǎng)基供應(yīng)泵的約120％。從發(fā)酵罐去除的過量體積含有來自頂部空間的無氧氣體。
裝備Mil1ipore HVMP 0.45微米(15平方英尺)過濾器以及Millipore Masterflex Easy-Load蠕動(dòng)泵的切向流過濾系統(tǒng)(Millipore Pellicon)，用于濃縮培養(yǎng)物。
使用的培養(yǎng)基為CSL4。維生素、還原試劑、礦物質(zhì)和微量元素溶液在加入培養(yǎng)基貯存器之前先經(jīng)過過濾除菌。高壓滅菌后，將貯存器以無氧氣體充氣。
生產(chǎn)方法為交錯(cuò)型生產(chǎn)方法。兩個(gè)連續(xù)生產(chǎn)得以執(zhí)行，每個(gè)產(chǎn)生足以用于一天的動(dòng)物組處理的細(xì)胞。由于每天的產(chǎn)物被收集進(jìn)入50升容器中，濃縮步驟的數(shù)量限制在每個(gè)生產(chǎn)一步。培養(yǎng)物的稀釋速率為0.4小時(shí)-1，批次之間的“停歇時(shí)間”為50分鐘。由45升組成的支持性運(yùn)轉(zhuǎn)在第一天生產(chǎn)之前開始，以促進(jìn)恒化器培養(yǎng)進(jìn)入穩(wěn)態(tài)。
7.2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只高產(chǎn)奶牛根據(jù)先前哺乳期奶產(chǎn)量和體重分區(qū)組，其后在每區(qū)組中隨機(jī)分配至下述處理組之一1)對(duì)照飲食60％精飼料；2)對(duì)照飲食60％精飼料+CH4；3)對(duì)照飲食70％精飼料；4)對(duì)照飲食70％精飼料+CH4。母牛在生產(chǎn)時(shí)、產(chǎn)后10天和產(chǎn)后20天給以CH4。
下列參數(shù)得到監(jiān)測(cè)1.每日干物質(zhì)攝入；2.每日奶產(chǎn)量；3.每周乳脂、蛋白質(zhì)和乳糖；和4.每月身體重量和狀況得分。
8.統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)使用Genstat 5程序進(jìn)行完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)變量分析。使用先前哺乳期奶產(chǎn)量作為協(xié)變量，奶產(chǎn)量以經(jīng)過協(xié)變量調(diào)節(jié)的值來報(bào)告。
使用對(duì)比測(cè)定如下處理之間差異的顯著性□+CH4或-CH4(給藥者vs.未給藥者)；□對(duì)照飲食70％精飼料vs.對(duì)照飲食70％精飼料+CH4
□對(duì)照飲食60％精飼料vs.對(duì)照飲食60％精飼料+CH4在P＜0.10時(shí)差異是顯著的，除非另外注明，在P＜0.15時(shí)確定具有趨勢(shì)。
9.埃氏巨球形菌補(bǔ)充對(duì)動(dòng)物健康和飼育場(chǎng)性能的影響純系Bonsmara斷奶閹割公牛448只(平均初始活體重215公斤)，隨機(jī)分配至2×2×2因子設(shè)計(jì)的八個(gè)試驗(yàn)處理中，因子為(1)CH4添加(是或否)；(2)離子載體添加(是或否)；(3)粗飼料水平(高或低)。使用的飼育場(chǎng)飲食及隨后的飲食方案如下適應(yīng)末期(第14天至結(jié)束)實(shí)驗(yàn)飲食的組成成分
將無水DHEA-S溶解在90％乙醇/水的沸騰混合物中。在干冰/乙醇浴中快速冷卻此溶液，使DHEA-S重結(jié)晶。濾出晶體，用冷的乙醇洗滌兩次，然后放在室溫下的真空干燥器中總共36小時(shí)。干燥過程中，用刮刀定期攪拌該物質(zhì)，以破壞大的聚集塊。干燥后，使該物質(zhì)通過500微米篩。
(2)微粉化和物理化學(xué)測(cè)試在氮?dú)庵性趪娚溲心C(jī)中微粉化DHEA-S，文氏管壓力為40PSI、研磨機(jī)壓力為80PSI、進(jìn)料裝置為25、產(chǎn)品進(jìn)料速率約為120-175g/小時(shí)。使用5點(diǎn)BET分析測(cè)定表面積，使用Micromeritics TriStar表面積分析儀以氮?dú)庾鳛槲綒怏w(P/Po＝0.05到0.30)進(jìn)行該BET分析。使用Micromeritics Satum Digisizer通過激光衍射分析粒度分布，其中顆粒懸浮在礦物油中，使用二辛基磺化琥珀酸鈉作為分散劑。采用Karl Fischer滴定(Schott Titroline KF)測(cè)量藥物物質(zhì)的水含量。以純水作為標(biāo)準(zhǔn)，三個(gè)試驗(yàn)的所有相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1％。直接將粉末加到滴定培養(yǎng)基中。微粉化前和微粉化后的DHEA-S二水合物的物理化學(xué)特性列在表7中。
表7微粉化前和微粉化后的DHEA-S二水合物的物理化學(xué)特性
所測(cè)得明顯變化僅僅是粒度的變化。水的損傷并不明顯，雜質(zhì)的增加也不明顯。微粉化物質(zhì)的表面積與平均大小為3-4微米的無規(guī)則形狀顆粒的表面積一致。微粉化成功經(jīng)粒度減少到適合于吸入的范圍，而且在固態(tài)化學(xué)中沒有產(chǎn)生可測(cè)量的變化。
(3)DHEA-S二水合物的氣溶膠化用單劑Acu-Breathe裝置評(píng)估DHEA-S二水合物。將約10毫克純DHEA-S二水合物填充到箔發(fā)泡藥中，并密封。促使這些發(fā)泡藥進(jìn)入流速為30-75L/min劑。
CH4培養(yǎng)物通過將直接從發(fā)酵罐泵入大玻璃瓶容器的1000毫升新鮮CH4接種體接種17.5升的CSL6培養(yǎng)基(起始pH 5.20)而制備，在39℃孵育過夜。培養(yǎng)后的培養(yǎng)物pH為6.63，并在48小時(shí)之后保持相同。孵育后對(duì)CH4培養(yǎng)物計(jì)數(shù)。使用蠕動(dòng)泵在10秒內(nèi)從20升大玻璃瓶中轉(zhuǎn)移200毫升劑量每os給動(dòng)物。
用于CH4培養(yǎng)的20升批次的CSL 6培養(yǎng)基
各圍圈的采食量得到測(cè)量(每天/每周)，個(gè)體動(dòng)物體重得到測(cè)量(每周/兩周)。這些數(shù)據(jù)用于計(jì)算飼料轉(zhuǎn)化比(每圈)。動(dòng)物每日得到觀察，任何表現(xiàn)出酸中毒體征(腹瀉、水腫、沮喪)的動(dòng)物都被遷離，并且立刻在將其返回它們各自圍圈之前給以處理。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)使用GenStat 5程序進(jìn)行分析。動(dòng)物按照重量分區(qū)組。通過在變異分析中使用2×2×2因子設(shè)計(jì)方法(ANOVA)，對(duì)CH4、離子載體和粗飼料水平的作用進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)于均一治療差異來說，這些數(shù)據(jù)是可接受地正常的。假設(shè)來自ANOVA的F-概率在5％是顯著的，則在5％水平，處理平均值使用Fishers′protected t-test最小顯著差異進(jìn)行分離。
10.使用以16S rRNA基因序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)鑒定分離株10.1.細(xì)菌分離株和培養(yǎng)條件。
最初分離自奶牛的埃氏巨球形菌分離株CH4和CH7(Wiederhold，1994)由本發(fā)明人提供。埃氏巨球形菌的模式菌株ATCC25940從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得。這些菌株按照以前描述在SDL培養(yǎng)基中培養(yǎng)，推測(cè)鑒定為埃氏巨球形菌(Wiederhold，1994)。
10.2.16S核糖體RNA基因的擴(kuò)增和測(cè)序。
使用標(biāo)準(zhǔn)程序從細(xì)菌細(xì)胞提取基因組DNA(Ausubel等，1988)。用來擴(kuò)增16S rRNA的引物選自所有真細(xì)菌中的普遍保守區(qū)(表1)。使用引物FD1(覆蓋位點(diǎn)8至26)和R11(位點(diǎn)1384-1400)實(shí)施PCR。用于擴(kuò)增和測(cè)序的引物的所有靶位點(diǎn)參見大腸桿菌編碼系統(tǒng)(Brosius等，1978)。100μl PCR反應(yīng)混合物含有約200ng DNA、各1μM的每種引物、各200μM的每種核苷酸(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.4)及2.5mM MgCl和2.5UTaq聚合酶(Boehringer Mannheim，德國(guó))。該混合物由液體石蠟覆蓋以防止蒸發(fā)。熱形式由30個(gè)熱循環(huán)組成，每個(gè)熱循環(huán)中，在94℃變性1分鐘，45℃退火2分鐘，繼而在72℃延伸3分鐘(Hybaid，英國(guó))，在熱循環(huán)儀中進(jìn)行。最后的延伸在72℃進(jìn)行6分鐘。擴(kuò)增子的同質(zhì)性經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析(Sambrook等，1989)。PCR產(chǎn)物從凝膠切下，并按照廠商說明使用Wizard PCR Preps kit(Promega，美國(guó))進(jìn)行純化。雙鏈PCR擴(kuò)增子的直接測(cè)序以及隨后的測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上的分離，基本依照Dorsch和Stackebrandt(1992)的方法進(jìn)行。測(cè)序引物列于表1。
