專利名稱：鱘科魚類精子超低溫冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類精子冷凍保存的方法。
背景技術(shù)：
鱘科魚類為稀有珍貴水生物種，鱘科魚類精子保存關(guān)系到珍稀物種的保護(hù)，但是，目前還缺乏可用于保存鱘科魚類精子的成功方法。
現(xiàn)有技術(shù)用液氮容器保存白鰱、鳙魚、草魚、鯉魚淡水魚類精子，液氮溫度-196℃，在保存過程中，靠手工測量液氮容器內(nèi)的溫度，容易因測量誤差，造成保存效果不穩(wěn)定，同時(shí)，冷凍保存技術(shù)上沒有測出精子冷凍保存的最佳滲透壓值，冷凍精子活率不高。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種可保存鱘科魚類精子，同時(shí)具有較高活率的冷凍保存方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案配用冰點(diǎn)滲透壓計(jì)、低溫生物降溫儀與液氮容器；通過NaCl溶液的間接測定和冰點(diǎn)滲透壓計(jì)的直接測定，首先測出鱘科魚類精子本身的滲透壓值；按滲透壓值進(jìn)行精子保存液配方的配制，精子保存液采用NaCl、KCl、葡萄糖配制，NaCl的濃度為0.3～0.75％、KCl的濃度為0.02-0.1％、葡萄糖的濃度為1-1.6％；然后確定鱘科魚類精子保存的抗凍保護(hù)劑種類及濃度，采用DMSO作為抗凍劑，濃度為10～14％；通過低溫生物降溫儀直接測出液氮容器的準(zhǔn)確溫度，確立最佳的降溫溫層；將稀釋液+DMSO抗凍劑作為鱘科魚類精子低溫冷凍保護(hù)液，精子與保護(hù)液的比例按3∶1稀釋；在2～4℃的低溫下平衡處理2～3h，當(dāng)精子的滲透壓提高到最適保存值800mOsm/kg時(shí)，將精子裝入2ml的塑料離心管，通過低溫生物降溫儀，降溫至-5℃平衡10min，然后投入-160～-180℃液氮蒸汽中平衡20min，再放入-196℃液氮中保存；解凍時(shí)，將保存的精子從-196℃提升到-160～-180℃溫區(qū)平衡處理20min，然后再在38～40℃水浴中解凍。
本發(fā)明通過低溫生物降溫儀直接測出液氮容器的準(zhǔn)確溫度，避免誤差，確立-5℃→-180℃→液氮最佳的降溫溫層，達(dá)到穩(wěn)定的保存效果，并采用NaCl溶液的間接測定和冰點(diǎn)滲透壓計(jì)的直接測定，測出精子本身的滲透壓值，按滲透壓值進(jìn)行精子保存液的配制。由于本發(fā)明從準(zhǔn)確的溫度測定與最佳的降溫層的確立到精子保存液的配制均對(duì)保存效果產(chǎn)生有利精子活力的影響，不僅鱘科魚類精子冷凍精子活率達(dá)70％以上的技術(shù)效果，也可用于常規(guī)魚類精子的冷凍保存。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明配備FM-8P冰點(diǎn)滲透壓計(jì)，測鱘科魚類精子的滲透壓，例如測到史氏鱘科魚類精子的滲透壓54～56mOsm/kg，按滲透壓值進(jìn)行精子保存液的配制，精子保存液以NaCl、KCl、葡萄糖配制，可采用NaCl的濃度為0.3％、KCl的濃度為0.03％、葡萄糖的濃度為1.2％配制的保存液，或100ml溶液中含NaCl0.5g、KCl0.03g、葡萄糖1.2g的保存液；采用DMSO作為抗凍劑，濃度為12％；精子與保護(hù)液的比例按3∶1稀釋；在2～4℃的低溫下平衡處理2～3h后，將精子裝入2ml的塑料離心管，通過低溫生物降溫儀降溫；降至-5℃平衡10min，然后投入-160℃液氮蒸汽中平衡20min，再放入-196℃液氮中保存；解凍時(shí)，將保存的精子從-196℃提升到-160℃溫區(qū)平衡處理20min，然后再在38℃水浴中解凍。采用本方法魚類精子活率達(dá)70％以上。
權(quán)利要求
鱘科魚類精子超低溫冷凍保存方法配備冰點(diǎn)滲透壓計(jì)、低溫生物降溫儀與液氮容器；通過NaCl溶液的間接測定和冰點(diǎn)滲透壓計(jì)的直接測定，首先測出鱘科魚類精子的滲透壓；按測出精子本身的滲透壓值進(jìn)行精子保存液的配制，精子保存液以NaCl、KCl、葡萄糖配制，NaCl的濃度為0.3～0.75％、KCl的濃度為0.02-0.1％、葡萄糖的濃度為1-1.6％；然后確定鱘科魚類精子保存的抗凍保護(hù)劑種類及濃度，采用DMSO作為抗凍劑，濃度為10～14％；通過低溫生物降溫儀直接測出液氮容器的準(zhǔn)確溫度，確立最佳的降溫溫層；將稀釋液+DMSO抗凍劑作為鱘科魚類精子低溫冷凍保護(hù)液，精子與保護(hù)液的比例按31稀釋；在2～4℃的低溫下平衡處理2～3h，當(dāng)精子的滲透壓提高到最適保存值時(shí)，將精子裝入2ml的塑料離心管，通過低溫生物降溫儀，降至-5℃平衡10min，然后投入-160～-180℃液氮蒸汽中平衡20min，再放入液氮中保存；解凍時(shí)，將保存的精子從-196℃提升到-160～-180℃溫區(qū)平衡處理20min，然后再在38～40℃水浴中解凍。
全文摘要
鱘科魚類精子超低溫冷凍保存方法，涉及魚類精子保存方法，本發(fā)明要解決保存鱘科魚類精子有較高活率的方法。本發(fā)明配備冰點(diǎn)滲透壓計(jì)、低溫生物降溫儀與液氮容器，其特征是先測鱘科魚類精子滲透壓，按滲透壓配保存液，確定抗凍保護(hù)劑及濃度，通過低溫生物降溫儀測液氮容器準(zhǔn)確溫度，確立最佳降溫溫層，將稀釋液+DMSO作冷凍保護(hù)液，精子與保護(hù)液按3∶1稀釋，在低溫下平衡處理，當(dāng)精子滲透壓最適保存時(shí)，裝入離心管，通過低溫生物降溫儀降至－5℃C平衡10min，然后投入160～－180℃液氮蒸汽中平衡20min，再放入液氮中保存；解凍時(shí)從－196℃提升到－160～－180℃平衡處理20min，再在38～40℃水浴中解凍。本發(fā)明用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。
文檔編號(hào)A01N1/00GK1600097SQ0315126
公開日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2003年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月28日
發(fā)明者章龍珍, 莊平, 張濤, 黃曉榮, 馮廣朋 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所