表1用于擴(kuò)增和測(cè)序16SrRNA基因的引物。引物序列先前已發(fā)表(Dorsch和Stackebrandt，1992；Lane等，1985；Stackebrandt和Charfreitag，1990；Hutson等，1993)。這些引物的組合總共覆蓋了16S rRNA基因的1419個(gè)核苷酸。
a引物的所有靶位點(diǎn)參見大腸肝菌編碼系統(tǒng)(Brosius等，1978)。
3.數(shù)據(jù)分析使用比對(duì)程序CLUSTALW(Genetics Computer Group，1991)，得到的16S rDNA序列得以與從Ribosomal Database Project(RDP；Maidak等，1996)獲得的序列進(jìn)行自動(dòng)比對(duì)。為了就包括于比對(duì)圖中的每種生物序列的大小進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)圖中的序列進(jìn)行修剪?？傆?jì)1388個(gè)核苷酸序列位點(diǎn)包括在此圖中。已發(fā)表的許多出現(xiàn)在瘤胃中的生物的序列包括在此比對(duì)圖中(表2)。比對(duì)圖中不明確的序列，通過使用Genetics Data Environment(GDE)比對(duì)編輯器(Smith，1992)進(jìn)行手工比對(duì)。為了推測(cè)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，使用fastDNAml(Olsen等，1994)程序，該程序以最大似然算法(Felsenstein，1981)為基礎(chǔ)。使用程序Treetool(GDE)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。在此樹構(gòu)建中以大腸桿菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌(acinetobacter calcoaceticus)作為外部參考物種(out groups)。
表2在使用程序CLUSTALW的比對(duì)圖中包括的生物。所有序列獲自RDP和Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)。
結(jié)果助恒器分離乳酸利用細(xì)菌在助恒器中的分離分離1當(dāng)助恒器由pH的升高而觸發(fā)時(shí)，裝入發(fā)酵罐培養(yǎng)器皿的、從母牛8710獲得的瘤胃內(nèi)容物立即暴露于新鮮的消毒選擇培養(yǎng)基。最初2小時(shí)在pH 5.30的初始稀釋速率在0.53小時(shí)-1區(qū)域。在其后2小時(shí)中，稀釋速率增加到0.65小時(shí)-1。為了增加分離的特異性，pH降至pH 5.0，此pH導(dǎo)致稀釋速率降低為0.37小時(shí)-1。培養(yǎng)進(jìn)一步持續(xù)24小時(shí)，其后在富集培養(yǎng)體系中僅能檢測(cè)到兩種形態(tài)型。最初24小時(shí)之后，隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，稀釋速率輕微下降，在分離末期，稀釋速率僅為0.33小時(shí)-1。
在無氧柜中將發(fā)酵罐內(nèi)容物劃線于瓊脂培養(yǎng)基上，含有純培養(yǎng)物的單菌落被轉(zhuǎn)移到瓊脂斜面，于液氮上保存，該培養(yǎng)物被指定為分離株CHl。
分離2在這個(gè)從母牛8812瘤胃內(nèi)容物分離的過程中，在最初24小時(shí)觀察到0.25小時(shí)-1的稀釋速率，在隨后的24小時(shí)期間，稀釋速率在0.34小時(shí)-1至0.41-1之間。在48小時(shí)的培養(yǎng)之后，是否獲得“純”培養(yǎng)物尚不明確，培養(yǎng)再繼續(xù)進(jìn)行24小時(shí)。在此期間，稀釋速率為0.41小時(shí)-1，通過來自皮氏培養(yǎng)皿的菌落，從發(fā)酵罐分離出純培養(yǎng)物。該分離株被命名為CH2。
分離3在此分離期間，稀釋速率經(jīng)過48小時(shí)從0.28小時(shí)-1降低至0.21小時(shí)-1。從母牛8708瘤胃獲得的該分離株被指定為分離株CH3。
分離4最初的稀釋速率在0.38小時(shí)-1數(shù)量級(jí)，但是稀釋速率在4小時(shí)之內(nèi)降至0.276小時(shí)-1，在48小時(shí)時(shí)期末，稀釋速率僅為0.197小時(shí)-1。在從母牛8826瘤胃內(nèi)容物分離過程中獲得的此分離株被指定為CH4。
分離5在該分離時(shí)期末，孢子形式為主要生物，實(shí)驗(yàn)中止。
分離6在此分離中，稀釋速率按照與其他分離相同的模式下降，最終的稀釋速率僅為0.116小時(shí)-1。分離株從飼育場(chǎng)牛瘤胃內(nèi)容物中獲得并被指定為CH6。
分離7在此分離中使用的瘤胃內(nèi)容物獲得于飼育場(chǎng)牛。在分離的最初7個(gè)小時(shí)期間，稀釋速率從0.142小時(shí)-1降至0.106小時(shí)-1。獲得的分離株被指定為CH7。
用于恒化研究的培養(yǎng)基改良在乳酸利用者分離過程中觀察到稀釋速率的持續(xù)降低，顯示培養(yǎng)基的配制并非最佳。在分離7的最初24小時(shí)期間，稀釋速率從0.142小時(shí)-1降至0.106小時(shí)-1。將脈沖劑量為5ml的瘤胃液直接加入發(fā)酵罐中，4小時(shí)后稀釋速率達(dá)到最高點(diǎn)0.408小時(shí)-1。其后稀釋速率緩慢降至0.15小時(shí)-1。該“脈沖及移位(pulse and shift)”技術(shù)證明培養(yǎng)基缺乏營(yíng)養(yǎng)。
使用1ml維生素溶液的“脈沖及移位”實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致了僅有0.28小時(shí)-1的稀釋速率峰值。然而，更大的維生素脈沖導(dǎo)致了0.497小時(shí)-1的稀釋速率峰值，高于使用瘤胃內(nèi)容物脈沖。乳酸利用反映出同樣的結(jié)果，即不含額外維生素時(shí)分別為22和86％、以及含有額外維生素時(shí)分別為68和91％的D-和L-乳酸異構(gòu)體利用。列于方法部分中的培養(yǎng)基1反映了含有較高濃度維生素的改良版本。在另一個(gè)“脈沖及移位”實(shí)驗(yàn)中，確定了酵母提取物增加分離株細(xì)胞的生長(zhǎng)。
埃氏巨球形菌ATCC 25940及助恒器分離株的生長(zhǎng)速率vs.pH使用改良的乳酸培養(yǎng)基，在4.5至6.5之間的多種pH值，細(xì)菌生長(zhǎng)速率使用pH助恒器得到測(cè)定。將這些生長(zhǎng)速率與在特定pH值分批培養(yǎng)中所獲數(shù)值進(jìn)行核對(duì)，使用平均值。
模式菌株埃氏巨球形菌ATCC 25940從pH4.5至6.0顯示生長(zhǎng)速率的增加，繼之以生長(zhǎng)速率在pH 6.5的迅速降低(
圖1)。用ATCC 25940達(dá)到的最大生長(zhǎng)速率為0.66小時(shí)-1，符合由Therion等報(bào)道的0.6小時(shí)-1的生長(zhǎng)速率(1981)。
就最大速率而言，所有分離株都勝過ATCC 25940，尤其在pH值5.5及以下(
圖1)。分離株的最大生長(zhǎng)速率均在pH 5.5(對(duì)于分離株CH7、CH6、CH4和CH3，分別以0.66、0.93、0.938和0.864的生長(zhǎng)速率(小時(shí)-1))達(dá)到最高點(diǎn)。所有分離株中，CH4得到證實(shí)是最耐受酸的，在pH4.5具有0.389小時(shí)-1的生長(zhǎng)速率，具有第二佳耐酸性的生物CH6在pH 4.5僅具有0.19小時(shí)-1的生長(zhǎng)速率。對(duì)3個(gè)分離株即CH6、CH4和CH3，在pH5.5至6.0之間觀察到生長(zhǎng)速率的急劇降低。分離株CH 7在pH 5.5至6.0之間的生長(zhǎng)速率僅有輕微變化，該變化類似ATCC 25940在pH5.5至6.5之間。
助恒器分離株在葡萄糖上的生長(zhǎng)速率使用分批補(bǔ)料生長(zhǎng)技術(shù)，三個(gè)分離株的生長(zhǎng)速率在pH 5.0、5.5和6.0得到測(cè)定(圖2)。與乳酸相比，葡萄糖上的三個(gè)分離株，生長(zhǎng)速率顯著較低。與在乳酸上的0.938小時(shí)-1相比，在乳酸上最有希望的CH4在pH 5.5、葡萄糖上達(dá)到的最大生長(zhǎng)速率僅0.25小時(shí)-1。在pH 6.0，分離株CH7達(dá)到這些分離株中在葡萄糖上的最大生長(zhǎng)速率(0.33小時(shí)-1)。
乳酸經(jīng)由分離株CH4的轉(zhuǎn)化分離株CH4在乳酸培養(yǎng)基上以三個(gè)恒化稀釋速率(即0.94、0.83和0.75小時(shí)-1)得到培養(yǎng)。在穩(wěn)態(tài)期間取樣品，對(duì)揮發(fā)性脂肪酸(VFA)進(jìn)行分析，并測(cè)定乳酸利用。分批培養(yǎng)也得以進(jìn)行，樣品在穩(wěn)定期獲取。消毒培養(yǎng)基樣品同樣對(duì)VFAs和乳酸進(jìn)行分析。隨著稀釋速率的增加，脂肪酸的有關(guān)產(chǎn)物改變，即在低稀釋速率，產(chǎn)生較多的丁酸和戊酸以及較少的丙酸和乙酸(表3)。在最高稀釋速率，產(chǎn)生很少量的丁酸以及稍多的醋酸和丙酸，沒有戊酸。隨稀釋速率的增加，乳酸利用如預(yù)期降低。在培養(yǎng)D＝0.75時(shí)，多于40％的乳酸轉(zhuǎn)化為VFAs，而且，盡管乳酸利用是高的，但是大比例的可利用能量被浪費(fèi)。當(dāng)CH4分批培養(yǎng)時(shí)，主要產(chǎn)生乙酸和丙酸。在分批培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的VFAs的濃度大大低于預(yù)期，僅有的解釋可能是當(dāng)乳酸耗竭時(shí)，CH4利用VFAs。
表3在多種稀釋速率的恒化器培養(yǎng)過程及分批培養(yǎng)過程中，由分離株CH4從乳酸產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸。
平板涂布法分離及篩選來自四只奶牛和兩只飼育場(chǎng)牛的9個(gè)瘤胃樣品的800多個(gè)菌落得以接種于小管內(nèi)的IRFL液體培養(yǎng)基中。孵育16小時(shí)之內(nèi)，這些菌落中的610個(gè)在培養(yǎng)基中產(chǎn)生顏色變化，即變?yōu)樽仙?。篩選分離株中的十九個(gè)以用于進(jìn)一步表征，因?yàn)樗鼈儩M足需要的規(guī)格。
所選分離株中的四個(gè)，即AW09、AW10、AW11和AW12，可以在4.5的初始pH生長(zhǎng)。其他十五個(gè)分離株均在5.0的初始pH生長(zhǎng)，那些顯示適宜的特征、即在pH5.0生長(zhǎng)最快的培養(yǎng)物被選擇，從而實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步的選擇。
所有十九個(gè)分離株抵抗10ppm濃度的離子載體莫能菌素以及拉沙里菌素，在麥芽糖和葡萄糖存在下利用乳酸，并可以在葡萄糖和麥芽糖上生長(zhǎng)。這十九個(gè)分離株均為成對(duì)或鏈狀出現(xiàn)的革蘭氏陰性球菌(±1.8微米)。
分離株的生理學(xué)特征由于在SDL培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)之后，D-和L-乳酸異構(gòu)體幾乎被完全利用，所以所有AW分離株使用D-和L-乳酸異構(gòu)體。結(jié)果顯示，分離株包括相當(dāng)統(tǒng)一的群，因此僅選擇特定的分離株以作進(jìn)一步表征。對(duì)于這些AW分離株中的五種，在pH5.8，在葡萄糖上的生長(zhǎng)速率為0.38至1.05小時(shí)-1，平均0.66小時(shí)-1(+/-0.298)。檢驗(yàn)從DL-乳酸產(chǎn)生VFA的AW分離株被發(fā)現(xiàn)以下面2∶1.5∶1∶1.3的比例產(chǎn)生乙酸、丙酸、正丁酸和正戊酸。一些這種AW分離株產(chǎn)生痕量的甲基丁酸酯。對(duì)此九個(gè)分離株獲得的最大生物量產(chǎn)出速率在0.31至0.43克(升.小時(shí))-1范圍內(nèi)。AW15具有最高的生物量產(chǎn)出速率，CH4和AW01以0.39克(升.小時(shí))-1居于其次。對(duì)此九個(gè)分離株，利用每克乳酸產(chǎn)生的細(xì)胞干物質(zhì)在0.1至0.17范圍內(nèi)。
分離株的假設(shè)性鑒定對(duì)獲得的分離株進(jìn)行假設(shè)性鑒定，符合埃氏巨球形菌株形態(tài)學(xué)分類者得以用于進(jìn)一步表征。
使用綿羊評(píng)價(jià)分離株CH4預(yù)防瘤胃乳酸蓄積能力的試驗(yàn)首次綿羊試驗(yàn)結(jié)果顯示于表4中。
表4突然飼喂精飼料、同時(shí)瘤胃內(nèi)給以CH4(治療組)或安慰劑(對(duì)照組)的粗飼料喂養(yǎng)綿羊瘤胃液中的乳酸濃度。
第二次綿羊試驗(yàn)結(jié)果顯示于表5中。
表5突然改變?yōu)榫暳巷嬍?無限制)、并且在首次接受精飼料飲食3小時(shí)后瘤胃內(nèi)給以CH4(處理組)或安慰劑(對(duì)照組)的粗飼料喂養(yǎng)綿羊瘤胃液中的乳酸濃度。<p>表15使用DHEA-S進(jìn)行的額外噴霧試驗(yàn)的結(jié)果
干燥噴霧器#3稍少于約4.5分鐘。將旁路收集器中的質(zhì)量與最初的溶液濃度作圖，如
圖12所示。
半定量地，從0到7.5mg/mL顯示出良好的線性，之后所收集的量開始出現(xiàn)偏離。雖然冷卻減少的溶解度也包括在10mg/mL溶液的計(jì)算中，但是對(duì)藥物和氯化鈉含量的任何濃度影響都被忽略。因此，通過噴霧液體的過飽和來形成沉淀物是有可能的。
圖12所示的數(shù)據(jù)和在噴霧后10mg/mL溶液中觀察到的一些顆粒表明，作為臨床制劑概念上的證據(jù)，最高的溶液濃度大約為7.5mg/mL。
將一氣溶膠樣品引入階式碰撞取樣器中，進(jìn)行粒度分析。沒有可檢測(cè)的與溶液濃度或噴霧器數(shù)量相關(guān)的粒度分布的傾向。所有噴霧試驗(yàn)中所獲得的平均粒度分布顯示在
圖13中。氣溶膠顆粒測(cè)量值與該噴霧器的公開/廣告結(jié)果一致(即，直徑中值～2微米)。
雖然體外試驗(yàn)證明噴霧器制劑可送遞可呼吸的DHEA-S氣溶膠，但是該制劑是不穩(wěn)定的，而且需要4-5分鐘的連續(xù)霧化。因此，穩(wěn)定的DPI制劑具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。DHEA-S二水合物被鑒定為用于DPI制劑的最穩(wěn)定的固態(tài)狀態(tài)。如果通過消除該無水形式在霧化前與水接觸而維持其穩(wěn)定性的話，無水形式也適合用噴霧器給予。
對(duì)于DHEA-S的臨床試驗(yàn)，最佳的噴霧制劑是7.5mg/mL的DHEA-S的0.12％氯化鈉溶液。不需要緩沖系統(tǒng)制劑的pH也是可以接受的。通過將鈉陽(yáng)離子濃度減到最小而使DHEA-S的水溶解度最大化。無緩沖液的最低的氯化鈉水平可實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)。這是用20mM的Cl-獲得的最高的藥物濃度，它在霧化過程中將不會(huì)產(chǎn)生沉淀。這種制劑在室溫下至少能穩(wěn)定存在1天。
雖然已結(jié)合前述優(yōu)選實(shí)施例描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解，在不偏離本發(fā)明經(jīng)書的情況下可作出各種改動(dòng)。
表6從產(chǎn)犢至產(chǎn)后80天，生物CH4對(duì)泌乳奶牛(所有母牛)生產(chǎn)力的影響。
處理1對(duì)照飲食，70％精飼料+CH4處理2對(duì)照飲食，70％精飼料-CH4處理3對(duì)照飲食，60％精飼料+CH4處理4對(duì)照飲食，60％精飼料-CH4
動(dòng)物被隨意給以粗飼料時(shí)直至其處于最終的飼育場(chǎng)飲食狀態(tài)的飲食適應(yīng)方案
所用的最終飼育場(chǎng)飲食的營(yíng)養(yǎng)素組成(以所飼喂的百分比表示)
動(dòng)物圈于飼育場(chǎng)小型實(shí)驗(yàn)圍圈中。每個(gè)處理組有7個(gè)圍圈，每個(gè)圍圈8只動(dòng)物。飼育場(chǎng)飲食每天早晨以無限制的水平喂養(yǎng)一次。所有閹牛在到達(dá)時(shí)得到處理(標(biāo)準(zhǔn)飼育場(chǎng)程序)，數(shù)日內(nèi)僅以長(zhǎng)粗飼料喂養(yǎng)，直至其給以CH4(處理組)或類似量的水(對(duì)照組)。在此期間，將200毫升CH4的培養(yǎng)基懸液作為給每只治療動(dòng)物的一次性口服浸潤(rùn)
CH4的總采食量輕微(但是不顯著)高于對(duì)照。在第3-5周期間，盡管CH4對(duì)于接受離子載體的動(dòng)物的作用沒有觀察到，但是對(duì)于沒有接受離子載體的食用牛，CH4比對(duì)照具有顯著(P＜0.05)更高的攝入(10.56 vs.10.12)。同樣是在此期間，盡管CH4對(duì)于高粗飼料飲食的動(dòng)物的作用沒有觀察到，但是對(duì)于低粗飼料飲食的食用牛，CH4比對(duì)照趨向于(P＜0.15)具有更高的攝入(10.14vs.9.80)。
表9飼育場(chǎng)中多個(gè)時(shí)期CH4處理與對(duì)照(無CH4加入)的平均日增重(每只動(dòng)物每天的公斤數(shù))。
在第3-5周的關(guān)鍵時(shí)期期間，CH4的總平均日增重(ADG)顯著高于(P＝0.04)對(duì)照處理。在1-2周期間，對(duì)于所有沒有接受CH4的動(dòng)物，低粗飼料處理比高粗飼料處理具有顯著(P＜0.05)較低的ADG(1.61vs.2.02)。然而，對(duì)于接受CH4的動(dòng)物，與高粗飼料飲食相比，在低粗飼料狀態(tài)，ADG并沒有顯著降低(1.70vs.1.83)。在第3-5周期間，對(duì)于沒有接受離子載體的動(dòng)物，CH4具有顯著(P＜0.05)高于對(duì)照的ADG(2.15vs.1.96)。
表10飼育場(chǎng)中多個(gè)時(shí)期CH4處理與對(duì)照(無CH4加入)的飼料轉(zhuǎn)換比(公斤飼料/公斤增重)。
在第3-5周期間，使用CH4處理的全部動(dòng)物具有顯著(P＝0.04)高于對(duì)照約5％的飼料轉(zhuǎn)換比(FCR)。在第1-2周期間，對(duì)于所有沒有接受CH4的動(dòng)物，低粗飼料處理具有顯著(P＝0.06)高于(較不理想)高粗飼料處理的FCR(4.42vs.3.83)。然而，對(duì)于接受CH4的動(dòng)物，與高粗飼料飲食相比，在低粗飼料狀態(tài)的FCR并非顯著較高(較不理想)(4.24對(duì)4.25)。
表11誘發(fā)(pull)并治療酸中毒和腫脹動(dòng)物的次數(shù)(包括同一動(dòng)物多次誘發(fā))及動(dòng)物數(shù)量(同一動(dòng)物的多次誘發(fā)僅記為1)。
與對(duì)照相比，僅有半數(shù)的CH4處理動(dòng)物具有酸中毒癥狀(一次或多次)。如果考慮酸中毒事件的總數(shù)，可以觀察到同樣的趨勢(shì)。很清楚，酸中毒在低粗飼料飲食更為普遍，以及CH4處理在低粗飼料飲食減輕了此問題。
以16SrRNA基因序列為基礎(chǔ)，使用系統(tǒng)發(fā)生學(xué)鑒定分離株。
比較測(cè)序結(jié)果顯示，代表更大表型同源群體的我們的分離株在97至99％相似性之間(表12)。表13概述了適于將新近兩個(gè)埃氏巨球形菌分離株及ATCC菌株彼此區(qū)分的標(biāo)簽核苷酸位點(diǎn)。插入和缺失占四個(gè)菌株之間核苷酸差異的22％。菌株間主要的核苷酸序列差異出現(xiàn)于核苷酸位點(diǎn)529-536以及1105-1120(表13)。不同埃氏巨球形菌株之間表現(xiàn)出的高度序列相似性也與其相似的表型特征一致(Wiederhold，1994)，表型特征此外還通過菌株間緊密的系統(tǒng)發(fā)生聚類得到反映。埃氏巨球形菌種菌株與蠟形巨球形菌僅具有91至92％的序列相似性，這兩個(gè)種在系統(tǒng)發(fā)生樹中形成截然不同的簇。埃氏巨球形菌簇分叉為從同一祖先分類學(xué)單元(ATU)進(jìn)化而來的兩個(gè)單源群。然而，蠟形巨球形菌從中進(jìn)化而來的ATU早于埃氏巨球形菌簇從中進(jìn)化而來的ATU。在埃氏巨球形菌株與它們各自ATU’s之間的短分枝長(zhǎng)度(OTU)也顯示，它們比更深分叉的蠟形巨球形菌進(jìn)化更晚。
表12埃氏巨球形菌和蠟形巨球形菌16SrDNA序列的序列相似性矩陣。序列相似性值以對(duì)合計(jì)1388個(gè)明確排列的核苷酸位點(diǎn)的比較為基礎(chǔ)。％G+C僅指分別比對(duì)的16SrDNA序列。
表13定義不同埃氏巨球形菌分離株和菌株的序列標(biāo)簽。
a大腸桿菌編碼系統(tǒng)(Brosius等，1978)。b表示模式菌株。星號(hào)表示在比對(duì)中作為各個(gè)分離株和菌株序列任意位點(diǎn)發(fā)生核苷酸缺失或插入的結(jié)果而在比對(duì)中引入缺口的地方。
最大似然法(Felsenstein，1981)用于從包括在比對(duì)圖中的序列來推斷系統(tǒng)發(fā)生樹，最大似然法包括尋找為產(chǎn)生觀察到的序列數(shù)據(jù)提供最大可能性的樹(圖3)。，最大似然法因?yàn)樵试S進(jìn)化速率在不同譜系之間具有差別，從而具有超過傳統(tǒng)的簡(jiǎn)約法的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于簡(jiǎn)約法來說，如果不同譜系以不等的速率進(jìn)化，它會(huì)導(dǎo)致推斷出錯(cuò)誤的樹(Felsenstein，1981)。由于樹拓?fù)鋵W(xué)也受到所使用的生物數(shù)量和選擇外部參考物種的影響(Stackebrandt和Ludwig，1994；Stackebrandt和Rainey，1995)，因此出現(xiàn)在瘤胃中的許多顯然相關(guān)和顯然不相關(guān)的生物被包括在比對(duì)圖中。此圖隨后用于構(gòu)建樹。盡管系統(tǒng)發(fā)生樹僅僅推斷自幾乎完整(92％)的16SrRNA基因序列，這會(huì)降低非常密切相關(guān)的生物之間的分辨率(Utaker等，1995；Li和Graur，1991)，但是得自完整或部分序列的樹的總體拓?fù)鋵W(xué)顯示彼此完全一致(VanCamp等，1993，Vandamme等，1996)。
Vandammr等人(1996)提議，如果共有多于97％rRNA序列同源性、表現(xiàn)出表型一致性并且展示顯著程度的DNADNA雜交，則不同分離株應(yīng)該作為同一種的成員。盡管生物體間DNA相似性與16S rRNA序列同源性之間的關(guān)系不是線性的，F(xiàn)ox等人(1992)提議，有效的16S rRNA序列一致性應(yīng)該意味著兩種生物為同一種的成員，因?yàn)檫@幾乎已由DNADNA雜交證實(shí)。盡管16SrRNA序列數(shù)據(jù)單獨(dú)可能不足以在各種情況下定義物種，但一旦有關(guān)種在16SrRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中得到描述，它在確定一個(gè)菌株可能屬于哪個(gè)種時(shí)是極為有用的。含有幾乎一致的16SrRNA序列的種應(yīng)該指派入同一“rRNA超種(superspecies)”或“rRNA種復(fù)合物(rRNA species complex)”。因此，應(yīng)當(dāng)理解，將分離株CH4和CH7(表型上假設(shè)為埃氏巨球形菌株)指派為同一rRNA種復(fù)合物，此復(fù)合物包括參考菌株ATCC25940(該種的模式菌株)和ATCC 17752。由于分離株各自的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系此外還與其表型特征一致，因此這些分離株可以認(rèn)為是埃氏巨球形菌種的菌株。蠟形巨球形菌與埃氏巨球形菌共有僅92％的16SrDNA序列同源性的事實(shí)，以及基因型和表型數(shù)據(jù)，都證實(shí)了該屬分隔為兩個(gè)分解良好的種。
本研究包括的瘤胃細(xì)菌中，與埃氏巨球形菌關(guān)系最接近的是反芻月形單胞菌和卵形奎因氏菌。埃氏巨球形菌與反芻月形單胞菌之間明顯的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系與此兩物種共有的一些表型和基因型特征一致，例如相似的DNA G+C含量(53-54％)、厭氧性、相似范圍底物的化學(xué)有機(jī)營(yíng)養(yǎng)新陳代謝和利用(Stackebrandt等人，1985；Stewart和Bryant，1988；Haikara，1992)。將寡核苷酸分類技術(shù)(oligonucleotidecataloguing technique)應(yīng)用于種間系統(tǒng)發(fā)生推斷中的Stackebrandt等人的工作支持這種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系(1985)。另一方面，反芻月形單胞菌也與相對(duì)未知的卵形奎因氏菌關(guān)系密切，卵形奎因氏菌是在以高糖飲食飼養(yǎng)動(dòng)物時(shí)在瘤胃中增殖的生物。盡管尚未建立培養(yǎng)，這些生物與發(fā)現(xiàn)于綿羊中的較大的Selenomonads共有一些生理學(xué)特征(Stewart and Bryant，1988)。如預(yù)期，出現(xiàn)在瘤胃中的巨球形菌的最遠(yuǎn)的親緣是包括在古產(chǎn)烷生物簇中、被認(rèn)為出現(xiàn)在約6至8億年前的生物(van Soest，1994；Woese，1987)。這些生物的進(jìn)化速率也比細(xì)菌慢，這一類的原始性也通過深度分枝的產(chǎn)烷生物簇得以明確反映。
不同埃氏巨球形菌株近來的分枝可以歸結(jié)于其為了適應(yīng)瘤胃中高選擇性條件而對(duì)表型進(jìn)行的精修(refinement)。依照Woese的觀點(diǎn)(1987)，生物表型的進(jìn)化是為了在特定小生境中生存而獲得新的或者更有效特性的過程。精修將導(dǎo)致生物成為代謝多樣的，巨球形菌的情況就是這樣。另一方面，相比較而言，進(jìn)化較慢的產(chǎn)烷生物是代謝作用單一的。
本研究證明了16SrDNA序列對(duì)區(qū)別埃氏巨球形菌密切相關(guān)菌株的適用性。此外，本研究提供用于鑒定表型已得到表征的新近分離菌株的系統(tǒng)發(fā)生框架。作為為瘤胃生態(tài)學(xué)研究而設(shè)計(jì)的種和株特異性探針的基礎(chǔ)，該框架將具有特別的價(jià)值。
結(jié)論分離在IRFL培養(yǎng)基中引入溴甲酚紫來促進(jìn)乳酸利用細(xì)菌的檢測(cè)，在本研究的主要目的即生長(zhǎng)較快的乳酸利用者這種情況下，被證實(shí)是成功的。在孵育的早期階段，這些乳酸利用細(xì)菌產(chǎn)生與菌落同心的紫色環(huán)帶，與瓊脂培養(yǎng)基的淡黃色背景形成明顯對(duì)比。但是，在長(zhǎng)期培養(yǎng)中，圍繞菌落的pH梯度由于離子擴(kuò)散而消散，整個(gè)背景變紫。區(qū)別生長(zhǎng)較慢的乳酸利用者的菌落與出現(xiàn)于瘤胃液補(bǔ)充當(dāng)中、以其它碳源生長(zhǎng)的生物菌落之間的區(qū)別于是變得困難。
埃氏巨球形菌并非高精飼料飲食動(dòng)物的主要乳酸利用物種(Mackie等，1978；Mackie和Gilchrist，1979；Mackie等人，1984；van Gylswyk，1990)，但是它們?cè)谶x擇和篩選程序中具有優(yōu)勢(shì)有許多理由。
一些篩選的菌落含有Selenomonads和其他形態(tài)型。因?yàn)闆]有可以在可溶性糖存在下利用乳酸的陽(yáng)性指征，這些菌落大多未被選擇。Russell和Baldwin(1978)指出，在多底物培養(yǎng)基中，埃氏巨球形菌B159利用葡萄糖、麥芽糖和乳酸，但是不能同時(shí)利用蔗糖。Marounek等人(1989)表明，對(duì)于四種埃氏巨球形菌株，在具有葡萄糖和乳酸兩種碳源的培養(yǎng)基中，乳酸比葡萄糖更迅速的得到利用。
其他一些實(shí)驗(yàn)室，研究使用乳酸利用生物接種高精飼料飲食狀態(tài)的反芻動(dòng)物來預(yù)防乳酸蓄積的可能性，也使用埃氏巨球形菌株工作(Das，1979；Leedle等人，1991；Robinson等人，1992；Kung和Hession，1995；Wiryawan和Brooker，1995)。因?yàn)樵谖墨I(xiàn)中沒有提供結(jié)果，所以不可能將AW和CH分離株的生長(zhǎng)速率與文獻(xiàn)中的菌株比較，來確定是否它們具有更快的生長(zhǎng)速率或是否它們更耐受酸。然而，AW和CH分離株可以與模式菌株埃氏巨球形菌ATCC25940比較。
對(duì)于AW分離株，用于測(cè)定生長(zhǎng)的pH值范圍不足以測(cè)定分離株的pH范圍或者生長(zhǎng)的最優(yōu)pH范圍。然而，由于在pH 4.5于IRFL平板上沒有生長(zhǎng)，可以假設(shè)對(duì)于除了這四種之外的所有分離株，最適宜pH在pH5.7之上，最低pH將位于pH4.5和pH4.9之間。這與實(shí)施于模式菌株埃氏巨球形菌ATCC 25940的工作一致。模式菌株埃氏巨球形菌ATCC 25940的pH范圍為pH4.6至7.8，對(duì)生長(zhǎng)最適宜為pH6.05(Therion等人，1982)。
對(duì)于CH分離株，最優(yōu)生長(zhǎng)pH在pH 5至6之間。在測(cè)試的pH值范圍內(nèi)，最高生長(zhǎng)速率發(fā)現(xiàn)于pH 5.5。在SDL培養(yǎng)基上，兩批分離株都比模式菌株具有更高的生長(zhǎng)速率。在SDL培養(yǎng)基中獲得的埃氏巨球形菌ATCC 25940的生長(zhǎng)速率可以同早期研究者在乳酸培養(yǎng)基上獲得的生長(zhǎng)速率相比擬(Therion等人，1982)
分離株在乳酸上的生長(zhǎng)速率高于在葡萄糖和麥芽糖上。這與以前對(duì)埃氏巨球形菌ATCC 25940的研究一致，在該研究中，在乳酸培養(yǎng)基上，pH 5.0和pH 6.5之間的生長(zhǎng)速率被發(fā)現(xiàn)高于葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率(Therion等人，1982)。此范圍之外，在葡萄糖上的生長(zhǎng)速率較高。一個(gè)關(guān)于瘤胃細(xì)菌底物偏愛的研究報(bào)告指出，埃氏巨球形菌B159在乳酸上的生長(zhǎng)速率比在葡萄糖和麥芽糖上慢，然而該研究中培養(yǎng)基的pH在pH 6.5之上，介于6.75和6.9之間(Russell和Baldwin，1978)。
對(duì)在乳酸培養(yǎng)基上四種埃氏巨球形菌株(包括模式菌株LC1或ATCC 25940)的發(fā)酵終產(chǎn)物的組成進(jìn)行了測(cè)定(Marounek等人，1989)。這些結(jié)果顯示形成的脂肪酸比例在菌株間具有差異。三種菌株產(chǎn)生很少或不產(chǎn)生戊酸，而埃氏巨球形菌L8終產(chǎn)物的22mol％為戊酸(Marounek等人，1989)。本研究中測(cè)試的九種AW分離株沒有展示像Marounek等人(1989)所測(cè)試菌株那樣多的菌株間差異性，但是與分離自牛奶飲食狀態(tài)的小牛瘤胃的埃氏巨球形菌L8相似，因?yàn)槠湟伯a(chǎn)生戊酸。然而，CH4與模式菌株產(chǎn)生相同的發(fā)酵終產(chǎn)物。
從最大生物量產(chǎn)出速率角度而言，在SDL培養(yǎng)基中，菌株AW15將成為為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞的選擇，其次為CH4和AW01。在5升工作體積的恒化器中，在SDL培養(yǎng)基上產(chǎn)生干物質(zhì)100克的細(xì)胞所需要的時(shí)間，AW15為1.9天，CH4和AW01為2.1天。
與埃氏巨球形菌模式菌株相比，所選分離株在乳酸上的生長(zhǎng)速率是高的。分離株是酸耐受的，可以在低于5.0的pH值生長(zhǎng)。它們抵抗一般添加于飼育場(chǎng)飲食中的離子載體，并且即使在葡萄糖和麥芽糖存在下，也可利用乳酸的兩種異構(gòu)體。乳酸的發(fā)酵終產(chǎn)物為VFA，VFA是反芻動(dòng)物的重要能量來源。由于丙酸是反芻動(dòng)物組織葡萄糖的主要來源，因此丙酸產(chǎn)物在飼育場(chǎng)工業(yè)中尤其重要。分離株因此具有抗擊反芻動(dòng)物乳酸中毒癥的有效產(chǎn)品所要求的特征。
使用不含任何瘤胃液的培養(yǎng)基成功地培養(yǎng)了乳酸利用者。對(duì)最初培養(yǎng)基僅有的改良是增加維生素含量以及向培養(yǎng)基中添加酵母提取物。當(dāng)作為工作培養(yǎng)物時(shí)，細(xì)菌在此培養(yǎng)基上于4℃生存非常良好達(dá)20天。
使用pH助恒器富集瘤胃乳酸利用細(xì)菌的技術(shù)是非常成功的，富集的瘤胃乳酸利用細(xì)菌具有預(yù)先確定的生物化學(xué)/生理學(xué)屬性的組合，將使它們潛在的高度適合于預(yù)防和抗擊飼育場(chǎng)動(dòng)物乳酸中毒癥。在大多數(shù)情況下，快速生長(zhǎng)、形態(tài)均一的群體將在運(yùn)行開始后兩天內(nèi)建立于發(fā)酵罐中。經(jīng)平板涂布法對(duì)分離自發(fā)酵罐內(nèi)容物中的培養(yǎng)物的后續(xù)測(cè)試證實(shí)，培養(yǎng)物擁有所要求的特征組合。
來自富集物的分離株的假設(shè)性鑒定顯示除了一個(gè)之外，所有分離株均屬于埃氏巨球形菌種。
分離株CH4在高產(chǎn)奶牛中的評(píng)價(jià)大部分的相關(guān)生產(chǎn)數(shù)據(jù)呈現(xiàn)于表6和7中。分別對(duì)所有母牛(15/處理)和高產(chǎn)者(10/處理)獨(dú)自分析數(shù)據(jù)。
當(dāng)母牛被飼以70％精飼料飲食并給以生物CH4時(shí)，干物質(zhì)攝入沒有差別，但是奶產(chǎn)量從35.9升至39.3公斤/天，即以3.4公斤/天的水平顯著增加(p＝0.06)。當(dāng)所有給予微生物的母牛與所有沒有給予微生物的母牛比較時(shí)，奶產(chǎn)量趨向于增加(P＝0.13)。當(dāng)接受高精飼料飲食的高產(chǎn)母牛被給以生物CH4時(shí)，體重和狀況分值增加(P＝0.02)。接受60％精飼料飲食和給予微生物的母牛引起乳脂百分比的顯著升高(P＝0.06)，并具有牛奶蛋白質(zhì)升高的趨勢(shì)(P＝0.11)。乳成分在當(dāng)前乳報(bào)酬體系(milk payment scheme)中扮演著重要角色。
將生物CH4給予母牛，顯著增加了奶產(chǎn)量，并對(duì)乳組成、體重和身體狀況分值起到積極作用。干物質(zhì)攝入未受影響；因此結(jié)果提示，將生物CH4給以母牛，促成了更有利的、導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)素利用改善的瘤胃環(huán)境。
飼育場(chǎng)動(dòng)物試驗(yàn)與對(duì)照相比，經(jīng)CH4處理的動(dòng)物在飼育場(chǎng)關(guān)鍵時(shí)期(第3-5周)期間，平均日增重(ADG)和飼料轉(zhuǎn)化比(FCR)具有顯著改善，并且消化紊亂全面降低，這些顯示以CH4處理飼育場(chǎng)動(dòng)物在以下方面有效● 如本實(shí)驗(yàn)所固有的，它幫助從粗飼料到精飼料飲食的適應(yīng)。在早期適應(yīng)階段，與高粗飼料飲食相比，CH4還減輕了低粗飼料飲食較差的性能。
● 這里用于CH4的本申請(qǐng)方法有效的允許其按照意圖表現(xiàn)。
● 在酸中毒最可能出現(xiàn)的關(guān)鍵飼育場(chǎng)期，正如由觀察到較少的酸中毒病例而直接證實(shí)、以及由改善的性能所間接證實(shí)的，CH4的使用有效預(yù)防了酸中毒。這些都在酸中毒高風(fēng)險(xiǎn)飲食及飲食方案中(尤其是在早期飼育場(chǎng)階段)觀察到，并且在沒有使用離子載體時(shí)更為明顯。
● 正如CH4較對(duì)照而言導(dǎo)致酸中毒病例的急劇下降所證實(shí)，CH4可以作為獸醫(yī)學(xué)試劑使用，來幫助預(yù)防和/或治療酸中毒。
● CH4可以用于改善飼育場(chǎng)性能，包括生長(zhǎng)速率(也指縮短育肥所需要的時(shí)間)和飼料轉(zhuǎn)化效率。
● CH4可以用于允許用較高精飼料飲食的飼養(yǎng)，即使用較少粗飼料，并增加從高粗飼料飲食至高精飼料飲食的改變的速率，也即使用較少粗飼料。在早期飼育場(chǎng)期的觀察對(duì)此給以進(jìn)一步直持，即，與高粗飼料飲食相比，添加CH4時(shí)，低粗飼料飲食的負(fù)面影響大幅降低。
本發(fā)明人另外發(fā)現(xiàn)，與已知的埃氏巨球形菌相比，埃氏巨球形菌CH4株是-在高精飼料飲食動(dòng)物瘤胃中高度活躍并適于增殖；-可以在低于pH5.0、低至4.5的相對(duì)低pH值增殖，這些pH值是急性酸中毒的特征；-抵抗通常添加于飼育場(chǎng)飲食中的離子載體抗生素；以及-即使在可溶性碳水化合物例如葡萄糖和麥芽糖存在下，也優(yōu)先利用乳酸作為碳源。
本菌株進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是其-具有相對(duì)高的生長(zhǎng)速率，即高于0.938小時(shí)-1；-具有在還原糖和乳酸上生長(zhǎng)的能力；-具有相對(duì)高的生物量產(chǎn)出率，即高于0.39克(升·小時(shí))-1；-是離子載體抗性的；-主要產(chǎn)生醋酸，而不是主要為丙酸和丁酸；以及-具有獨(dú)特的16S rRNA序列，因此是一個(gè)新菌株。
本申請(qǐng)人還另外發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物被直接飼入瘤胃的麥芽糖所挑戰(zhàn)、或者突然從粗飼料改變?yōu)楦呔暳巷嬍车那闆r下，當(dāng)以CH4接種時(shí)，在瘤胃內(nèi)不產(chǎn)生可測(cè)量的乳酸增加。
此外，以CH4接種的高產(chǎn)奶牛比沒有以CH4接種的對(duì)照動(dòng)物多出2.4至3.2升的奶產(chǎn)量。接種母牛的身體狀況分值和體重在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于對(duì)照動(dòng)物。
應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的微生物及其用途進(jìn)行細(xì)節(jié)上的改變，而不背離所附的權(quán)利要求的范圍。
參考文獻(xiàn)1.Abdo，K.M.& Cahilly，G.M.(1974). Ruminant feed additiveand method of preparing the same.United States Patent3857971，1-30.
2.Allison，M.J.，Bucklin，J.A.& Dougherty，R.W.(1964).Ruminal changes after overfeeding with wheat and the effect ofintraruminal inoculation on adaptation to a ration containingwheat.J Anim Sci 23，1164-1170.
3.Braun，U.，Rihs，T.& Schefer，U.(1992). Ruminal lacticacidosis in sheep and goats. Veterinary Record 130，343-349.
4.Das，N.K.(1979). Ruminant feed additive. United StatesPatent 4138498，1-14.
5.Dawson，K.A.& Allison，M.J.(1988).Digestive disordersand nutritional toxicity.In The rumen microbial ecosystem，pp.445-459. Edited by P.N.Hobson.LondonElsevier AppliedScience.
6.Gray，W.M.(1978).Microbial interactions in definedcontinuous culture systems effecting anaerobic cellulosedegradation，PhD thesisClemson University.
7.Hession，A.O.& Kung，L.，Jr.(1992).Altering rumenfermentation by microbial inoculation with lactate-utilisingmicroorganisms.J.Anim Sci 70，311.(摘要)
8.Jannasch，H.W.，1977. Growth kinetics of aquatic bacteria.InAquatic Microbiology. Skinner，F(xiàn).A.& Shewan，J.M.(Eds)，Academic Press，London，55-57.
9.Kung，L.，Jr.& Hession，A.O.(1995).Preventing in vitrolactate accumulation in ruminal fermentations by inoculationwith Megasphaera elsdenii.J.Anim Sci73，250-256.
10.Krieg.R.，1981. Enrichment and isolation. InManual ofMethods for General Bacteriology. Gerhardt，P.(Ed.)，AmericanSociety for Microbiology，Washington，112-114.
11.Lederberg，J.& Lederberg，E.M.(1952).Replica platingand indirect selection of bacterial mutants.J Bact 63，399-406.
12. Leedle，J.A.Z.，Greening，R.C.& Smolenski，W.J.(1991).Ruminal bacterium for preventing lactic acidosis.International Application NoPCT/US91/00857 1-41.
13.Mackie，R.I.，Gilchrist，F(xiàn).M.C.，Robberts，A.M.，Hannah，P.E.& Schwartz，H.M.(1978).Microbiological and chemicalchanges in the rumen during the stepwise adaptation of sheepto high concentrate diets.J agric Sci，Camb 90，241-242.
14.Mackie，R.I.，Gilchrist，F(xiàn).M.C.& Heath，S.(1984).Anin vivo study of ruminal micro-organisms influencing lactateturnover and its contribution to volatile fatty acid production.J agric Sci，Camb 103，37-51.
15.Mackie，R.I.& Gilchrist，F(xiàn).M.C.(1979). Changes inlactate-producing and lactate-utilising bacteria in relationto pH in the rumen of sheep during stepwise adaptation to ahigh-concentrate diet. Appl Environ Microbiol 38，422-43016.Mackie，R.I.& Heath，S.(1979).Enumeration and isolationof lactate-utilising bacteria from the rumen of sheep.ApplEnviron Microbiol 38，416-421.
17.Marounek，M.，F(xiàn)liegrova，K.& Bartos，S.(1989).Metabolismand some characteristics ofruminal strains of Megasphaeraelsdenii.Appl Environ Microbiol 55，1570-1573.
18.Olumeyan，D. B.，Nagaraja，T.G.，Miller，G.W.，F(xiàn)rey，R.A.& Boyer，J.E.(1986).Rumenmicrobial changes in cattlefed diets with or without salinomycin.Appl Environ Microbiol51，340-345.
19.PIRT，S.J.，1975.Principles of Microbe and CellCultivation.Blackwell Scientific Publications，Oxford，41-210.
20.Pryce，(1969).A modification of the Barker-Summersonmethod for the determination of lactic acid. Analyst 94，1151.
21.Robinson，J.A.，Smolenski，W.J.，Greening，R.C.，Ogilvie，M.L.，Bell，R.L.，Barsuhn，K.& Peters，J.P.(1992).Preventionof acute acidosis and enhancement of feed intake in the bovineby Megasphaera elsdenii 407A.J Anim Sci 70，310.(Abstract)22.Rogosa，M.(1984).Anaerobic Gram-negative cocci.InBergey＇s manual of systematic bacteriology Volume 1，pp.680-685. Edited by N.R.Krieg & J.G.Holt.Baltimore/LondonWilliams & Wilkins.
23.Russell，J.B.& Baldwin，R.L.(1978).Substratepreferences in rumen bacteriaevidence of ccataboliteregulatory mechanisms. Appl Environ Microbiol 36，319-329.
24.Slyter，L.L.(1976).Influence of acidosis on rumenfunction.J Anim Sci 43，910-929.
25.Stewart，C.S.& Bryant，M.P.(1988).The rumen bacteria.In The rumen microbial ecosystem，pp.21-75.Edited by P.N.Hobson.LondonElsevier Applied Science.
26.Therion，J.J.，Kistner，A.&Kornelius，J.H.(1982).Effectof pH on growth rates of rumen amylolytic and lactilyticbacteria.Appl Environ Microbiol 44，428-434.
27.VanGylswyk，N.O.(1990).Enumeration and presumptiveidentification of some functional groups of bacteria in therumen of dairy cows fed grass silage-based diets.FEMS MicrobiolEcol 73，243-254.
28.Veldkamp，H.1970.Enrichment cultures of prokaryoticorganisms.InMethods in Microbiology，Vol.3A，Norris，J.R.& Ribbons，D.W.(Eds)，Academic Press，London，305-361.
29.Wilker，B.L.，Paege，L.M.& Baker，E.(1971).Bacterialculture for facilitating dietary adaptation of ruminants.Patent Office，London 1251483，1-13.
30.Wiryawan，K.G.& Brooker，J.D.(1995).Probiotic controlof lactate accumulation in acutely grain-fed sheep.Aust J AgricRes 46，1555-1568.
31.DAWSON，J.A.1995.The use of yeast strain 8417 inmanipulating ruminant high concentrate diets.Proc.56thMinnesota Nutr.Conf.&Alltech Inc.Technical Symposium.September18-20，Bloomington，MN.
32.DONOVAN，J.1997.Subacute acidosis is costing no millions.Hoards Dairyman，September 25 p.666.
33.HALL，M.B.1999.Management strategies againstruminalacidosis.Proc.Florida Ruminant Nutr.Symp.Univ.Florida，Gainesville，F(xiàn)L.
34.HUTJENS，M.F.1995.Feeding applications for the highproducing cow.Cornell Nutr.Conf.October 24-26.Dept.Anim.Sci.，Cornell Univ.，Ithaca，NY.
35.HUTJENS，M.F.1999.How and when feed additives may or maynot pay，Hoards，Dairy man，Sept 25，1999.
36.KELLY，E.R.& LEAVER，J.D.1990.Lameness in dairy cattleand the type of concentrates given.Anim.Prod.51221.
37.KUNG，L.2000.Direct fed microbial for dairy cows.Proc.Florida Ruminant Nutr.Symp.Univ.Florida，Gainesville，F(xiàn)L.
38.KUNG，L.& HESSION，O.A.1995.Altering rumen fermentationby microbial inoculation with lactate utilisingmicro-organisms.J.Anim.Sci.73250.
39.MANSON，R.J.& LEAVER，J.D.1988.The influence ofconcentrate amount on locomotion and clinical lameness in dairycattle.Anim.Prod.47-185.
40.McDANIEL，B.T.& WILK，J.C.1989.Lameness in dairy cattle.Proc.Southwest Nutr.Mgmt，Conf.，F(xiàn)ebruary 2-3，Dept.Anim.Sci.，Univ.Arizona，Tucson，AZ.
41.NOCEK，J.E.1995.Energy metabolism and rumen acidosis.Proc.Tri-state Dairy Dutr.Conf.，May 23-24.Indiana Univ.，F(xiàn)ort Wayne，IN.
42.NOCEK，H.E.1997.Bovine acidosis.Implications onlaminitis.J.Dairy Sci 801005.
43.NORDLUND，K.V.1995.Questions and answers regardingrumenocentesis and the diagnosis of herd based sub-acute rumenacidosis.Proc.4-State Applied Nutr.Conf.，August 2-3，Univ.Wisconsin，Extension，Madison，W1.
44.NORDLUND，K.V.，GARRET，E.F.& OETZEL，G.R.1995.Herdbased rumenocentesisA clinical approach to the diagnosis ofsubacute rumen acidosis.The Compendium Food Animal，August1995，p.48.
45.OETZEL，G.R.& SMITH，R.A.2000.Clinical aspects ofruminal acidosis in dairy cattle.Proc.33rd.Conf.AmericanAssoc.Boy.Pract.，Rapid City，SD.Sept 21-23.
46.OWENS，F(xiàn).N.，SECRIST，D.，HILL，J.& GILL，D.1996.A newlook at acidosis.Proc.Southwest Nutr.Conf.，F(xiàn)eb 1，Phoenix，AZ.
47.VOGEL，G.J.& PARROT，C.1994.Mortality survey in feedyardsThe incidence of death from digestive，respiratory and othercauses in feedyards on the great plains.The Compendium February1994Food Animal，p.227.
48.ROBINSON，J.A.，SMOLENSKI，W.J.，GREENING，R.C.，OGILVIE，R.L.，BELL，R.L.，BARSUHN，K.& PETERS，J.P.1992.Preventionof acute acidosis and enhancement of feed intake in the bovineby Megasphaeraelsdenii 407A.J.Anim Sci.(Suppl.1)310(Abstr)系統(tǒng)發(fā)生學(xué)49.Ausubel，F(xiàn).M.，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.G.Seidman，and K.Struhl.1987.Current Protocolsin Molecular Biology.Vol 1 and 2.John Wiley and Sons，New York，50.Brosius，J.，M.L.Palmer，P.J.Kennedy and H.F.Noller.1978.Complete nucleotide sequence of the 16Sribosomal RNA genefrom E.coli.Proc.Natl.Acad.Sci.754801-4805.
51.Dorsch，M.and E.Stackebrandt.1992.Some modificationsin the procedure of direct sequencing of PCR amplified 16SrDNA.J.Microbiol.Methods.16271-279.
52.Elsden，S.R.and D.Lewis.1953.The production of fattyacids by a gram- negative coccus.Biochem.J.55183-189.
53.ELsden，S.R.，B.E.Volcani，F(xiàn).M.C.Gilchrist and D.Lewis.1956.Properties of a fatty acid forming organismisolated from the rumen of sheep.J.Bacteriol.72681-689.
54.Engelmann，U.and N.Weis.1985.Megasphaeracerevisiae sp.nov.A new Gram-negative obligately anaerobic coccus isolatedfrom spoiled beer.Syst.Appl.Microbiol.6287-290.
55.Felsenstein，J.1981.Evolutionary trees from DNA sequencesa maximum likelihood approach.J.Mol.Evol.17368-376.
56.Fox，G.E.，J.D.Wisotzkey and P.Jurtshuk，Jr.1992.Howclose is close16SrRNA sequence identity may not be sufficientto guarantee species identity.Int.J.Syst.Bacteriol.42166-170.
57.*Genetics Computer Group.1991.Program manual for the GCGpackage，version 7.Madison，Wisconsin，USA.
58.Gutierrez，J.，R.E.Davis，I.L.Lindahl andE.J.Warwick.1959.Bacterial changes in the rumen during the onset offeed-lot bloat of cattle and characteristicsofPeptostreptococcus elsdenii n.sp.Appl.Microbiol.716-22.
59.Haikara，A.1992.The genera Pectinatus and Megasphaera，p.1993-2004.In A.Barlows，H.Trooper，M.Dworkin，W.Harderand K.-H.Schleifer(ed)，The prokaryotes.A handbook on thebiology of bacteriaecophysiology，isolation，identification，application，2nd ed.，volψψSpringer Verlag，New York.
60.Hutson，R.A.，D.E.Thompson，and M.D.Colins.1993.Generic interrelationships of saccharolytic Clostridiumbotulinum types B，E and F and related clostridia as revealedby small-subunitrRNA gene sequences.FEMS Microbiol.Lett.108103-110.
61.Lane，D.J.，B.Pace，G.J.Olsen，D.A.Stahl，M.L.Sogin，and N.R.Pace.1985.Rapid determination of 16S ribosomal RNAsequences for phylogenetic analyses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.826955-6959.
62.Li，W.-H.，and D.Graur.1991.Fundamentals of molecularevolution.Sunderland，Massachusetts.Sinauer Associates Inc.
63.Maidak，B.L.，Olsen，G.J.，Larsen，N.，Overbeek，R.，McCaughey，M.J.and Woese，C.R.1996.The ribosomal databaseproject(RDP).Nucleic Acids Res 2482-85.
64.Olsen，G.J.，H.Matsuda，R.Hagstrom，and R.Overbeek.1994.FastDNAml-a tool for construction of phylogenetic treesof DNA sequences using maximum likelihood.CABIOS 1041-48.
65.Rogosa，M.1971.Transfer of PeptostreptococcuselsdeniiGutierrez et a/.to a new genus，Megasphaera[M.elsdenii(Gutierrezetal.)comb.nov].Int.J.Syst.Bacteriol.21187-189.
66.*Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.and Maniatis，T.1989.Molecular cloning.A laboratory manual.Second edition(Eds.Ford，N.，Nolan，C.and Ferguson，M.).Cold Spring Harbor，Laboratory Press.
67.Smith，S.1992.Genetic Data Environment，version 2.0Documentation. Harvard University & University of Illinois.
68.Stackebrandt，E.，and W.Ludwig.1994.The importance ofchoosing outgroup reference organisms in phylogeneticstudiesthe Atopobium case.Syst.Appl.Microbiol.1739-43.
69.*Stackebrandt，E.，and F.A.Rainey.1995.Partial andcomplete 16SrDNA sequences，their use in generation of 16SrDNAphylogenetic trees and their implications in molecularecological studies. Molecular Microbial Ecology Manual 3.1.11-17.Kluwer Academic Publishers，Netherlands.
70.Stackebrandt，E.，H.Pohla，R.Kroppenstedt，H.Hippe，andC.R.Woese.1985.16SrRNA analyses of Sporomusa，Selenomonas，and Megasphaeraon the phylogenetic origin of Gram-positiveEubacteria.Arch.Microbiol.143270-276.
71.Stackebrandt，E.，and O.Charfreitag.1990.Partial 16SrRNAprimary structure of five Actinomyces speciesphylogeneticimplications and development of an Actinomycesisrealii-specific oligonucleotide probe.J.Gen.Microbiol.13637-43.
72.Stewart，C.S.，and M.P.Bryant.1988.The rumen bacteria.p.21-75.In Hobson，P.N.(ed)，The rumen microbial ecosystem.，Elsevier Applied Science，London73.Sugihara，P.T.，V.L.Sutter，H.R.Attebery，K.S.Brichnell，and.S.M.Finegold.1974.IsolationofAcidominococcus fermentans and Megasphaera elsdenii fromnormal human feces. Appl. Microbiol.27274-275.
74.Utaker，J.B.，L.Bakken，Q.Q.Jiang，andI.F.Nes.1995.Phylogenetic analysis of seven new isolates ofammonia-oxidizing bacteria based on 16SrRNA gene sequences.Syst. Appl.Microbiol.18549-559.
75.Van Camp，G.，Y.Van De Peer，S.Nicolai，J.-M.Neefs，P.Vandamme，and R.De.Wachter.1993.Structure of 16S and23Sribosomal RNA genes in Campylobacter speciesphylogeneticanalysis of the genus Campylobacter and presence of internaltranscribed spacers.Syst.App.Microbiol.16361-368.
76.Vandamme，P.，B.Pot，M.Gillis，P.De Vos，K.Kersters，and J.Swings.1996.Polyphasic taxonomy，a consensus approachto bacterial systematics. Microbiol.Rev.60407-438.
77.van Soest，P.J.1994.Nutritional ecology of theruminant.2ndEdition.Comstock Publishing Associates，Ithaca.
78.Wiederhold，A.H.1994.Isolation，selection and cultivationof lactic acid-utilising rumen bacteria for the treatment ofchronic and acute acidosis.MSc.thesis.University of Natal，Pietermaritzburg.
79.Woese，C.R.1987.Bacterial evolution. Microbiol.Rev.51221-271.
權(quán)利要求
1.與保藏于英國(guó)蘇格蘭阿伯丁NCIMB的保藏號(hào)為NCIMB 41125的埃氏巨球形菌菌株具有基本相同的16S核糖體RNA序列的埃氏巨球形菌的生物純細(xì)菌培養(yǎng)物。
2.保藏于英國(guó)蘇格蘭阿伯丁NCIMB的保藏號(hào)為NCIMB 41125的埃氏巨球形菌菌株的生物純細(xì)菌培養(yǎng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的埃氏巨球形菌的生物純細(xì)菌培養(yǎng)物，其特征還在于其即使在糖存在下非常有效地利用乳酸的能力；其對(duì)離子載體的抗性；其相對(duì)高的生長(zhǎng)速率；其主要產(chǎn)生醋酸的能力；以及其在5.0以下、低至4.5的相對(duì)低pH值增殖的能力。
4.促進(jìn)反芻動(dòng)物從以粗飼料為基礎(chǔ)的飲食向以高能精飼料為基礎(chǔ)的飲食適應(yīng)的組合物，該組合物基本由根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)中的細(xì)菌培養(yǎng)物組成。
5.促進(jìn)反芻動(dòng)物從以粗飼料為基礎(chǔ)的飲食向以高能精飼料為基礎(chǔ)的飲食適應(yīng)的方法，該方法包括步驟將有效量的權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的細(xì)菌培養(yǎng)物給予所述反芻動(dòng)物的瘤胃。
6.用于反芻動(dòng)物的飼料添加劑，包含載體和有效量的權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的有效量的細(xì)菌培養(yǎng)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中的飼料添加劑，其中培養(yǎng)物置于無氧容器中。
8.用于治療瘤胃乳酸中毒癥和預(yù)防瘤胃乳酸中毒癥、瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引起的瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引起的腫脹和肝膿腫中任一種或多種的方法，包括步驟將有效量的權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的細(xì)菌培養(yǎng)物無氧給予反芻動(dòng)物的瘤胃。
9.用于治療瘤胃乳酸中毒癥和預(yù)防瘤胃乳酸中毒癥、瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引起的瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引起的腫脹和肝膿腫中任一種或多種的獸醫(yī)學(xué)試劑，包含有效量的權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的細(xì)菌培養(yǎng)物。
10.用于在反芻動(dòng)物中治療瘤胃乳酸中毒癥和預(yù)防瘤胃乳酸中毒癥、瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引起的瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引起的腫脹和肝膿腫中任一種或多種的制劑，包含根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的細(xì)菌培養(yǎng)物的接種體；以及分開的無菌厭氧生長(zhǎng)培養(yǎng)基，所述制劑的成分置于無氧容器的分隔的室中，這些室彼此無氧連接，從而可以用所述培養(yǎng)物無氧接種所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
11.在反芻動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)下面改進(jìn)中任何一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法增加的奶產(chǎn)量；改良的飼育場(chǎng)性能；提高的生長(zhǎng)速率；育肥時(shí)間的縮短；較低的消化系統(tǒng)疾病率和死亡率；較低的乳酸中毒癥及相關(guān)疾病發(fā)病率；提高的飼料轉(zhuǎn)化效率；飼料中粗飼料含量的降低；以及以相對(duì)較高精飼料飲食飼養(yǎng)的能力，所述方法包括步驟將有效量的權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的細(xì)菌培養(yǎng)物給予所述反芻動(dòng)物的瘤胃。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述培養(yǎng)物被無氧給予。
13.以比傳統(tǒng)方法更短的時(shí)間分離高等瘤胃微生物的生物純培養(yǎng)物的方法，該方法包括步驟獲得瘤胃液樣品；以及在預(yù)先選擇的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)該樣品，此方法特征在于預(yù)先選擇選自下列的多個(gè)參數(shù)以有利于高等瘤胃微生物但不利于次等瘤胃微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分、稀釋速率、pH、溫度、抗微生物試劑、氣體環(huán)境、氧化還原電位、缺少營(yíng)養(yǎng)素和攻擊生物。
14.基本如此處所描述并實(shí)施的埃氏巨球形菌的生物純細(xì)菌培養(yǎng)物。
15.基本如此處所描述并實(shí)施的組合物，該組合物促進(jìn)反芻動(dòng)物從以粗飼料為基礎(chǔ)的飲食向以高能精飼料為基礎(chǔ)的飲食的適應(yīng)。
16.基本如此處所描述并實(shí)施的方法，該方法促進(jìn)反芻動(dòng)物從以粗飼料為基礎(chǔ)的飲食向以高能精飼料為基礎(chǔ)的飲食的適應(yīng)。
17.基本如此處所描述并實(shí)施的用于反芻動(dòng)物的飼料添加劑。
18.基本如此處所描述并實(shí)施的方法，該方法用于治療瘤胃乳酸中毒癥和預(yù)防下面任何一項(xiàng)或者多項(xiàng)，即瘤胃乳酸中毒癥、瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引起的瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引起的腫脹和肝膿腫。
19.基本如此處所描述并實(shí)施的獸醫(yī)學(xué)試劑，該試劑用于治療瘤胃乳酸中毒癥和預(yù)防下面任何一項(xiàng)或者多項(xiàng)，即瘤胃乳酸中毒癥、瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引起的瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引起的腫脹和肝膿腫。
20.基本如此處所描述并實(shí)施的方法，該方法用于治療反芻動(dòng)物中瘤胃乳酸中毒癥和預(yù)防下面任何一項(xiàng)或者多項(xiàng)，即瘤胃乳酸中毒癥、瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引起的瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒癥引起的腫脹和肝膿腫。
21.基本如此處所描述和實(shí)施的在反芻動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)下面改進(jìn)之中任何一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，即增加的奶產(chǎn)量；改善的飼育場(chǎng)性能；改進(jìn)的生長(zhǎng)速率；育肥時(shí)間的縮短；較低的消化系統(tǒng)疾病和死亡率；較低的乳酸中毒癥和相關(guān)疾病的發(fā)病率；改善的飼料轉(zhuǎn)化效率；飼料中粗飼料含量的降低；以及以相對(duì)較高精飼料飲食飼養(yǎng)的能力。
22.基本如此處所描述并實(shí)施的方法，該方法以比傳統(tǒng)方法相對(duì)更短的時(shí)間分離高等瘤胃微生物的生物純培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)的新菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明此外涉及整合該菌株的制劑與方法。本發(fā)明也涉及反芻動(dòng)物飼料、以及預(yù)防和治療反芻動(dòng)物乳酸中毒癥(lactic acidosis)的制劑與方法。該發(fā)明甚至進(jìn)一步涉及在比傳統(tǒng)方法更短的時(shí)間內(nèi)分離生物學(xué)純的高等瘤胃微生物培養(yǎng)物的方法。該發(fā)明更進(jìn)一步涉及在反芻動(dòng)物達(dá)到下面改進(jìn)中任何一個(gè)或多個(gè)的方法，即增加的奶產(chǎn)量；提高的飼育場(chǎng)性能；提高的生長(zhǎng)速度；縮短的育肥時(shí)間；較低的消化系統(tǒng)疾病率和死亡率；較低的乳酸中毒癥和相關(guān)疾病發(fā)病率；提高的飼料轉(zhuǎn)換效率；飼料中粗飼料成分的降低；以及以相對(duì)高濃縮飲食飼養(yǎng)的能力。
文檔編號(hào)A23K1/00GK1681522SQ03821275
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月18日
發(fā)明者C·H·赫恩, A·克斯特那, B·J·格雷靈, A·H·史密斯 申請(qǐng)人:農(nóng)業(yè)調(diào)查委員會(huì), 凱米拉磷酸鹽業(yè)控股有限公司